Ex Vivo préparatifs de l'ampoule Vomeronasal organes et accessoire olfactive Intact

L'ampoule accessoire olfactif de la souris (AOB) a été difficile à étudier dans le contexte du codage sensoriel. Ici, nous démontrons une dissection qui produit in vivo préparation ex dans laquelle les neurones AOB restent fonctionnellement connectées à leurs entrées périphériques, ce qui facilite la recherche en traitement de l'information des phéromones de souris et kairomones.

L’objectif global de cette procédure est de produire une préparation ex vivo de l’organe nasal de souris fonctionnellement connecté, ou VNO, un bulbe olfactif accessoire, ou un OB. Pour ce faire, il faut d’abord effectuer une dissection grossière du crâne de la souris afin d’isoler un seul hémisphère du museau et du bulbe olfactif. Dans la deuxième étape, les axones délicats du VNO et un OB sont exposés par une dissection secondaire dans une chambre de perfusion tissulaire. Enfin, une fine canule est insérée dans le VNO à travers laquelle l’odeur et le stimulus peuvent être introduits.

En fin de compte, les enregistrements électrophysiologiques peuvent être utilisés pour mesurer l’activité neuronale au sein de l’OB A pendant la stimulation VNO. L’avantage de cette technique par rapport aux techniques existantes comme l’électrophysiologie en coupe in vitro, c’est qu’avec cette technique, l’organe sensoriel et les circuits neuronaux en aval restent fonctionnellement connectés. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car il existe de nombreuses étapes de dissection délicates qui sont difficiles à apprendre, et parce que des erreurs sur l’une de ces étapes peuvent entraîner un échec de la dissection Pour commencer la dissection primaire, utilisez d’abord une pince Addin pour retirer les os pariétaux et frontaux du crâne de la souris, en prenant soin de ne pas entrer en contact avec les bulbes olfactifs.

Ensuite, utilisez un scalpel pour faire une coupe coronale à travers le lobe frontal, une dorloture de deux millimètres aux sinus, puis retirez la dorloture du cerveau à la coupe. Utilisez des ciseaux droits pour enlever les aspects exposés de la dorlote du crâne ventral, laissant les sinus et le tissu nerveux restant. Retirez l’arc zygomatique et les muscles faciaux du côté anatomique droit du crâne, puis tournez le museau du côté ventral vers le haut.

Pour exposer le toit de la bouche, insérez immédiatement la pointe de la lame du scalpel sous la palette parallèle au toit de la bouche, puis déplacez la lame vers les incisives. Saisissez le bord rostral libéré de la palette à l’aide de la pince et retirez le palais en tirant de manière codolosue. Ensuite, sur le côté anatomique gauche du crâne, insérez uniquement la pointe de la lame du scalpel dans le vide près des molaires, et tournez le poignet pour étendre le foramen palatin de manière codjouée.

En commençant par le petit foramen près des molaires, utilisez la pointe de la lame du scalpel pour continuer à couper du foramen palatin à travers les incisives, en commençant par le rostral jusqu’au VNO anatomique gauche avec de multiples coupes entaillées. Ensuite, tournez le tissu de manière à ce que le crâne dorsal soit tourné vers le haut et orientez une lame de rasoir droite verticalement et parallèlement à la ligne médiane au bord du dorlotement de la préparation au bord ventral du tissu, touchez le tranchant de la lame du rasoir immédiatement à gauche de la ligne médiane et balancez doucement la lame en se déplaçant le long du palatin gauche pour Raymond, en gardant la lame parallèle à la ligne médiane de la roche. La lame du rasoir exerce lentement une pression vers l’avant du tissu, s’arrêtant immédiatement après avoir percé la résistance au niveau de la plaque cribriforme.

Saisissez les hémisphères exposés près des côtés de la dorlote avec des doigts gantés et faites-les pivoter doucement latéralement et antérieurement pour séparer les tissus. Appliquez maintenant 50 à 100 microlitres de colle à tissu sur une fine planche de plastique. Saisissez le tissu avec une pince et épongez la préparation avec une serviette en papier pour éliminer l’excès d’humidité de sa face latérale.

À l’aide de la pince, placez délicatement le bord latéral de l’hémisphère droit sur la colle. Placez ensuite une goutte de graisse sous vide de trois à cinq millimètres de diamètre et de deux millimètres de profondeur au milieu d’une chambre de dissection secondaire, et placez fermement le côté de la planche opposé au tissu contre la graisse. Remplissez immédiatement la chambre de dissection avec une dissection réfrigérée, du liquide céphalo-rachidien artificiel ou un LCR A, et transférez la chambre dans la zone de dissection fine.

Commence ensuite la profusion de la chambre avec l’étalon oxygéné A LCR en orientant la planche de manière à ce que le bulbe olfactif soit directement dans le flux du liquide fraîchement oxygéné à effectuer. La dissection secondaire : Commencez par utiliser une pince fine pour retirer tout bulbe olfactif controlatéral visible ou tissu cortical. À partir de la préparation, localisez la dure-mère blanche le long de la surface médiale dorsale du bulbe olfactif, puis à l’aide de deux paires de pinces fines, déchirez la dure-mère en la saisissant par la partie la plus blanche et en écartant la pince.

Ensuite, lentement et soigneusement, décollez le cortex frontal à l’aide d’une pince fine sans endommager les bulbes olfactifs sous-jacents. Une fois le cortex frontal séparé, coupez et retirez le tissu ventral et postérieur à l’OB A en prenant soin de ne pas endommager la couche glomérulaire. Ensuite, passez un seul point de la pince fine entre le cartilage septal et l’aile du VNO, un mince morceau de tissu osseux qui longe le bord dorsal des deux VN Os.To retirez soigneusement le VNO controlatéral après avoir retiré complètement le VNO, utilisez une pince fine pour faire une coupe au bord du dorlotement ventral du cartilage septal, où il se rétrécit en un avasculaire blanc qui longe le bord ventral de l’os septal.

Pincez ensemble la pince fine pour faire une pointe semi-émoussée et insérez la pince à pincer latéralement à la coupe. Ensuite, soulevez lentement le cartilage du tissu septal, en procédant doucement et sans perturber le tissu septal sous-jacent. Saisissez l’os avec une pince et déplacez doucement l’os d’avant en arrière jusqu’à ce qu’il se fissure près de la plaque de reformage du berceau.

Maintenant, fixez une canule en polyamide à un dispositif de perfusion rapide et démarrez un flux de solution de sonnerie à 0,1 à 0,3 millilitre par minute à travers la canule en polyamide. Mesurez le débit à l’aide d’un débitmètre à petit volume en ligne. Enfin, orientez la canule parallèlement à l’entrée du VNO.

Lorsque la canule est en place, observez comment la pression de sortie provoque le gonflement du VNO, ce qui entraîne l’évacuation du vaisseau sanguin. Ensuite, insérez immédiatement la canule dans le VNO, en maintenant l’angle de la canule constant afin qu’elle reste parallèle à l’ouverture du VNO et commencez l’évaluation de la fonction physiologique. Une grande source de variabilité entre les préparations est la densité et la fragilité des os du crâne et du museau des animaux de laboratoire.

Il n’est pas rare que les tissus septaux restent attachés à l’hémisphère controlatéral, en particulier près des points d’attache aux os dorsaux du museau. D’autres erreurs de dissection courantes surviennent lors de la dissection fine secondaire, au cours de laquelle les axones du nerf nasal RO peuvent être endommagés dans le tissu septal près du VNO ou près de l’OB. Ces événements et d’autres similaires entraîneront une connectivité incomplète entre les neurones sensoriels nasaux RO et le rendu OB A. Les préparations sont inutilisables une fois la procédure terminée avec succès.

La connectivité fonctionnelle peut être vérifiée à l’aide d’un test physiologique tel que des enregistrements électrophysiologiques unitaires de l’activité neuronale en réponse à la stimulation VNO avec des odorants. Lors de cette procédure, il est important de rester calme et de faire de courtes pauses. Si vous êtes fatigué, de petites erreurs dans l’exécution de cette technique peuvent endommager ces structures neuronales délicates.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des dissections ex vivo du système d’usine d’accessoires précoce pour des études électrophysiologiques ou d’imagerie.