Name: Doigt de zinc nucléase Gene meilleur ciblage dans embryonnaires humaines Cellules souches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Apprenez le ciblage de gènes dans les cellules souches embryonnaires humaines à l'aide de nucléases à doigts de zinc. Cette méthode permet une modification précise du locus PITX3 pour étudier le développement du SNC.

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Travaux décrits dans ce protocole a été rendue possible grâce au financement du gouvernement de Victoria dans le cadre d&#39;une alliance de collaboration avec l&#39;Institut californien pour la médecine régénérative (CIRM).

Toutes les procédures sont effectuées dans une hotte à flux laminaire stérile. Tous les milieux et solutions sont équilibrées à 37 ° C sauf indication contraire. 1 extension de CSP humaines (CSEh et hiPSCs, WA-09 utilisé dans ce protocole) pour la transfection Remarque: Il n&#39;est pas nécessaire d&#39;étendre les CSEh sur Matrigel ou Geltrex. CSEh élargis sur les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) peuvent être utilisés pour l&#39;électroporation ou nucléofection après une étape d&#39;élimination MEF (voir section 2.8). <ol><li> Préparer une boîte de 100 mm x 1 et x 75cm2 ballon de DR4 MEF à 2,0 x 10 4 cellules par cm 2 dans un milieu MEF (voir le tableau 1) sur des boîtes pré-revêtu avec 0,1% p / v de gélatine. Remarque: CF1, BLK6 ou MF1 MEF peut être utilisé, cependant, il est recommandé que les lignes MEF résistantes aux antibiotiques sont utilisés, par exemple, DR410. </li><li> Le lendemain, passage CSEh sur un plat de 100 mm pré-plaqué avec MEF préparés dans la section 1.1. Pour ce faire, aspitaux CSEh médias de cultures vaisselle, laver les CSEh avec la solution saline équilibrée de Ca2 + / Mg2 + exempt de Hanks (HBSS), ajouter Dispase (voir le tableau 2 pour des volumes appropriés) et placer dans un incubateur humidifié à 37 ° C / 5% de CO 2. Après 3-5 minutes d&#39;incubation, aspirer et laver délicatement Dispase 1 - 2 fois avec HBSS pour éliminer MEF. Ajouter des médias sur les CSEh (voir le tableau 3) et en utilisant un grattoir à cellules, ou pipette de 5 ml, gratter délicatement les colonies de la surface de la boîte de culture. </li><li> Recueillir les fragments de colonies en suspension de la boîte de culture dans un tube de 15 ml de la centrifugeuse. Boîte de culture rinçage avec les médias et le transfert dans le tube de 15 ml CSEh. Attention à ne pas casser les mottes en cellules individuelles ou de petits fragments. </li><li> Centrifuger pendant 5 minutes à 160 x g pour sédimenter les fragments de colonies. </li><li> Aspirer le surnageant. Appuyez sur le bas du tube de 15 ml avec le doigt pour desserrer colonie fragment culot. Fragments de colonies doucement remettre en suspension dans CSEh médias selon un rapport de division (de normallya divisée rapport compris entre 1: 4 et 1: 8 est approprié). Soyez extrêmement prudent de ne pas rendre touffes dans des cellules individuelles ou de petits fragments que cela affecte les plaquant efficacité. </li><li> Avant les plaquant fragments de CSEh sur MEF laver 1x avec du HBSS. Lentement, ajouter une quantité appropriée (voir le tableau 2) de la suspension cellulaire contenant des fragments de CSEh dans les médias CSEh à des plats pré-plaqué MEF. </li><li> Placez les plats de la culture sur la tablette dans l&#39;incubateur et se déplacer lentement d&#39;avant en arrière et de gauche à droite pour répartir des fragments de colonies. </li><li> Remplacez le support CSEh quotidien. </li><li> Pour préparer un milieu conditionné de MEF (MEF-CM) laver le flacon de 75 cm2 pré-plaqué avec MEF 1 x avec HBSS. Ajouter médias CSEh. Après 24 h, collecter des milieux conditionnés et les remplacer par les médias sur les CSEh frais. Répéter tous les jours pendant une durée maximale de 12 jours. Rangez MEF-CM à 4 ° C jusqu&#39;à leur utilisation. </li></ol> 2 Préparation des CES humaines pour la transfection <ol><li> Observer la croissance des CSEhtous les jours sous microscope. Lorsque les colonies deviennent 40-50% de confluence, plaque 3 x 100 mm avec des plats de 2,0 x 10 5 MEF par cm 2. </li><li> Lorsque les colonies deviennent 60 à 70% de confluence, ils sont prêts à être transfectée. colonies &quot;marié&quot; en supprimant colonies différenciées ou des noyaux de colonie. Remarque: Comme nous croyons transfection supérieur et l&#39;efficacité de ciblage se produisent lorsque les cellules sont en phase de croissance journal, il est suggéré que l&#39;électroporation être effectuée avant CSEh atteindre ≥ 70% de confluence. </li><li> Laver colonies de CSEh avec du HBSS et ajouter Accutase. Remarque: Il n&#39;est pas nécessaire CSEh à pré-traiter avec un inhibiteur de ROCK Y-27632 inhibition suffisante aura lieu lors d&#39;une incubation avec Y-27632 lors de l&#39;étape 2.7 </li><li> Incuber pendant 10 - 20 min à 37 ° C / 5% de CO2 jusqu&#39;à ce que des colonies de cellules uniques sont fournis comme on le voit sous un microscope. Broyez les cellules avec une pipette de 1 ml. </li><li> Ajouter des médias de CSEh et filtre dans un tube conique de 15 ml en utilisant un straine 40 um cellulairer pour supprimer amas de cellules. </li><li> Centrifuger à 160 g pendant 5 min. Remettre le culot cellulaire dans les médias de CSEh frais et répéter pour enlever toute solution de Accutase résiduelle. </li><li> Resuspendre les cellules dans un milieu contenant 10 uM de hESC Y-27632 et transférer la suspension cellulaire total à une boîte de 100 mm pré-enduite avec de la gélatine. </li><li> Incuber à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant au moins 30 min. </li><li> Pendant ce temps MEF va adhérer à la boîte de gélatine appliquée. Recueillir CSEh non adhérentes à l&#39;aide d&#39;une pipette de 1 ml dans un tube de 15 ml frais de centrifugeuse et déterminer la densité de cellules en utilisant un hématimètre. </li></ol> 3. électroporation des CSEh <ol><li> Médias de CM-MEF filtres en utilisant un filtre de 0,22 um et ajouter 10 ng facteur de croissance ml / des fibroblastes-2 humaine recombinante (rhFGF2). </li><li> Transférer 7,5 x 106 cellules hES de l&#39;article 2.9 à un nouveau tube de 15 ml et centrifuger conique à 160 g pendant 5 min. </li><li> Pendant ce temps, mettre en place le électroporateur: Sélectionner le programme pour ele exponentielctroporation et définir les paramètres suivants, Tension: 250 V, Capacité: 500 pF, et de la Résistance: ∞-. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension les pastilles de cellules dans 0,8 ml de glace et filtré à froid de 0,22 um HBSS. Transférer la solution dans une cuvette d&#39;électroporation de 0,4 cm stérile. </li><li> Ajouter construction de ciblage TV-hPITX3-avant (30 ug d&#39;ADN) et mélanger doucement avec une pipette 200 pi. Incuber sur de la glace pendant 5 min. Pendant ce temps, retirer une aliquote de Pitx3 ZFN ARNm et de dégivrage sur la glace. Lorsque décongelé transfert de 7,5 pi de ZFN ARNm de mélange d&#39;ADN / cellule cuvette d&#39;électroporation. Mélanger doucement avec une pipette 200 pi. Remarque: Le locus être la cible est le principal facteur qui contribue à l&#39;efficacité du ciblage. encodage de Loci gènes silencieux, les gènes ne sont pas exprimés dans les CES, comme Pitx3 sont difficiles à cibler en utilisant la recombinaison homologue classique 6. Ainsi, ce protocole utilise des conçu sur mesure ZFN pour le locus Pitx3 humaine pour induire un ADN double brin break. </li><li> Électroporation en suivant les instructions à l&#39;écran sur la électroporateur. </li><li> En utilisant une pipette de 200 ul transférer le contenu de la cuvette d&#39;électroporation à un tube de 15 ml contenant 10 ml de milieu de hESC. Lavez la cuvette deux fois avec 200 pi de milieu de CSEh à chaque fois et de transfert à un tube de 15 ml. Il y aura &quot;mucus-like&quot; débris constitué de l&#39;ADN et les protéines des cellules lysées qui auront un impact négatif survie cellulaire. Centrifuger à 160 g pendant 5 min à retirer les débris. </li><li> Aspirer le surnageant et tapotez doucement culot cellulaire pour desserrer. Re-suspendre dans 30 ml complétées MEF-CM contenant 10 uM Y-27632 et Réensemencement sur 3 x 100 mm preplated plats avec MEF. </li><li> Changer les médias tous les jours. Au jour 2, Y-27 632 peut être retiré et les cellules cultivées dans des milieux hESC seulement. </li><li> Après 2-3 jours, les CSEh devraient être 50-70% de confluence. A ce stade, commencer le choix des antibiotiques (par exemple, 0,5 pg / ml de puromycine). </li><li> Maintenir selréflexion en ajoutant médias CSEh / puromycine frais tous les jours. Après ~ 7 jours de petites colonies doivent être visibles. Si MEF résistantes aux antibiotiques ne sont pas utilisés, MEF peut être complété par l&#39;ajout d&#39;une des cellules supplémentaires 1.0 x 10 4 par cm 2. </li></ol> 4. Cueillette clones transgéniques CSEh <ol><li> Environ 14 à 21 jours après la sélection (lorsque les colonies ont atteint un diamètre ~ 1 mm) préparent plaques d&#39;expansion et de dépistage. Commencer par décongélation d&#39;une partie aliquote de Matrigel ou Geltrex à 4 ° C pendant un minimum de 5 heures. Diluer selon les instructions du fabricant et ajouter 75 ul dans chaque puits de plaques 3 x 96 puits. Préparer des plaques 3 x 48 puits par placage MEF à 2,0 x 10 4 cellules par cm 2. Incuber les plaques O / N à 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Le jour suivant disséquer colonies en morceaux de 16 à 25 en utilisant une aiguille 21 G, sur la pointe d&#39;une pipette de 2 ml par découpe d&#39;une grille. </li><li> Aspirer Matrigel de plaques à 96 puits et la remplacer par supplémmédias ENTED CM-MEF. Laver MEF en plaques de 48 puits avec 1 x HBSS et ajouter les médias de CSEh. </li><li> Avec une pipette 200 ul transférer délicatement un tiers de la colonie disséqué dans une plaque de 48 puits pour l&#39;expansion. Transférer l&#39;autre 2/3 de la colonie disséqué dans une plaque de 96 puits correspondant contenant complétées médias CM-MEF. </li><li> Maintenir les deux plaques en changeant les médias tous les jours (complété médias CM-MEF pour matrigel revêtu plaques à 96 puits et CSEh médias pour des plaques de 48 puits contenant MEF; fois complété avec 0,5 pg / ml de puromycine). </li><li> Développer jusqu&#39;au plaques à 96 puits sont 100% de confluence et d&#39;abord l&#39;écran par PCR. </li></ol> 5. dépistage et l&#39;expansion de clones positifs <ol><li> Pour préparer l&#39;ADN génomique (méthode basée sur 11) supprimer tous les médias de plaques en inversant, puis épongez sur du papier absorbant. </li><li> Rincer chaque puits deux fois avec RT PBS (100 pl / puits chaque lavage), inverti et blot comme pour l&#39;étape 5.1. La place des plaques à -80 ° C fou 1 - 2 heures pour faciliter la lyse des cellules (plaques peuvent être stockées indéfiniment comme cela). </li><li> Alors que les cellules sont à -80 ° C faire Sarcosyl tampon de lyse (voir tableau 4) (50 pl / puits). Pour lyser les cellules, les plaques chaudes pendant 5 min à température ambiante puis la pipette du tampon de lyse dans chaque puits. Sceller les bords de chaque plaque avec du ruban adhésif, placer dans un contenant hermétique contenant des serviettes de papier humides à créer de l&#39;humidité, et incuber O / N à 60 ° C. </li><li> Après incubation ajouter 150 ul de NaCl 5M à 10 ml de -20 ° C de l&#39;éthanol absolu, bien mélanger et ajouter 100 ul à chaque puits (Note: l&#39;éthanol sera couvert quand on ajoute du NaCl). Tapoter doucement les plaques à mélanger (ne pas pipette) et partent pour un minimum de 30 min à température ambiante. Pendant ce temps, la solution sera claire et l&#39;ADN précipite. </li><li> Retirer la solution comme à l&#39;étape 5.1 puis ajouter 150 ul d&#39;éthanol à 70% à chaque puits. Inversez plaque délicatement et épongez comme avant. Répétez cette étape une nouvelle 2x. Remarque: Parce que l&#39;ADN précipité naturellement adhéres à la matière plastique de culture de tissu, il ne devient pas délogée au cours de ces étapes de lavage.) </li><li> Après le lavage final, les plaques centrifuger brièvement à la vitesse supérieure pour concentrer l&#39;ADN au fond de chaque puits, puis séché à l&#39;air à la température ambiante (ou 37 ° C) pendant au moins 30 min. </li><li> Ajouter 40 - 50 pi T0.1E (pH 8,0) (voir tableau 5) ou TE (pH 8,0) à chaque puits et place des plaques à 65 ° C pendant 1 h ou à 4 ° CO / N avant de l&#39;utiliser pour la PCR. Remettre en suspension l&#39;ADN en tapotant délicatement les côtés de la plaque. Utilisez 1-2 pi de réaction PCR re-suspendu ADN / 10 pi. </li><li> Utilisation du système de PCR Expand Long Template avec bras hPITX3 L gen. F et L hPITX3 amorces bras GFP R effectuent le dépistage initial des clones à 58 ° C recuit, 45 extension sec, 35 cycles. </li><li> Électrophorèse des échantillons avec 1kb Hyperladder dans un gel d&#39;agarose à 1% contenant GelRed à 100 V pendant 45 min et la détection des clones positifs par illumination UV. </li><li> Valider clones positifs de PCR par digestion de l&#39;ADN génomique à partir de expaDEMVSO clones (voir ci-dessous) avec HindIII et hybridation des sondes 5 &#39;et 3&#39; des bras vecteur d&#39;homologie à un transfert de Southern (comme décrit précédemment en 1). Les sondes sont générées par PCR en utilisant des paires d&#39;amorces hPITX3 5 &#39;sonde F et R, et hPITX3 3&#39; sonde F et R, digéré par EcoRI et ligaturé dans un vecteur de clonage général. </li><li> Selon le nombre de clones positifs, préparer deux puits d&#39;une plaque à 6 puits en pré-placage avec MEF (2,0 x 10 4 cellules par cm 2). </li><li> Le lendemain, prétraiter les clones positifs dans la plaque à 48 puits avec 10 pM de Y-27 632 pendant au moins 1 heure. </li><li> Laver clones positifs avec du HBSS et ajouter 300 ul de Accutase. </li><li> Lorsque les colonies sont rendus cellules individuelles, ajouter 1 ml de milieu de CSEh et de recueillir dans un tube de 15 ml. </li><li> Changer les médias tous les jours. Le jour 2, Y-27632 peut être retiré et les cellules cultivées dans CSEh médias. </li><li> Lorsque les colonies sont de 70 - 80% de confluence, sous-culture et de geler le reste de la colofragments de New York. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

La génération de lignées cellulaires rapporteurs offre un moyen puissant pour suivre, visualiser et d&#39;isoler les cellules d&#39;intérêt à partir d&#39;une population hétérogène provenant de CSEh. Cependant, le ciblage génique par recombinaison homologue classique s&#39;est avérée être extrêmement inefficace pour CES de l&#39;homme 3. Dans ce protocole, nous décrivons une technique relativement simple pour introduire un RP dans l&#39;exon l&#39;un des locus Pitx3, dans CSEh en utilisant un vecteur...

Les cellules souches embryonnaires (ESC) de différenciation des protocoles actuels conduisent à des populations de cellules hétérogènes, en particulier en ce qui concerne la dérivation de phénotypes neuronaux spécifiques. Ainsi, bien que les cultures contiennent le phénotype cellulaire souhaité, d&#39;autres neurones, les types de cellules non-neuronales et non différenciées sont souvent présents 1. Ces caractéristiques limitent l&#39;application de l&#39;ESC dérivée de sources cellulaires pour une utilisation dans la thérapie de remplacement cellulaire et la modélisation de la maladie in vitro. Des lignées cellulaires rapporteurs génétiques offrent un moyen de visualiser, de suivre et d&#39;isoler des cellules d&#39;intérêt, à la condition que l&#39;expression de la protéine rapporteur (RP) reproduit expression endogène. L&#39;utilisation de promoteurs immédiatement en amont d&#39;une région codante du gène peut être utilisé pour dériver reporters génétiques brut mais ces constructions n&#39;ont pas les éléments de régulation qui contrôlent précisément l&#39;expression du gène endogène. En revanche, la recombinaison homologue proposepossibilité d&#39;assurer l&#39;expression de haute fidélité de la RP. Dans le passé, des vecteurs de ciblage conçus pour la recombinaison homologue au locus spécifique d&#39;intérêt ont été utilisés pour cibler PR chez la souris (CES mESCs) par électroporation comme un moyen de délivrance d&#39;ADN 1,2. Cependant, la génération de lignées cellulaires rapporteurs par recombinaison homologue conventionnelle est extrêmement inefficace pour CES humaines (CSEh), et par conséquent n&#39;a été documentée dans un petit nombre de cas (revue dans 3). En utilisant une protéine chimérique conçu contenant une fusion d&#39;une nucléase Fok I avec des motifs en doigt de zinc spécifiques au site, connus collectivement sous le doigt de zinc (ZFN nucléases), cassures de l&#39;ADN double-brin peuvent être introduits à des loci génomiques pré-déterminé. Quand un vecteur d&#39;ADN ayant une homologie avec les deux côtés de la cassure double brin d&#39;ADN est ajouté, le site génomique peut être réparé par une recombinaison homologue, ce qui permet l&#39;incorporation de la séquence d&#39;ADN du donneur. Cette technique s&#39;est avérée utile fou l&#39;édition génomique dans les cellules humaines primaires 4,5 et 6,7 CSEh. Plus des travaux récents ont utilisés transcription activateur comme effecteurs nucléases (Talens), des facteurs de transcription utilisés par les agents phytopathogènes 8, pour aider à la conception des nucléases spécifiques au site 9. Dans le protocole suivant, nous démontrons la génération d&#39;une lignée de cellules hESC rapporteur par électroporation d&#39;un vecteur contenant l&#39;EGFP de ciblage homologue 6, conjointement avec la ZFN pour homéoboîte de l&#39;hypophyse humaine 3 (Pitx3) locus. Après la sélection antibiotique pendant 2-3 semaines, CSEh avec l&#39;ADN correctement intégré peuvent être récoltés manuellement, élargis et examinés d&#39;abord par PCR, puis validés par transfert de Southern.

<table><tbody><tr><td>Fibroblastes embryonnaires de souris (DR4)</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6004G</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>Grattoir cellulaire</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Axon Medchem</td><td>Axon 1683</td><td></td></tr><tr><td>Crépine cellulaire - 40 &mu ; m</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>33 mm - 0,22 &mu ; m filter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>rhFGF2</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025/CF</td><td></td></tr><tr><td>Électroporateur</td><td>BioRad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette d’électroporation 0,4 cm</td><td>BioRad</td><td>165-2088</td><td></td></tr><tr><td>Humain TV-hPITX3-construction de ciblage avant</td><td>Addgene</td><td>31942</td><td></td></tr><tr><td>ZFN Kit ; Humain PITX3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CKOZFN1050-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Life Technologies</td><td>A1569601</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal de bovin, qualifié, inactivé par la chaleur, origine américaine (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Mélange de milieu et de nutriments modifié Dulbecco’s Eagle F-12 (DMEM/F12)</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Remplacement de sérum KnockOut (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels MEM&nbsp ; (NEAA)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>&szlig ;-mercaptoéthanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine solution de sel sodique (Sarcosyl) (30 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61747</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e9884?lang=en&amp ; region=US">E9884</a></td><td></td></tr><tr><td>Trizma Hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K solution (20 mg/ml)</td><td>Bioline Australia</td><td>BIO-37084</td><td></td></tr><tr><td>Expand Long Template PCR System</td><td>Roche Australia</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>hPITX3 L arm gen. F (amorce) : 5' TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3'</td><td>GeneWorks, Australie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hPITX3 L bras GFP R (amorce) : 5' ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3'</td><td>GeneWorks, Australie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyperLadder 1 kb&nbsp ;</td><td>Bioline Australie</td><td>BIO-33025</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Jomar Bioscience, Australie</td><td>41003</td><td></td></tr></tbody></table>

doigt de zinc nucléase gene meilleur ciblage dans embryonnaires humaines cellules souches

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

Une limitation majeure avec les protocoles de différenciation actuels cellules souches embryonnaires humaines (ESC) est la génération de populations cellulaires hétérogènes. Ces cultures contiennent les cellules d&#39;intérêt, mais sont également contaminés avec les CES indifférenciées, les dérivés non-neural et d&#39;autres sous-types de neurones. Ceci limite leur utilisation in vitro et in vivo dans des applications telles que la modélisation in vitro pour la découverte de médicaments ou la thérapie de remplacement cellulaire. Pour aider à surmonter cela, des lignées de cellules rapporteurs, qui offrent un moyen de visualiser, suivre et isoler les cellules d&#39;intérêt, peuvent être conçus. Cependant, pour atteindre cet objectif dans des cellules souches embryonnaires humaines, par recombinaison homologue conventionnelle est extrêmement inefficace. Ce protocole décrit le ciblage de la homéobox pituitaire 3 (Pitx3) locus dans les cellules souches embryonnaires humaines en utilisant des nucléases zinc des doigts conçus sur mesure, qui introduisent double-brin de cassures de l&#39;ADN spécifique au site, avec unePitx3 - vecteur donneur d&#39;ADN spécifique de EGFP. Suite à la génération de la lignée cellulaire rapporteur Pitx3, il peut alors être différencié en utilisant des protocoles publiés pour une utilisation dans des études in vitro telles que la modélisation de la maladie ou la thérapie de remplacement cellulaire dans la maladie de Parkinson.

Après co-électroporation de la Pitx3 paire zinc-finger conçu sur mesure avec le Pitx3 - EGFP vecteur donneur d'ADN spécifique de, et la sélection à la puromycine ultérieure, les clones de CSEh positifs ont d'abord été détectés par dépistage génomique par PCR (figure 1). L'hybridation par Southern blot de ces clones positifs de PCR avec 5 'et 3' des sondes spécifiques confirmé ciblage correct à l'exon 1 du locus Pitx3 (figure 2), avec un rendement de 1...

des lignées cellulaires rapporteurs offrent un moyen de visualiser, de suivre et d&#39;isoler des cellules d&#39;intérêt à partir de populations hétérogènes. Cependant, le ciblage génique en utilisant une recombinaison homologue conventionnelle dans les cellules souches embryonnaires humaines est extrêmement inefficace. Ici, nous décrivons le ciblage CNS lieu mésencéphale spécifique Pitx3 facteur de transcription avec EGFP en utilisant doigt de zinc nucléase amélioré recombinaison homologue.

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One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

L’objectif global de ce protocole est de cibler efficacement les transgènes vers des loci d’intérêt dans les cellules souches embryonnaires humaines en utilisant des nucléases à doigts de zinc conçues sur mesure. Les cellules souches embryonnaires humaines ou CSH sont expansées pour générer suffisamment de matériel pour l’électroporation, puis digérées pour produire des cellules uniques. Ensuite, l’ARNm codant pour deux nucléases à doigts de zinc de conception personnalisée est co-électroporé dans les CSH avec la séquence donneuse EGFP linéarisée et les cellules sont ensuite plaquées sur des embryons de souris frais, des fibroblastes ou des MEF.Les nucléases à doigts de zinc électroporées introduisent une rupture double brin dans le premier exon de la fosse X trois locus dans les cellules. Ensuite, la séquence donneuse EFGP, qui est flanquée de bras de ciblage avec homologie avec la séquence du site de frein du brin doublet d’ADN, est incorporée lors de la division cellulaire après 14 à 21 jours. Un tiers d’une colonie individuelle d’HESC est passé sur chaque puits d’une plaque de 96 puits recouverte de matrigel et les deux autres tiers sont transférés dans un puits correspondant d’une plaque de 48 puits contenant des ME F frais. Lorsque les cellules des plaques de 96 puits atteignent la cofluidité, elles sont criblées pour l’incorporation de la séquence donneuse par PCR.Un transfert Southern est ensuite effectué pour confirmer la bonne intégration. Une fois que les clones positifs sont confirmés, ils sont étendus, puis congelés pour une utilisation ultérieure. Le principal avantage de cette technique par rapport à la méthodologie existante, telle que la recombinaison homologue conventionnelle, est que les doigts de zinc créent des cassures double brin d’ADN prédéterminées, ce qui facilite le ciblage efficace des transgènes pour prédéterminer les loci dans les cellules souches embryonnaires humaines.Bien qu’ici nous introduisions un gène trans dans le locus trois de la fosse X des cellules souches humaines, cette méthode peut être adaptée à tout autre système où l’utilisation de lignées cellulaires rapporteures serait avantageuse. Commencez ce protocole en développant des cellules souches embryonnaires humaines ou des CSH pour la transfection, comme décrit dans le document d’accompagnement. Lorsque les colonies deviennent confluentes à 60 à 70 %, placez la plaque de culture tissulaire sur un microscope à dissection.Utilisez une aiguille de calibre 21 à l’extrémité d’une pipette de deux mil litres pour toiletter les colonies en retirant les colonies différenciées ou les noyaux de colonie. Ensuite, pour laver les colonies HESC, aspirez le milieu. Ajoutez ensuite cinq millilitres de HBSS et incubez pendant deux minutes.Après l’aspiration de l’incubation, les HBSS ajoutent cinq millilitres d’Accutane et incubent pendant 10 à 20 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 jusqu’à ce que les colonies deviennent des cellules uniques observées au microscope. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, tri les cellules. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de milieu HESC et, à l’aide d’une crépine à cellules de 40 microns, filtrez-le dans un tube conique de 15 millilitres.Pour éliminer les amas de cellules, centrifugez le flux à 160 fois la gravité pendant cinq minutes. Après le spin Resus, suspendez la pastille cellulaire dans cinq millilitres de milieu HESC frais et tournez à nouveau pour éliminer toute solution résiduelle d’Accutane. Remettre les cellules en suspension dans un milieu HESC contenant 10 micromolaires Y 2 7 6 3 2 et les transférer dans une boîte de 100 millimètres pré-enduite de gélatine incubée à 37 degrés Celsius, 5 % CO2 pendant au moins 30 minutes.Pendant ce temps, les MEF adhéreront au plat enrobé de gélatine. Après l’incubation, à l’aide d’une pipette d’un millilitre, recueillir les cellules souches embryonnaires supérieures non adhérentes dans un nouveau tube à centrifuger de 15 millilitres et déterminer la densité cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre en préparation de l’électroporation. Transférez 7,5 millions de CSH, comme préparé dans la section précédente de cette vidéo, dans un nouveau tube conique de 15 millilitres et centrifugez-le à 160 fois la gravité pendant cinq minutes.Après le spin Resus, suspendez la pastille de cellule dans 0,8 millilitre de HBSS filtré de 0,22 micron glacé, transférez la solution dans un vétérinaire d’électroporation stérile de 0,4 centimètre. Ensuite, ajoutez 30 microgrammes de TVH pit X three forward targeting. Construisez l’ADN et mélangez-le doucement à l’aide d’une pipette de 200 microlitres, incubez sur de la glace pendant cinq minutes pendant l’incubation, la décongélation et l’aliquote de la fosse X trois ARNm ZFN sur glace.Une fois décongelé, transférez 7,5 microlitres au mélange de cellules d’ADN dans l’électroporation Q vétérinaire mélangé doucement avec une pipette de 200 microlitres. Appuyez sur le bouton rouge de l’électro pour transfecter les cellules. Ensuite, à l’aide d’une pipette de 200 microlitres, transférez le contenu de l’Electroporation Q Vet dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de milieu HESC.Lavez le Q VET deux fois avec 200 microlitres de milieu HESC et recueillez les solutions de lavage dans le même tube de 15 millilitres. Pour éliminer les débris de mucus qui en résultent constitués d’ADN et de protéines des cellules lysées. Centrifuger à 160 fois la gravité pendant cinq minutes.Après l’essorage, aspirez le surnageant et tapotez doucement la pastille cellulaire pour détacher la dépense de Reese en 30 millilitres. M-E-F-C-M complété par HR FGF deux et 10 micromolaires Y 2 7 6 3 2 et déposer sur trois boîtes de 100 millimètres contenant des MEF. Incuber à 37 degrés Celsius 5 %CO2 95 % O2.En changeant de milieu tous les jours le deuxième jour, en prélevant Y 2 76 32 et les cellules brutes dans le milieu HESC uniquement. Après deux à trois jours, le HES CS devrait être confluent à 50 à 70 % à ce stade. Commencez la sélection d’antibiotiques.Maintenez la sélection en ajoutant quotidiennement de l’HESC frais par milieu de mycine. Après environ sept jours, de petites colonies devraient être visibles si des MEF résistants aux antibiotiques ne sont pas utilisés. Les MEF peuvent être complétés par l’ajout d’une fois 10 cellules supplémentaires par centimètre carré.14 à 21 jours après la sélection lorsque les colonies ont atteint environ un millimètre de diamètre. Préparez les plaques pour l’expansion et le criblage en ajoutant 75 microlitres de matrigel ou de gel TRE dans chaque puits de 3 96. Les plaques de puits préparent également 3 plaques de 48 puits de MEF à deux fois 10 à la quatrième cellules par centimètre carré incuber les deux ensembles de plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius, 5 % de CO2 le lendemain.À l’aide d’une aiguille de calibre 21 à l’extrémité d’une pipette de deux millilitres, disséquez les colonies de HESC en 16 à 25 morceaux en découpant une grille. Ensuite, aspirez le matrigel des plaques à 96 puits et remplacez-le par un milieu CM MEF complété par R hf, GF deux et par mycine. Lavez les MEF dans les plaques à 48 puits avec HBSS, puis ajoutez le milieu HESC avec de la mycine à l’aide d’une pipette de 200 microlitres.Transférez doucement un tiers de la colonie disséquée dans une plaque de 48 puits pour l’expansion. Transférez les deux autres tiers de la colonie disséquée dans la plaque de 90 puits correspondante contenant du milieu C-M-M-E-F supplémenté. L’aspect le plus difficile de cette procédure est le transfert des morceaux de colonie.Nous vous suggérons de pratiquer au préalable le transfert et la dissection des pièces de couleur. Entretenez les deux plaques en changeant quotidiennement le milieu supplémenté en antibiotiques. Élargissez jusqu’à ce que les plaques de 96 puits soient confluentes à 100 % une fois que les plaques sont confluentes.Retirez tout le support des assiettes en les retournant, puis épongez-les sur du papier absorbant. Procéder à la préparation de l’ADN génomique pour la PCR comme décrit dans le document d’accompagnement après la suspension de l’ADN dans TE ou TO 0.1 E.Effectuer la PCR à l’aide du système de PCR à matrice longue comme décrit dans le document d’accompagnement, utiliser un à deux microlitres d’ADN remis en suspension par réaction PCR de 10 microlitres après le dépistage PCR pour les clones positifs par électrophorèse et confirmer par transfert de Southern. Une fois que les clones positifs sont confirmés, procédez à la sous-culture et congelez le reste des fragments de la colonie pour concevoir un PIT X trois.Lignée cellulaire rapporteure hecs. Ont été associés à une paire de doigts de zinc de fosse X conçue sur mesure et à un vecteur donneur d’ADN spécifique à la fosse X trois, comme décrit dans cet article vidéo, après PERY et la sélection, des clones HESC positifs ont été détectés par criblage PCR génomique, comme on peut le voir ici. Il y avait de nombreux clones positifs comme l’indiquent les bandes de 9 à 84 paires de bases.L’hybridation par transfert de Southern de ces clones positifs à la PCR a ensuite été réalisée à l’aide de cinq et trois sondes spécifiques. Cette illustration montre le schéma du vecteur de ciblage linéarisé ainsi que l’emplacement des cinq et trois sondes externes ici. Les cinq et trois transferts méridionaux des allèles de type sauvage et ciblés sont illustrés.La bande unique dans la voie de type sauvage indique deux allèles identiques suite au ciblage correct du transgène vers la fosse x trois locus, deux bandes sont observées. L’un correspondant à l’allèle correctement ciblé, l’autre à l’allèle de type sauvage. Une fois maîtrisée, cette méthodologie peut être réalisée en deux à trois mois.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cibler les cellules souches humaines à l’aide de nucléases à doigts de zinc, ainsi que de la façon d’utiliser les stratégies de PCR et de transfert de Southern pour dépister les CL correctement ciblés.

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