Name: Un protocole de vidéo infections rétrovirales dans intestinale primaire Organoid Culture (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-11T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Découvrez la transduction rétrovirale dans les organoïdes intestinaux primaires pour des études génétiques fonctionnelles. Cette méthode permet la surexpression ou le knockdown inductibles de transgènes in vitro.

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Koo BK et Mustata RC sont pris en charge par le Sir Henry Dale bourse du Wellcome Trust et Andersson-Rolf A est soutenu par le Medical Research Council (MRC). Fink J est soutenu par le Programme PhD 4 ans Wellcome Trust.

Toutes les souris utilisées dans le protocole suivant ont été conservés dans des conditions exempts d&#39;organismes pathogènes spécifiques, et toutes les procédures ont été effectuées conformément à la réglementation Royaume-Uni du Home Office. Préparation 1 <ol><li> Préparez le support 1 heure avant utilisation (voir le tableau 1 et la liste des matériaux pour plus de détails) et pré-chaud dans un bain d&#39;eau à 37 ° au moins 10 minutes avant utilisation. </li></ol> 2 La culture de l&#39;intestin grêle (SI) organoïdes REMARQUE: Sauf indication contraire, toutes les incubations sont réalisées à 37 ° C, 5% de CO 2 dans un incubateur humidifié. L&#39;équipement et les réactifs venir en contact avec des cellules vivantes doivent être stériles. Pré-chauffer la plaque de culture de tissus est important, car il évite la matrice de sous-sol (Matrigel ou BME) à partir de gouttes d&#39;étalement lors de l&#39;ensemencement. En outre, la matrice de sous-sol doit être conservé sur la glace à tout moment. Conserver à -20 ° C et dégelsur la glace avant utilisation. <ol><li> Isoler Cryptes <ol><li> Pour l&#39;isolement de l&#39;intestin grêle sacrifier la souris selon les règles et réglementations nationales, puis placez l&#39;animal sur son dos et laver l&#39;abdomen avec 70% d&#39;éthanol. Effectuer une incision médiane longitudinale de l&#39;aine jusqu&#39;au sternum. Tout d&#39;abord, couper la peau et du tissu sous-cutané. Retirer l&#39;intestin grêle à partir du caecum à l&#39;estomac. Cryptes isolées du duodénum, ​​le jéjunum et l&#39;iléon peuvent être utilisés pour la culture organoïde. </li><li> Laver le petit intestin isolé avec pré-refroidi une solution saline tamponnée au phosphate sans calcium ou magnésium (PBS0). </li><li> Coupez le tissu dans de longs morceaux de 3-5 cm et utiliser des ciseaux pour couper ouvrir longitudinalement. Étaler le tissu en utilisant une pince. </li><li> Grattez villosités l&#39;aide d&#39;une lamelle. Attention, trop de force provoque le tissu à déchirer et permettra de réduire le rendement des cryptes dans les étapes suivantes. </li><li> Transférer le tissu dans un tube de 50 ml contenant usin PBS0 pré-refroidiPince g. Laver les fragments de tissus par une agitation vigoureuse et changer le PBS0. Répétez 2-3 fois ou jusqu&#39;à ce que le PBS0 tourne moins trouble. </li><li> Incuber le tissu dans un tube de 50 ml contenant 30 ml de PBS0 avec 1 mM d&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pendant 30 min à 4 ° C sur un rouleau de tube. </li><li> Agiter vigoureusement le tube et transférer le tissu à un autre tube de 50 ml contenant 30 ml de PBS0 avec EDTA 5 mM. La solution d&#39;EDTA 1 mM (contenant le tissu précédemment) contient un mélange de cryptes et villosités. Cette fraction ne convient pas pour le semis des organites, car il contient souvent un fort pourcentage de villosités. </li><li> Incuber le tissu supplémentaire pendant 1 heure à 4 ° C sur un rouleau de tube. </li><li> Agiter vigoureusement le tube et recueillir la solution dans un tube de 50 ml propre. Confirmer la présence de cryptes et estimer le nombre, par exemple, en comptant cryptes 50 pi par microscopie optique. Calculez le volume nécessaire pour obtenir 50-100 cryptes et le transférer à un 1,5 ml tube. </li><li> Tourner à 300 g pendant 5 min. Jeter le surnageant, remettre le culot dans 50 ul de matrice de sous-sol, et les graines dans une plaque de 24 puits pré-chauffé. Incuber la plaque dans un incubateur de culture de tissu de 5 à 15 minutes de sorte que la matrice de sous-sol polymérisé. </li><li> Superposition avec 500 ul moyen ENR (voir le tableau 1). Environ 24 heures après l&#39;ensemencement des organites affiche une petite forme kystique ronde et après un autre 2-3 jours herbe structures deviennent visibles. Changer de médias ENR frais tous les 3 jours. </li><li> Passage Organoid cultures tous les 7 jours. </li></ol></li><li> Repiquage et organites maintien <ol><li> Maintenir les organites en actualisant les médias tous les 3 jours et 1 passage: 3 ou 1: 5, comme la lumière se remplit de cellules mortes, environ tous les 7 jours. </li><li> Casser la matrice sous-sol dôme avec un milieu en utilisant 1 ml de pointe Pipetman et transférer du bien à un tube de 1,5 ml. </li><li> Dissocier mécaniquement les organites par pipetage unenviron 50x à l&#39;aide d&#39;une amende (par exemple, 200 pi) pointe. </li><li> Tourner à 300 g pendant 5 min. </li><li> Jeter le surnageant et remettre le culot en 150-250 pi de matrice de sous-sol. Graine d&#39;une pré-chauffé plaque à 24 puits (50 ul de matrice de sous-sol / puits). Avant le semis pipette la matrice de sous-sol de haut en bas une fois pour enrober la paroi de la pointe. Pipette lentement afin d&#39;éviter les bulles et les semences dans le milieu du puits pour empêcher le sous-sol à partir de la matrice de dispersion. Il est souhaitable d&#39;obtenir un dôme de matrice de sous-sol dans le centre du puits. </li><li> Incuber dans un incubateur de culture de tissu pour 5-15 min si la matrice de sous-sol polymérise. Superposition avec 500 ul médias ENR par puits. </li></ol></li></ol> 3 Pré-infection Traitement des SI organites REMARQUE: La figure 1 illustre la procédure de transduction. <ol><li> Bourse ENR à ENRWntNic (voir le tableau 1) moyen et grandir les organites dans tson milieu pendant un minimum de 3 jours ou jusqu&#39;à ce qu&#39;ils aient adopté une morphologie kystique. Wnt3a augmente le nombre de cellules souches et de Paneth tout Nicotinamide (Nic) améliore l&#39;efficacité de la culture. </li></ol> 4. Virus production <ol><li> Un plat de 150 mm de cellules Platinum-E est nécessaire par l&#39;infection. Graine d&#39;environ 5 x 10 6 cellules par ml de milieu de 15 à 18 (DMEM + 10% de FBS) en présence de puromycine (1 ug / ml) et de la blasticidine (10 ug / ml). Transfecter des cellules au bout de 2-3 jours, lorsqu&#39;elles ont atteint 70-80% de confluence. Changer le support de DMEM + 10% de FBS sans puromycine et blasticidine avant la transfection. </li><li> Ajouter 30 mg de construction d&#39;ADN rétroviral, et 240 ul de polyéthylène-imine (PEI) pour séparer des tubes contenant 1 ml d&#39;Opti-MEM. Mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Réunir les deux solutions et laisser incuber à la température ambiante pendant 20 à 30 min. Ajouter le mélange complet au milieu de cellules Platinum-E et agiter prudemment la platee pour assurer une répartition égale des complexes ADN-PEI. </li><li> Incuber les cellules Platinum-E avec le mélange de transfection nuit et rafraîchir le milieu de la journée suivante. Maintenir les cellules dans le nouveau moyen pendant 2 jours. </li><li> Ne recueillir que le milieu dans un tube Falcon de 50 ml, passer à travers un filtre de 0,45 um et centrifuger à 8000 g à 4 ° C pendant 12-16 h. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 250 pi de milieu de transduction (voir le tableau 1). </li></ol> 5. Organoid Fragment Préparation <ol><li> Pour une infection par un puits d&#39;une plaque à 24 puits sont nécessaires. Casser la matrice sous-sol dôme avec un milieu en utilisant 1 ml de pointe Pipetman et le transférer dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Utilisez une pointe de volume plus fine (par exemple, 200 conseils de pi) de perturber mécaniquement les organites par pipetage (30-50x). La solution devient trouble et sans organites entiers doit être visible. </li><li> Centrifuger à température ambiante, 900 g pendant 5 min<html> . </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 500 pl de qualité culture cellulaire protéase recombinante (par exemple, TrypLE). Incuber à 37 ° C pendant 5 min. Après incubation vérifier la taille des fragments organoïdes utilisant la microscopie optique, compter le nombre de cellules par fragment. Fragments contenant 5-10 cellules sont idéales. Si la majorité des fragments contenant un nombre plus élevé de cellules le temps d&#39;incubation peut être augmentée en deux minutes à une heure. </li><li> Terminer le processus de dissociation en ajoutant 500 pi de milieu ENR. </li><li> Centrifuger à température ambiante, 900 g pendant 5 min. Enlever le surnageant et garder le culot sur la glace ou à 4 ° C. </li></ol> 6. rétrovirale transduction <ol><li> Moissonneuse fragments organoïdes avec 250 ul de la solution rétroviral (à partir de la section 4.5) dans un puits d&#39;une plaque à 48 puits. Mélanger doucement par pipetage lent en utilisant 1 ml de pointe Pipetman. </li><li> Sceller la plaque avec du parafilm. </li></ol>e &quot;&gt; 7. spinoculation et placage <ol><li> Centrifuger la plaque à 32 ° C, 600 xg, pendant 1 heure. Retirez délicatement le parafilm et incuber la plaque dans un incubateur de culture de tissu pendant 6 heures. </li></ol> 8. semis de fragments Organoid infectés <ol><li> Transférer les fragments organoïdes infectées et les médias de la transduction du bien à un tube de 1,5 ml, et de spin à 900 g pendant 5 min. </li><li> Jeter le surnageant et remettre le tube contenant le culot sur de la glace pendant 5 minutes pour refroidir. Ajouter 100 ul de matrice de sous-sol et remettre en suspension le culot lentement par pipetage de haut en bas. </li><li> gouttes de semences de «sous-sol matrice -Chargeur mix &#39;50 pi dans une nouvelle plaque de 24 puits. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 5 à 15 min jusqu&#39;à ce que la solidification de la matrice de sous-sol. </li><li> Ajouter des médias de transduction sans polybrene dans les puits et incuber la plaque dans un incubateur de culture de tissu. Changer de support tous les 2-3 jours. </li></ol> 9 Sélection <ol><li> Lancer soilection au bout de 2-3 jours en ajoutant à la puromycine (1 pg / ml) dans les médias. </li><li> Lorsque les fragments commencent à former des organites remplacer le support de transduction avec des milieux ENR supplémenté avec de la puromycine (1 ug / ml). </li></ol> 10 post-infection Traitement des SI organites <ol><li> Culture transduction organites selon le «repiquage et de maintenir organoïdes&quot; protocole (section 2.2.1). Après 1-2 semaines, les organites SI retrouveront leurs structures en herbe. </li><li> Suite à l&#39;apparition de structures en herbe induire l&#39;expression de miARN ou d&#39;ADNc par addition de 4-hydroxytamoxifène (4-OHT) à une concentration de travail de 1 uM. Notez que cette étape n&#39;est valable que si vous utilisez des vecteurs rétroviraux de Addgene (pMSCV-loxp-DsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxp-DsRed-loxp-3xHA-Puro-WPRE (32703), et pMSCV -flip-puro-DsRed-GFP-miARN (32704)) et organites exprimant Cre-ERT2. </li></ol> 11 Confirmation des maladies infectieuses et Expression / répression du gène d&#39;intérêt <ol><li> Si vous utilisez des vecteurs rétroviraux de Addgene (32702, 32703 et 32704) efficacité de transduction peut être confirmée par l&#39;observation d&#39;expression DsRed. En outre, l&#39;expression ou la suppression du gène d&#39;intérêt peut être confirmée par Western Blot, en utilisant la GFP ou de l&#39;épitope 3xHA (pour la surexpression du gène) et la PCR quantitative (par knock-down de gènes), comme illustré en 4 Koo et al. </li></ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer. Les auteurs n’ont déclaré aucun conflit d’intérêts.

<html> Pour atteindre à haute efficacité de transduction certains aspects sont essentiels. L&#39;un est le pré-traitement des organites avec ENRWntNic médias jusqu&#39;à ce qu&#39;ils adoptent une forme kystique ronde. Cela augmente le nombre de cellules souches et de ce fait la probabilité d&#39;obtenir une intégration stable du transgène, ainsi que l&#39;augmentation du taux des organites SI de survie tout au long de la procédure de transduction. Un autre paramètre est le temps d&#39;incubation suivant spinoculation. Résultats trop courtes ou trop longues incubation à faible efficacité de transduction et faible taux de survie des organites, respectivement. L&#39;étape de spinoculation n&#39;est pas indispensable bien qu&#39;elle augmente de manière significative le pourcentage des organites transduites. Enfin, le virus à titre élevé est essentiel pour la transduction succès. Cela dépend du type de lignée cellulaire d&#39;encapsidation et virus. La combinaison de platine-E lignée cellulaire et le virus de la cellule souche murine (MSCV), a été trouvée pour produire un titre suffisamment élevé pour la transduction des organites. ve_content &quot;&gt; Voici quelques conseils de dépannage qui peut contribuer à réaliser la transduction succès. Tout d&#39;abord, si la transfection de la lignée cellulaire d&#39;encapsidation est pauvre, assurez-vous que la confluence des cellules est comprise entre 70-80% et que le temps d&#39;incubation de la mélange groupé PEI-ADN est compris entre 20 à 30 min. L&#39;survie des organites au cours de la transduction dépend fortement de la taille de fragment. trop longue provoque trypsinisation la majorité des fragments se composer de moins de trois cellules et diminue de ce fait la capacité de survie organoïde. Un autre facteur est l&#39;activité du milieu conditionné Wnt, si l&#39;activité est trop faible stimule à travers plus de CHIR99021 à une concentration de travail de 5 uM peuvent augmenter la survie. CHIR99021 inhibe la GSK3, entraînant la signalisation Wnt augmenté. En outre, Y-27362, qui empêche anoikis est ajouté aux milieux de transduction afin d&#39;améliorer la capacité de survie organoïde, étant donné que les organites sont perturbés fragments de cellules (contenant de 1 à 10) avant la transduction. Comme60; indiqué ci-dessus, la durée d&#39;incubation après spinoculation ne doit pas dépasser 6 heures. Enfin, si pauvre transduction on observe les facteurs mentionnés ci-dessus qui influencent le titre viral et la limite de taille de l&#39;insert pour le vecteur rétroviral doivent être considérés. L&#39;efficacité de l&#39;effet de choc est fortement dépendante de la miARN. Étant donné que l&#39;efficacité varie en fonction de la combinaison du gène cible et il est intéressant de miARN effectuer un écran d&#39;efficacité pour identifier ceux qui donnent les meilleurs résultats. La technique est limitée à des phénomènes épithéliales du système organoïde. Dans le futur, il pourrait être possible d&#39;étudier les maladies infectieuses ou auto-immunes à travers la co-culture des agents pathogènes ou des composants dérivés de reconstitution du système immunitaire, respectivement. Par ailleurs, les rétrovirus ne peuvent effectuer des inserts de taille relativement petite. Par conséquent, les régions régulatrices naturelles doivent être exclus et donc l&#39;expression du transgène ne peuvent pas imiter celui dele gène endogène. Comme mentionné ci-dessus, l&#39;efficacité dépend de knockdown du gène cible et miARN. Si aucun miARN avec une efficacité de knock-down approprié peut être trouvé, il peut limiter l&#39;utilisation de la technique pour ce gène cible particulier. Théoriquement, organites sont compatibles avec toutes les techniques de manipulation standardisés utilisés pour les lignées cellulaires. Transduction rétrovirale a été la première méthode à indiquer 4, et récemment BAC (chromosomes bactériens artificiels) -transgenesis est devenu disponible 5. Avec un temps de production totale de 2 à 3 semaines après la transfection du plasmide viral dans la lignée cellulaire d&#39;encapsidation, il est nettement plus rapide que la génération d&#39;une transgéniques (Tg) de la souris. En maintenant l&#39;in vivo l&#39;architecture crypte-villosité tout en contenant des cellules souches ainsi que toutes les lignées de cellules différenciées de l&#39;épithélium intestinal, le système de culture organoïde fait le pont entre l&#39;animal et tg culture cellulaire utilisé précédemment. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Le protocole décrit ici fournit une méthode pour effectuer l&#39;analyse phénotypique de endodermique épithélium in vitro par intensité forte et déficitaires des études de fonction. Il est donc possible de répondre à des questions physiologiquement pertinents adulte biologie des cellules souches, avec un besoin minimal de souris tg. Par exemple, la génération de souris knock-out conditionnel peut être évité en utilisant des mutants dérivés d&#39;organites nouveau-né avec une létalité périnatale 6. En outre, la technique peut être appliquée à organites provenant de souris knock-out précédemment établies pour étudier le rôle des paralogues en effectuant knockdown supplémentaire 7,8. Suite à la création de petits organites intestinaux, adaptation du protocole de culture d&#39;origine a permis la culture de pancréas, du foie, du colon et de l&#39;estomac épithéliums 9-11. En outre, organites intestinales humaines et organites tumorales ont été obtenues à partir de biopsies humaines normales, primaire adenoma et le cancer colorectal biopsies 10. Le protocole d&#39;infection virale peut facilement être étendue à ces types de organoïdes et fournit un moyen sans précédent de réaliser des études fonctionnelles dans les tissus humains dérivée. Pris dans leur ensemble, transduction rétrovirale de petits organites intestinale est une ressource précieuse pour la recherche d&#39;entretien sur les cellules souches, la différenciation et la décision du destin cellulaire, ainsi que les interactions de signalisation cellulaire et cellules portable.

Haut-débit génétique fonctionnelle est nécessaire pour accroître notre compréhension de la biologie du corps, afin d&#39;améliorer la science fondamentale et la médecine actuelle. la génétique de la souris a été l&#39;étalon-or pour étudier la fonction des gènes in vivo, même si elle est à la fois long et coûteux. Les lignées cellulaires, qui constitue l&#39;autre choix commun, ont une capacité de débit supérieure, tout en étant moins cher. Cependant, ils sont gênés par leur incapacité à reproduire le microenvironnement approprié et par conséquent, les réponses physiologiques vu in vivo. Ainsi, il existe un besoin non ambiguë d&#39;un système de modèle facile à manipuler, ce qui permet de coût / temps efficace analyse à haut débit tout en imitant les réponses physiologiques observés in vivo transgéniques expériences dans (tg) de souris. Pour l&#39;épithélium endodermique un tel système de modèle apparu en 2009 1. Parmi les connaissances acquises à partir de la découverte des cellules souches intestinales LGR5-positifs a étédes informations sur le créneau correspondant à la matrice et des facteurs de croissance extra-cellulaire nécessaires pour le maintien de cellules souches. En utilisant cette information, il est devenu possible d&#39;établir des «mini-tripes» également connu sous le organites 2. Récemment, une nomenclature de consensus pour les cultures in vitro, où organites sont appelés «enteroids», a suggéré 3. Comme les lignées cellulaires, les organites sont en pleine expansion et facile à traiter avec des ligands et inhibiteurs. Cependant, au lieu d&#39;être à deux dimensions sont des structures tridimensionnelles d&#39;auto-organisation qui conservent l&#39;organisation crypte-villosité ainsi que les cellules souches et lignées de cellules différenciées de l&#39;intestin grêle (SI). Organites sont constitués d&#39;une seule couche de cellules épithéliales qui entourent une zone luminale. Structures en herbe en saillie correspondent à de petites cryptes intestinales contenant le compartiment des cellules souches. A partir de la pointe de la structure naissante cellules souches se différencient car ils MIgrille vers l&#39;épithélium, où les cellules différenciées sont excrétés dans la lumière. Par rapport à des lignées cellulaires, ce système ex vivo récapitule plus étroitement la physiologie normale et est donc un système de modèle prometteur pour le petit épithélium intestinal. Dans ce protocole vidéo de transduction rétrovirale, nous présentons une méthode qui permet ex vivo des études de la fonction des gènes dans ce nouveau système de culture organoïde. Nous commencerons par décrire organoïde culture d&#39;une manière pas-à-pas, et continue en démontrant la production de rétrovirus, suivie par la procédure de transduction. Enfin, il ya une section pour des conseils supplémentaires pour le dépannage. Un avantage de cette technique est qu&#39;elle peut être combinée avec l&#39;imagerie en direct ou le criblage de médicaments à étudier l&#39;homéostasie, les décisions du destin cellulaire et interactions cellulaires dans l&#39;épithélium intestinal. En raison de leur architecture simple et taux de rotation rapide, organites représentent un modèle idéal deystème pour l&#39;étude des cellules souches adultes de la biologie. En outre transduction rétrovirale peut être appliquée à organites dérivées de souris transgéniques pré-établies ainsi que des échantillons de patients humains. À l&#39;approche de knock-in et knock-out ne peut être étendue à l&#39;homme, les organites humain SI constituent une alternative intéressante. En résumé, la manipulation génétique par transduction rétrovirale permet l&#39;analyse phénotypique de petits organites intestinales provenant de souris ou des échantillons de tissus humains, complétant ainsi la génétique de la souris et des lignées cellulaires tout en ouvrant de nouvelles voies pour des études dans les tissus humains dérivée. Transduction rétrovirale permet intensité forte et la perte de fonction des études à effectuer dans le système de culture organoïde 4. Cela en fait un outil précieux pour étudier la fonction des gènes, adulte biologie des cellules souches et de la maladie, tout en étant en conformité avec les trois R (réduction, raffinement et remplacement).

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 avancé&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>12634-034</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>35050-068</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplément 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplément 100x&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>n-Acétylcystéine 500 mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Souris EGF 500 &micro ; g/ml</td><td>Invitrogen Biosource</td><td>PMG8043</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Noggin 100 &micro ; g/ml</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr>Milieu <td></td><td></td><td>conditionné R-Spondin</td><td>Le milieu conditionné est généré à partir de cellules HEK293, pour plus de détails, voir Sato et Clevers 2013.</td></tr><tr><td>Le</td><td>milieu conditionné est généré à partir de cellules L, pour plus de détails, voir Sato et Clevers 2013.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide 1 M</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 10 & micro ; M</td><td>Sigma</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Polybrène (8 & micro ; g/ml)</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Standard BD Matrigel matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>Extrait de matrice de socle (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02) fourni par AMSBIO peut être utilisé comme alternative.</td></tr><tr><td>Greiner à plaques 24 puits</td><td>Bio One</td><td>662960</td><td></td></tr><tr><td>Greiner à plaques 48 puits</td><td>Bio One</td><td>677980</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma</td><td>A3734-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Cellules Platinum-E</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113902</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylèneimine (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocole de vidéo infections rétrovirales dans intestinale primaire organoid culture

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Cellules souches LGR5 positifs peuvent être complétées par la croissance facteurs essentiels VO, caboche, et R-Spondin, ce qui nous permet à la culture en pleine expansion structures épithéliales 3D primaires in vitro. Les deux propriétés de l&#39;architecture et physiologiques de ces «mini-tripes», également appelés organites, ressemblent beaucoup à leurs homologues in vivo. Cette eux un système de modèle attractif pour le petit épithélium intestinal fait. Utilisation de transduction rétrovirale, génétique fonctionnelle peuvent désormais être effectuées par la surexpression du gène conditionnelle ou effet de choc. Cette vidéo montre la procédure de culture organoïde, la génération de rétrovirus, et la transduction rétrovirale des organites à faciliter l&#39;analyse phénotypique de la petite épithélium intestinal in vitro. Ce système modèle organotypique nouveau en combinaison avec l&#39;expression de gènes à médiation rétrovirale fournit un outil précieux pour l&#39;analyse rapide de la fonction des gènes in vitro sans qu&#39;il soit nécessaire de costlgénération y et chronophage pour les animaux transgéniques.

Organites sont prêts à être divisé lorsque la lumière centrale est obscurcie par la présence de cellules mortes (figure 2). Après 2-3 jours de organoïdes pré-traitement devrait adopter une morphologie ronde kystique (Figure 3). Cela augmente le nombre de cellules souches, en améliorant les chances d'obtenir une intégration stable. La taille de la pastille virale peut varier suivant la centrifugation du surnageant viral, probablement en raison de la contribution variant de débris cellulaires de la taille des pellets. Aucune corrélation claire de l'efficacité de transduction a été observé. Au cours de la procédure de sélection organites non transduites vont mourir, tandis que ceux ayant une intégration stable est conservé. La protéine fluorescente à partir de rétrovirus MSCV-eGFP peut être observée dans des cellules provenant de survivants organites, qui ont une morphologie kystique, dans les 2-3 jours après transduction (figure 4). <img alt> = "Figure 1" fo: contenu width = "6 pouces" src = "/ files / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg" width = "600" /&gt; Figure 1: Une représentation schématique de la procédure de transduction rétrovirale. Organites Avant d'infection sont pré-traitées en utilisant ENRWntNic jusqu'à ce qu'ils adoptent une structure kystique (étape 1). Platine cellules-E sont utilisées comme la lignée cellulaire d'encapsidation, et sont mises en culture jusqu'à ce qu'elles atteignent 70-80% de confluence. Par la suite, ils sont transfectées avec la construction rétrovirale utilisant PEI. Les virus sont récoltées 2 jours plus tard (étape 2). Organites sont traitées à la trypsine pour obtenir des fragments contenant 1-10 cellules (étape 3), et sont ensuite infectées (étape 4). À la suite de spinoculation à augmenter l'efficacité de l'infection (étape 5), les fragments sont ensemencées organoïdes infectés (étape 6) et 2-3 jours après la sélection de clones positifs avec intégration stable peut être réalisée (étape 7). 1765fig2highres.jpg "width =" 500 "/&gt; Figure 2: Représentant l'image de organoïdes après 4-6 jours de culture. La lumière est remplie de cellules mortes, faisant apparaître sombre. Organites à ce stade sont prêts à être des passages. <img alt="Image microscopique de bulles d’air dans un liquide pendant l’étude de l’équilibre statique, démontrant la tension superficielle." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figure 3 images représentant des petits organites intestinales cultivées en ENRWntNic médias pendant 3-4 jours. Les organites adopter une morphologie kystique. <img alt="Images de morphologie cellulaire, microscope à fond clair et à fluorescence, analyse de la structure cellulaire." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figure 4 images représentant des petits organites intestinales (a) qui montrent l'expression du transgène viral (b, eGFP). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Advanced DMEM / F12 +++ </td></tr><tr><td colspan="2"> Conserver à 4 ° C pendant 4 semaines </td></tr><tr><td> Avancée DMEM / F12 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Glutamax 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Hepes 1 M </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Antibiotiques 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Moyen ENRWntNic (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Conserver à 4 ° C pendant 2 semaines </td></tr><tr><td> Avancée DMEM / F12 +++ </td><td> 7,2 ml </td></tr><tr><td> complément B27 (50x) </td><td> 400 pl </td></tr><tr><td> N2 supplément (100x) </td><td> 200 pl </td></tr><tr><td> N-acétylcystéine (500 mM) </td><td> 50 pi </td></tr><tr><td> EGF de souris (500 ug / ml) </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> Caboche souris (100 ug / ml) </td><td> 20 pl </td></tr><tr><td> R-Spondin conditmoyen ioned </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Wnt3a milieu conditionné </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Nicotinamide (1 M) </td><td> 200 pl </td></tr><tr><td colspan="2"> moyen de transduction (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Préparer une solution fraîche </td></tr><tr><td> Moyen ENRWntNic </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Y-27 632 (10 uM) </td><td> 20 pl </td></tr><tr><td> Polybrène (8 pg / ml) </td><td> 20 pl </td></tr><tr><td colspan="2"> Moyen ENR (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Conserver à 4 ° C pendant 4 semaines </td></tr><tr><td> Avancée DMEM / F12 +++ </td><td> 17,4 ml </td></tr><tr><td> complément B27 (50x) </td><td> 400 pl </td></tr><tr><td> N2 supplément (100x) </td><td> 200 pl </td></tr><tr><td> N-acétylcystéine (500 mM) </td><td> 50 pi </td></tr><tr><td> EGF de souris (500 ug / ml) </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> Caboche souris (100 ug / ml) </td><td> 20 pl </td></tr><tr><td> R-Spondin milieu conditionné </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Médias pour les cellules Platinum-E (pour 500 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Conserver à 4 ° C pendant 12 semaines </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449,45 ml </td></tr><tr><td> Sérum bovin fœtal (FBS) </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Puromycine (1 ug / ml) </td><td> 50 pi </td></tr><tr><td> Blasticidine (10 ug / ml) </td><td> 500 pl </td></tr></tbody></table> Tableau composition 1. Médiathèque avancée DMEM / F12 +++, moyen ENRWntNic, le milieu de transduction, moyen ENR, et moyen pour les cellules Platinum-E.

Ce protocole explique culture organoïde primaire LGR5-positve et la performance ultérieure de transduction rétrovirale. Cela permet la surexpression Cre inductible ou effet de choc du transgène livré et permet des études fonctionnelles à réaliser dans le roman en organotypique in vitro système modèle.

Un protocole de vidéo infections rétrovirales dans intestinale primaire Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

L’objectif général de cette procédure est de démontrer comment effectuer des études génétiques fonctionnelles dans les organoïdes. Ceci est accompli en prétraitant d’abord les organoïdes avec des milieux contenant WINT trois A pour faciliter leur adoption d’une forme kystique et augmenter leur nombre de cellules souches. Dans un deuxième temps, le virus est produit et les fragments d’organoïdes sont ensuite transduits et inoculés.Dans la dernière étape, les organoïdes transfectés sont placés puis sélectionnés pour une intégration virale stable. En fin de compte, l’expression ou la suppression du gène d’intérêt peut être évaluée par fluorescence GFP. Le principal avantage de l’utilisation de cette technique par rapport aux modèles AL existants comme la souris, est qu’avec cette technique, des expériences génétiques fonctionnelles peuvent être réalisées in vitro avec les organoïdes intestinaux.Pour isoler les cryptes, commencez par laver l’intestin grêle avec du PBS pré-refroidi sans calcium ni magnésium. Ensuite, coupez le tissu en morceaux de trois à cinq centimètres de long et ouvrez les morceaux longitudinalement avec des ciseaux. À l’aide d’une pince, ouvrez les tissus, grattez l’excès de villosités à l’aide d’une lamelle, puis transférez les morceaux dans un tube de 50 millilitres contenant du PBS réfrigéré.Lavez les fragments de tissu deux à trois fois en les secouant vigoureusement, en changeant le PBS jusqu’à ce que le PBS devienne moins trouble après le dernier lavage, incubez le tissu dans un tube de 50 millilitres contenant 30 millilitres de PBS complété par un EDTA millimolaire à quatre degrés Celsius sur un rouleau à tube. Après 30 minutes vigoureusement, secouez à nouveau le tube et transférez le tissu dans un autre tube de 50 millilitres contenant 30 millilitres de PBS complété par cinq millimolaires d’EDTA. Après une heure, incubation à quatre degrés Celsius sur le tube enroule vigoureusement.Agitez à nouveau le tube et transférez la solution dans un nouveau tube de 50 millilitres. Comptez ensuite le nombre de cryptes en 50 microlitres. Calculez et transférez le volume contenant 50 à 100 cryptes dans un tube de 1,5 millilitre.Ensuite, faites tourner les cryptes et remettez la pastille en suspension dans 50 microlitres de matrice de sous-sol. Ensuite, ensemencez la solution de crypte dans une plaque Prewarm 24 Well et incubez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire pendant cinq à 15 minutes. Une fois la membrane basale polymérisée, incubez la matrice avec 500 microlitres de milieu ENR dans un incubateur de culture cellulaire.En rafraîchissant le milieu tous les trois jours environ 24 heures après l’installation, les organoïdes présenteront une petite forme kystique ronde. Après deux à trois jours supplémentaires, les structures bourgeonnantes deviendront visibles pendant que les organoïdes adoptent leur morphologie kystique Graine, environ cinq fois 10 aux six cellules E de platine dans une boîte de 150 millimètres avec 15 à 18 millilitres de milieu complété par du pur, de la mycine et de la blastine. Après deux à trois jours, changez le milieu pour un milieu sans antibiotiques et ajoutez 30 microgrammes d’ADN rétroviral et 240 microlitres de pi dans deux tubes individuels contenant chacun un millilitre d’optimum.Ensuite, mélangez les tubes et incubez-les à température ambiante. Après cinq minutes, mettez les deux solutions en commun et incubez-les à température ambiante pendant encore 20 à 30 minutes. Ajoutez le mélange complet aux cellules de platine E et secouez soigneusement la plaque pour assurer une répartition égale des complexes d’ADN PI.Après une nuit d’incubation, rafraîchissez le milieu et incubez à nouveau les cellules. Après deux jours, prélevez uniquement le milieu dans un tube Falcon de 50 millilitres et filtrez-le à travers un filtre de 0,45 micron. Ensuite, centrifugez la solution pendant 12 à 16 heures à 8 000 fois G et quatre degrés Celsius, et remettez la pastille en suspension dans 250 microlitres de milieu de transduction.Pour préparer les fragments d’organoïdes à la transduction rétrovirale, pipetez d’abord la culture 30 à 50 fois avec une pointe de pipette de 200 microlitres pour perturber mécaniquement les organoïdes, la solution deviendra trouble et aucun organoïde entier ne doit être détecté. Après avoir fait tourner les fragments, incubez la pastille dans 500 microlitres de culture cellulaire, en classant la protéase recombinante à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l’incubation, utilisez un microscope optique pour évaluer la taille des fragments d’organoïdes et compter le nombre de cellules par fragment.Ajoutez ensuite 500 microlitres de milieu ENR pour terminer le processus de dissociation et faire tourner les fragments cellulaires. Après avoir jeté le surnageant, placez la pastille sur de la glace, puis ensemencez les fragments dans un puits de 48. Plaque de puits dans 250 microlitres de la solution rétrovirale préalablement préparée.Mélangez doucement la solution cellulaire à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre, puis scellez la plaque avec param pour effectuer la première centrifugeuse d’inoculation. La plaque de 48 puits pendant une heure à 600 fois G et 32 degrés Celsius. Retirez ensuite soigneusement le film para et incubez la plaque pendant six heures supplémentaires dans un incubateur de culture cellulaire.Après l’incubation, transférez les fragments infectés dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, faites tourner à nouveau les fragments d’organoïde et refroidissez la pastille sur de la glace pendant cinq minutes. Une fois que la pastille a refroidi, ajoutez 100 microlitres de matrice de sous-sol dans le tube et pipetez lentement la pastille de haut en bas pour la remettre en suspension.Ensuite, semez 50 gouttes d’un microlitre de la suspension de la matrice de fragments dans chaque puits d’une plaque de 24 puits et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant cinq à 15 minutes Une fois que la matrice du socle s’est solidifiée, incubez les organoïdes avec un milieu de transduction sans poly cerveau. Après deux à trois jours, ajoutez des milieux contenant de la mycine pure dans les puits pour commencer la sélection. Lorsque les fragments commencent à former des organoïdes, remplacer le milieu de transduction par un milieu ENR complété.Avec puram, les organoïdes de mycine sont prêts à être divisés lorsque leurs lumières centrales s’assombrissent en raison de la présence de cellules mortes. Après deux à trois jours de prétraitement de Wint trois a mili, les organoïdes devraient adopter une morphologie kystique proche, augmentant le nombre de cellules souches et augmentant les chances d’obtenir une intégration stable dans les cellules souches. Sur ces images, l’expression de la protéine fluorescente du rétrovirus M-S-C-V-E-G-F-P peut être observée dans les cellules provenant des organoïdes survivants qui ont acquis la morphologie kystique attendue dans les deux à trois jours suivant la transduction.Lors de cette procédure, il est important de vérifier la taille des fragments d’organoïde car cela affecte fortement leur capacité de survie. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la transduction rétrovirale des organoïdes.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

Une méthode simple pour établir murin colon organoïde de la tumeur primitive est décrite. Cette méthode utilise la fonction que les cellules tumorales du côlon survivre et se développer dans organites dans un milieu contenant des facteurs de croissance limitées, alors côlon normal épithéliale n'en ont pas.

In vitro Organoid Culture des primaires tumeurs du côlon de souris

Dans ce protocole vidéo, nous expliquons étape par étape la transduction lentivirale dans les organoïdes de l’épithélium intestinal primaire et le traitement et l’analyse en aval de ces cultures par RT-PCR quantitative, ARN-microarray et immunohistochimie.

Un protocole pour Lentiviral transduction et analyse aval de intestinale organoïdes

Ici, un protocole pour récolter, conserver et traiter les souris petits organites intestinaux avec des motifs de pathogènes associés moléculaires (PAMP) et Listeria monocytogenes est décrit, ainsi que l' accent sur ​​l' expression des gènes et des techniques de normalisation appropriées pour la protéine.

le<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture et Pattern Recognition Receptor Stimulation de la souris Intestinal organites

Nous présentons des protocoles pour l’isolation de bâtiments 3D intestinales in vivo des tissus du et matrice de sous-sol en vitro intégrée organoïdes et différentes de fixation détail et souillant des protocoles optimisés pour l’immuno-marquage des microtubules, les protéines centrosomes et jonctionnelles ainsi que cell marqueurs dont la protéine des cellules souches Lgr5.

Immuno-fluorescence étiquetage des Microtubules et des centrosomes protéines dans les tissus intestinaux Ex Vivo et 3D In Vitro intestinale organoïdes

Nous décrivons des instructions étape par étape à : 1) engineerly organoids intestinal utilisant des nanoparticules magnétiques pour la transduction lenti- ou rétroviral, et, 2) produisent des sections congelées des organoïdes machinés. Cette approche fournit un outil puissant pour modifier efficacement l'expression des gènes chez les organoïdes pour l'étude des effets en aval.

Génie génétique des organoïdes intestinaux de souris primaires utilisant les vecteurs viraux de transduction magnétique de nanoparticule pour la section congelée

Nous présentons ici deux protocoles qui permettent la modélisation des interactions apicales-spécifiques intestinales. Les monocouches intestinales organoïdes-dérivées et les cultures d’interface air-liquide (ALI) facilitent la génération d’épithélium bien différencié accessible des côtés luminal et basolatéral, tandis que les organoïdes intestinaux inversés à polarité exposent leur côté apical et se présentent à des analyses à haut débit.

Méthodes de culture pour étudier les interactions spécifiques aux apicales à l’aide de modèles organoïdes intestinaux

Ce protocole décrit comment infecter les organoïdes intestinaux humains de leur côté apical ou basolatéral pour caractériser les interactions hôte/pathogène au niveau de la cellule unique à l’aide de la technologie de séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNAseq).

Adaptation des organoïdes gastro-intestinaux à l’infection pathogène et au séquençage unicellulaire dans des conditions de biosécurité de niveau 3 (BSL-3)

Ce protocole offre des instructions détaillées pour établir des organoïdes murins de l’intestin grêle, isoler les cellules lymphoïdes innées de type 1 de la lamina propria de l’intestin grêle murin et établir des co-cultures en 3 dimensions (3D) entre les deux types de cellules pour étudier les interactions bidirectionnelles entre les cellules épithéliales intestinales et les cellules lymphoïdes innées de type 1.

Co-culture d’organoïdes épithéliaux murins de l’intestin grêle avec des cellules lymphoïdes innées

Nous présentons ici un protocole permettant de générer des organoïdes intestinaux de rat et de les utiliser dans plusieurs applications en aval. Les rats sont souvent un modèle préclinique privilégié, et le système organoïde intestinal robuste répond au besoin d’un système in vitro pour accompagner les études in vivo .

Génération et manipulation d’organoïdes intestinaux de rat

Ce protocole décrit une approche pour effectuer l’imagerie calcique dans les organoïdes intestinaux humains infectés par le virus et propose une approche d’analyse.

Imagerie calcique en direct de monocouches organoïdes intestinaux humains infectés par un virus à l’aide d’indicateurs de calcium codés génétiquement

Découvrez la transduction rétrovirale dans les organoïdes intestinaux primaires pour des études génétiques fonctionnelles. Cette méthode permet la surexpression ou le knockdown inductibles de transgènes in vitro.

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