Name: Ex Vivo préparatifs de lampoule Vomeronasal organes et accessoire olfactive Intact (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-04T23:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Découvrez une préparation ex vivo de la bulbe olfactif accessoire de souris maintenant la connectivité fonctionnelle avec l'organe voméronasal. Cette méthode permet d'étudier le codage sensoriel des phéromones par électrophysiologie.

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Cette recherche a été soutenue par R00 DC011780 (JPM: NINDS, NIH), F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) et les fonds de démarrage UT Southwestern (JPM).

Toutes les expériences ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le sud-ouest institutionnel Comité de protection et d&#39;utilisation des animaux UT, et ont été choisis de manière à minimiser le stress, l&#39;inconfort et la douleur ressentie par les animaux de laboratoire. 1. Chambre Dissection Une chambre de dissection personnalisé et petit, mince planche de plastique sont nécessaires pour obtenir les meilleurs résultats (figure 1). Construire ou obtenir une telle chambre avant de tenter ce protocole. 2. Solutions de dissection <ol><li> Préparer 1 litre de liquide céphalo-rachidien artificiel standard (aCSF) pour une utilisation dans les étapes 03.22 à 05.04. Ajouter NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, NaHCO 3 25 mM, NaH 2 PO 4 1,25 mM, myo-inositol 3 mM, pyruvate de sodium à 2 mM, l&#39;ascorbate de sodium 0,4 mM, et de glucose 25 mM à 1 L d&#39;eau apyrogène. </li><li> Préparer l&#39;aCSF de dissection initiale (200 ml) pourutiliser dans les étapes 3.3 à 3.22. Prenez 200 ml de la norme aCSF et augmenter la concentration de MgCl2 par 9 mM en ajoutant 0,366 g de MgCl 2 hexahydraté. </li><li> Préparer la solution de norme assortie d&#39;effectuer des stimuli au VNO par la canule pour une utilisation dans les étapes 4.11 à 5.4 contenant NaCl 115 mM, KCl 5 mM, CaCl 2, 2 mM, MgCl2, 2 mM, NaHCO 3 25 mM, HEPES 10 mM, glucose 10 mM. </li><li> La bulle de 0,8 L d&#39;aCSF standard et 0,5 L de Ringer avec 95% O 2, 5% de CO 2 gazeux dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant un minimum de 15 min jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Bubble les 200 ml d&#39;aCSF de dissection initiale avec 95% O 2, 5% de CO 2 gazeux sur de la glace pendant 15 à 20 min jusqu&#39;à ce qu&#39;elle atteigne 4 ° C. </li></ol> 3. Dissection primaire <ol><li> Préparer la zone de dissection. Placez trois boîtes de 35 mm de Pétri, oxygéné aCSF, ciseaux de décapitation, courbes dissection, ciseaux de dissection droite ciseaux, pince Adson, un cuir chevelu # 11el lame et la poignée et une lame de rasoir sur de la glace. </li><li> Après oxygéné aCSF a refroidi à 4 ° C, anesthésier l&#39;animal profondément dans une chambre de dessiccation en utilisant 5.2 ml Isothesia (99,9% isofluorane). Effectuer des tests de pincement queue et pieds pour s&#39;assurer que l&#39;animal est sous anesthésie profonde. </li><li> Une fois l&#39;anesthésie profonde est confirmée, décapiter l&#39;animal et placer immédiatement la tête dans une boîte de Pétri remplie avec la dissection aCSF réfrigérés. REMARQUE: Plonger le tissu dans la dissection froide aCSF pour le garder frais tout au long de la procédure lorsqu&#39;il n&#39;est pas utilisé. </li><li> Retirer l&#39;aspect inférieure (ventrale du pharynx, de la mâchoire inférieure et la langue) avec des ciseaux courbes. </li><li> Utilisation Adson forceps deglove (zeste) la peau superficielle et insertions musculaires du crâne. Peler le cuir chevelu de caudal à rostral jusqu&#39;à ce que le seul site de fixation est sur les dents de devant. Couper le tissu au point de fixation à l&#39;aide des ciseaux courbes. Retirer les yeux en le saisissant avec une pince et retirez-le de la préparation. Nl&#39;oreille la fin de la procédure dégantage, éviter une force excessive sur le cartilage nasal délicate en utilisant les forceps Adson de libre insertions musculaires des os de la mâchoire supérieure. REMARQUE: Retirez le cuir chevelu de la partie caudale du crâne avec des ciseaux droits. </li><li> Avec les ciseaux droits, couper la ligne médiane du crâne de caudal à rostral jusqu&#39;à ce que les pointes du ciseau sont quelques mm dans les os frontaux (juste avant le sinus rhinal). </li><li> Retirez le pariétal et frontal du crâne avec une pince Adson. REMARQUE: Des morceaux de l&#39;os frontal ne restent souvent attachés aux os du nez caudale du sinus rhinal. Enlevez ces morceaux en prenant soin de ne pas contacter les bulbes olfactifs. </li><li> Utilisez le scalpel pour faire une coupe coronale par le lobe frontal 2 mm caudale pour les sinus, puis retirez la caudale du cerveau à la coupe. Assurer la pointe des contacts de scalpel le contour osseux du crâne ventrale de couper complètement le tissu postérieur. NOTE: Cela permetsuppression de la majorité du cerveau sans mettre le stress mécanique sur les voies olfactives latérales ou bulbes olfactifs. </li><li> Retirez les aspects exposés caudale du crâne ventrale avec des ciseaux droits. Laissez les sinus et le reste du tissu nerveux. </li><li> Retirer l&#39;arcade zygomatique et des muscles faciaux sur le côté droit anatomique du crâne à l&#39;aide des ciseaux droits </li><li> Tournez le museau plus (face ventrale) pour exposer le toit de la bouche. </li><li> Couper et enlever le palais immédiatement caudale pour les incisives. Pour ce faire, en insérant l&#39;extrémité de la lame de scalpel sous le palais parallèle sur le toit de la bouche, puis déplacer la lame vers les incisives. </li><li> Saisissez le (rostrale) libéré bord de la bouche avec une pince Adson et enlever en tirant caudale. </li><li> Sur le plan anatomique gauche du crâne, utiliser la lame de scalpel pour étendre les trou palatin caudale, à partir des petits trou près des molaires. Atteindre cet objectif en insérant l&#39;extrémité de la bla scalpeldé dans le vide près des molaires et en tournant le poignet. REMARQUE: Utilisez une extrême prudence pour utiliser uniquement la pointe de la lame - une coupure profonde peut endommager les tissus du septum. </li><li> Avec la pointe de la lame de scalpel, couper du foramen palatin par les incisives, à partir rostrale de l&#39;organe voméronasal gauche anatomique. Utilisez plusieurs coupes de notation. Ne pas endommager le tissu septal et les nerfs voméronasal en insérant la lame trop profonde. </li><li> Tourner le tissu de sorte que le crâne dorsale est orientée vers le haut et ensuite orienter la lame de rasoir à la verticale (parallèle à la ligne médiane) au bord extrême de la préparation. </li><li> Au niveau du bord ventral du tissu, toucher le bord de coupe de la lame de rasoir immédiatement à la gauche de la ligne médiane. Balancer doucement la lame et se déplacer le long du trou palatin gauche (région introduit à l&#39;étape 3.14 couper). </li><li> A la partie dorsale du tissu, de placer le bord de coupe du rasoir immédiatement à la gauche de la ligne médiane (moins de 1 mm). </li><li> Tenuela lame parallèle à la ligne médiane, basculer la lame de rasoir avec la pression lentement vers la partie antérieure du tissu. Remarquez résistance à la lame criblée. Arrêtez immédiatement après le cassage par cette résistance. NOTE: A ce stade, l&#39;hémisphère droit est desserré de l&#39;hémisphère gauche. La connexion ne reste plus entre les hémisphères le long de la dorsale museau en avant de la lame criblée. </li><li> Séparez les hémisphères en les saisissant près des côtés caudale avec les doigts gantés et délicatement tourner latéralement et en avant. REMARQUE: Cette étape est une source de variabilité expérimentale, en particulier chez la souris à museau déviées ou fragiles (par exemple, les souris plus âgées). En outre, lors de la tentative de faire tourner les demi-sphères à une distance l&#39;une de l&#39;autre, si une forte résistance est rencontrée marquer le museau dorsale (antérieure à la lame criblée) pour affaiblir les tissus conjonctifs. Ce faisant, prendre une extrême prudence de ne pas insérer le scalpel profondément, ce qui peut endommager le ti septalessu et les nerfs voméronasal. </li><li> Appliquez une petite quantité (50-100 pi) de colle à tissu sur la planche et placez doucement le bord latéral de l&#39;hémisphère droit sur la colle en utilisant les forceps Adson. Retirer l&#39;excès d&#39;humidité de la face latérale de la préparation à l&#39;aide d&#39;une serviette en papier pour empêcher la polymérisation de la colle prématurée et l&#39;adhérence lâche à la planche. NOTE: appliquer quelques gouttes de la dissection aCSF refroidi sur de l&#39;échantillon afin d&#39;accélérer la polymérisation de la colle après que le tissu est placé sur la colle. Cela garantit que le tissu reste bien en attente à la planche. </li><li> Placer une petite quantité (d&#39;un diamètre de 5.3 mm, 2 mm de profondeur) de la graisse à vide dans le milieu de la chambre de dissection secondaire et placer le côté de la face de la planche en tissu fermement contre la graisse. Remplir immédiatement la chambre de dissection froide dissection aCSF, transférer dans la zone fin de dissection et de commencer la perfusion avec oxygénée aCSF standard. Orienter la lame de façon que le bulbe olfactif est directement dans l&#39;flux fraîchement oxygéné aCSF standard. </li></ol> 4. Dissection secondaire <ol><li> Retirez tout controlatérale (gauche) bulbe olfactif visible ou tissu cortical de la préparation à l&#39;aide de pinces fines. Pincez les pinces fines (formant une pointe émoussée semi), puis placez-le à la partie dorsale et caudale du tissu près de la ligne médiane. Doucement courir la pince pincé le long de la ligne médiane, le pelage du tissu loin de l&#39;hémisphère droit lentement en mouvement antérieur. Retirez tout le tissu controlatéral, y compris le tissu de bulbe olfactif controlatéral. Prenez soin de ne pas poignarder à travers le tissu, ce qui peut causer des dommages à l&#39;AOB ou voméronasal nerf. </li><li> Observer la dure-mère blanc le long de la surface dorsale / médial du bulbe olfactif. Déchirez cette dure-mère le long du bord dorsal / caudale du bulbe olfactif en saisissant à la partie la plus blanche de la dure-mère avec deux paires de pinces fines et tirez-les loin de là. La durée est étroitementenroulé autour des bulbes olfactifs, et peut facilement se couper à travers le tissu pendant qu&#39;il est retiré. Éviter d&#39;endommager la surface interne du bulbe olfactif et l&#39;AOB lui-même. NOTE: Si la durée résiste déchirer facilement à ce stade, d&#39;introduire une petite coupe avec des ciseaux fins de dissection de pointe de printemps pour faciliter la séparation. </li><li> Lentement et soigneusement décoller le cortex frontal avec des pinces fines sans endommager les bulbes olfactifs sous-jacents. Observer une collection de vaisseaux sanguins apparaissent comme un filet semi-transparent immédiatement caudale à l&#39;AOB. Retirer ce filet avec des pinces fines pour faciliter la pénétration de l&#39;électrode dans des expériences électrophysiologiques. Saisir le filet avec des pinces comme le sépare de la AOB lors de la rentrée de cortex frontal et l&#39;enlever en tirant en bas et en dedans, en faisant attention de ne pas toucher l&#39;AOB. Une fois que le cortex frontal a été séparé des bulbes olfactifs, retirez-en le coupant avec une pince ventrale et postérieure à l&#39;AOB. REMARQUE: Prenez extreme soins à l&#39;enlèvement net, car si cela est fait trop rudement la couche glomérulaire peut être endommagé. </li><li> Dans la cavité nasale controlatérale exposée, enlever tout tissu septal controlatéral restant (feuille fragile jaunâtre contenant des vaisseaux sanguins) en utilisant les pince fine. Saisissez le tissu à la région caudale / dorsale (près de l&#39;os de la cloison) et puis tirez / soulever le tissu vers le côté antérieur. NOTE: Le tissu septal controlatéral peut être retiré par inadvertance pendant l&#39;étape d&#39;hémisection (étape 3.20). Dans ce cas, respecter un blanc, cartilage septal avasculaire et le légèrement transparent, vascularisé septale os. Si tel est le cas, l&#39;étape 4.4 peut être ignorée. </li><li> Retirez délicatement le VNO controlatéral par l&#39;exécution d&#39;un point de la pince fine entre le cartilage septal et la &quot;aile&quot; VNO (un mince morceau de tissu osseux qui longe le bord dorsal de deux VNO unique. <ol><li> Après le détachement de l&#39;aile du cartilage, déplacer la pointe de la pince sur le ventredans le VNO controlatéral près de la ligne médiane. Répétez cette étape à plusieurs endroits le long de l&#39;axe caudale / rostrale du VNO controlatéral pour le desserrer, ce qui lui permet d&#39;être éliminé en saisissant avec une pince et se soulever. </li></ol></li><li> Préparez-vous à retirer le cartilage septal en faisant une coupe au bord ventral / caudal (où il se rétrécit à un blanc avasculaire bande de fonctionnement du côté ventral de l&#39;os de la cloison) avec des pinces fines. </li><li> Retirer le cartilage septal par pinçant les pince fine pour faire un point émoussé semi. Identifier la coupe faite à l&#39;étape 4.6, insérer la pince pincé derrière (latérale) à cette coupe, puis soulevez lentement le cartilage loin du tissu septale et de procéder rostralement. NOTE: Ne pas perturber le tissu septal sous-jacent. Comme le cartilage est levé, observer la feuille sous-jacente de l&#39;étirement des tissus septale due à des adhérences lâches au cartilage. Un mouvement périodique, doux et stable des pinces fines pincés sur ce site d&#39;un lâchedhesion peut grandement faciliter la séparation réussie des deux structures. </li><li> Utilisez une paire de pinces # 3 avec une pointe recourbée pour enlever l&#39;os de la cloison. Approcher l&#39;os du septum à un angle à peu près parallèle au plan de l&#39;os septal. Insérer la dent incurvée entre le tissu septal et septale os. Saisissez l&#39;os avec la pince et déplacez doucement l&#39;os en arrière jusqu&#39;à ce qu&#39;il fissures près de la lame criblée. REMARQUE: Dans certains cas, l&#39;os septal résiste casser près de la lame criblée. Dans ce cas, utilisez une pince fine à marquer doucement l&#39;os de la cloison le long de l&#39;axe de dorsale / ventrale juste en avant de la lame criblée, puis répétez l&#39;étape 4.8. </li><li> Retirer le cartilage blanc juste rostrale au VNO par pincement avec une paire de pinces fines à l&#39;entrée et en tirant rostralement avec une autre paire de pinces fines. </li><li> Fixez la canule de polyimide à un dispositif de perfusion rapide et démarrer le flux de la solution de Ringer (0,1-0,3 ml / min) à travers la canule de polyimide.Débit Mesure avec un débitmètre petit volume en ligne: NOTE. Utilisation d&#39;un dispositif de commutation pneumatique de relance piloté par ordinateur réduit les changements de débit pendant la stimulation. Comparer les réponses de neurones pour tester stimuli avec des réponses à un stimulus maquette (contrôler la solution de Ringer) pour assurer des réponses sont spécifiques stimulus. </li><li> Orienter la canule parallèle à l&#39;entrée VNO. Lorsque la canule est satisfaisante parallèle à l&#39;entrée VNO, montre que la pression de sortie provoque le VNO à &quot;gonfler&quot;, conduisant à l&#39;évacuation du vaisseau sanguin. Insérer immédiatement la canule dans le VNO, en gardant l&#39;angle de la constante de canule de sorte qu&#39;il demeure parallèle à l&#39;ouverture VNO. REMARQUE: Il peut être utile de tenir la canule avec une paire de pinces fines contre la planche de plastique et utiliser une autre paire de pinces fines à l&#39;angle de la fin de la canule légèrement vers le haut. Si l&#39;on place par inadvertance la canule derrière le VNO, la sortie peut également provoquer le vaisseau sanguin VNOà évacuer, ce qui conduit à l&#39;impression d&#39;une canule appropriée a été effectuée. Emplacement correct peut être confirmée par l&#39;incorporation d&#39;un colorant dans une solution de Ringer. Lorsque la canule est correctement placé, le colorant doit seule sortie par l&#39;entrée VNO. En outre, on peut confirmer le positionnement correct en faisant en sorte que la canule est facilement visible à travers la face interne semi-transparent du VNO. </li><li> Déplacer la planche de plastique lentement jusqu&#39;à ce que la AOB est dans le flux direct de la aCSF standard, en prenant soin de ne pas déloger la canule du VNO. La dissection est terminée et l&#39;évaluation de la fonction physiologique peut commencer immédiatement. Étape 5 décrit brièvement une approche pour faire une telle évaluation. </li></ol> 5. Evaluation <ol><li> Pénétrer la surface de la AOB 2-4 MQ avec une microélectrode de verre de borosilicate attaché à un amplificateur extracellulaire et oscilloscope. </li><li> Avancer lentement la microélectrode à une profondeur de 100-200 um de lasurface à un débit de 50 pm / min. NOTE: A cette profondeur de tissu, on rencontrera l&#39;action spontanée des signaux potentiels occasionnels, illustrés par de brèves (~ 1-2 msec) déviations brusques de la tension de microélectrodes. </li><li> En rencontrant une action onde potentiel, cesser d&#39;avancer la microélectrode. </li><li> Observer et / ou enregistrer le taux potentiel d&#39;action tout en changeant la solution de livraison de relance de contrôle Ringer à un activateur connu de l&#39;activité de VSN (par exemple, la solution de Ringer contenant 50 mM de KCl). Si la dissection a été un succès, un changement de stimulus-dépendante dans l&#39;action taux potentiel ou potentiel de champ local peut être observée. REMARQUE: tous les neurones AOB répondront à tous les stimulus avec une augmentation de la fréquence de mise à feu (y compris la solution de Ringer contenant 50 mM de KCl). Une diminution de stimulus-dépendante du taux de tir indique également la connectivité fonctionnelle et une dissection de succès. Dans le cas où deux ou plus de neurones que l&#39;on rencontresont insensibles à VNO stimulation, ou si aucun des potentiels d&#39;action sont observés après de multiples pénétrations d&#39;électrodes, ce qui suggère une dissection sans succès. Si tel est le cas, une nouvelle dissection peut être initiée à l&#39;étape 3. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont aucun d&#39;importants conflits d&#39;intérêt à divulguer.

L&#39;ex préparation VNO-AOB vivo décrite dans ce protocole est une alternative intéressante à anesthésiés in vivo 5-7 et tranche en direct aiguë 17 expériences de la fonction AOB. Contrairement aigus expériences AOB de tranche, qui exposent également des éléments de circuit pour des enregistrements électrophysiologiques et optiques, cette préparation conserve tous les afférences sensorielles et les connexions intra-AOB. Bien que cela peut aussi être dit de anesthésié <em...

Traitement sensoriel dans le cerveau des mammifères couvre généralement plusieurs circuits neuronaux réciproquement connectés, chacun extrait les caractéristiques particulières de l&#39;entrée sensorielle. Dans les voies sensorielles, début traitement de l&#39;information est essentielle à la perception et le comportement normal. Dans le système olfactif accessoire (AOS), le bulbe olfactif accessoire (AOB) est le principal circuit neuronal qui relie la périphérie sensorielle aux structures en aval qui dictent l&#39;équilibre hormonal 1,2, 3 agression, et l&#39;excitation 4. En tant que tel, le traitement de l&#39;information au sein de ce circuit est fortement liée à l&#39;évolution du comportement animal. Le bulbe olfactif accessoire se trouve chez les souris et les rats à l&#39;aspect dorsal / caudale / postérieure du bulbe olfactif principal (MOB) sous la dense, vascularisé sinus rhinal. L&#39;AOB reçoit innervation afférente de axones des neurones sensoriels voméronasal périphérique (VSN) qui résident dans l&#39;organe voméronasal (VNO), un small tube borgne dans le museau antérieure juste au-dessus du voile du palais. Ces axones traversent la feuille sensible de tissu septal à la limite médiale de passages nasaux. Plusieurs études ont sondé les réponses neuronales AOB à des sources d&#39;odeurs AOS (tels que l&#39;urine de la souris) in vivo utilisant des souris anesthésiées 5-7 ou animaux librement explorer 8. L&#39;héroïque anesthésiés dans les études in vivo concernés (a) trachéotomie pour assurer une anesthésie profonde et prévenir l&#39;aspiration des stimuli 5-7 liquide, (b) la stimulation du ganglion sympathique cervical 6 ou canulation directe de l&#39;organe voméronasal 5,7 à introduire les odeurs non volatiles et (c) avec ou sans craniotomies ablations du lobe frontal pour permettre l&#39;avancement dans l&#39;électrode AOB 6. Awake / se comporter études 8-10 implantation chirurgicale impliqués d&#39;une microdrive. En somme, ces paradigmes expérimentaux sont puissants, mais extrêmement difficile et nécessitent une anesthésie souvent. (ex vivo) avec un certain succès 11-15. Parce que les liens entre le VNO et AOB restent ipsilatéral, et parce que le tissu médiane septale peut être exposé à superfusat oxygéné dans un seul hémisphère, nous avons cherché à développer une telle approche ex unique de l&#39;hémisphère vivo d&#39;isoler ces structures tout en maintenant leur connectivité fonctionnelle. Nous avons récemment réussi à atteindre cet objectif 16. Cette préparation conserve à la fois le VNO et AOB vivant et relié fonctionnellement au moins 4 - 6 h parce que les deux axones (le long de la ligne médiane tissu septal doux) et AOB sont relativement peu profonds &lt;600 um fonctionnalités qui sont accessibles à superfusées liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné ( aCSF). Cette ex préparation VNO-AOB vivo permet l&#39;introduction de stimuli contrôlés dans le VNO par une canule mince, etun accès visuel direct à la petite AOB pour le placement des électrodes ciblée et / ou microscopie à fluorescence en direct. Ce procédé est avantageux si l&#39;on souhaite étudier ces circuits, en l&#39;absence d&#39;anesthésiques. Parce que cette approche rompt les connexions centrifuges, il n&#39;est pas bien adapté aux demandes de renseignements dans la modulation de la fonction centrifuge AOB. L&#39;ex préparation VNO-AOB vivo est difficile à apprendre, mais une fois atteint produit une plate-forme fiable sur laquelle enquêter sur l&#39;organisation du circuit, le traitement de l&#39;information, et la plasticité neuronale dans ce circuit sensoriel puissant.

<table><tbody><tr><td>Ciseaux droits</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins-Outils scientifiques</td><td>fins</td><td>droits 14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins-Outils scientifiques fins incurvés</td><td></td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinces Adson</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>#3 Poignée de scalpel</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>#11 Lames de scalpel</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120030</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir droites en acier au carbone</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-21</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de dissection</td><td>Custom&nbsp ;</td><td>N/A</td><td>Voir Figure 1</td></tr><tr><td>Planche en plastique Delrin 0,6 cm x 1,5 cm x 0,1 cm Personnalisé</td><td>&nbsp ;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning Silicon Graisse</td> pour aspirateur <td>Fisher Scientific</td><td>146355D</td><td></td></tr><tr><td>#5 Pinces,</td><td>Student Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>#5 Pinces, Biologie Tip</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>#5 Forceps, Student</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>1/16 » Mâle Luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-00</td><td></td></tr><tr><td>1/16 » Tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-171-129</td><td></td></tr><tr><td>Deux tonnes d’époxy</td><td>Grainger</td><td>5E157</td><td></td></tr><tr><td>ValveBank Kit de perfusion sous pression</td><td>AutoMate Scientific</td><td>09-16</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur numérique/manuel ValveLink</td><td>AutoMate Scientific</td><td>01-18</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>divers</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>divers</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 dihydratés</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>divers</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 hexahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>divers</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>divers</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>divers<</td><td></td></tr><tr><td>em>myo-inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>divers</td><td></td></tr><tr><td>Na-pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>divers</td><td></td></tr><tr><td>Na-ascorbate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>divers</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>divers</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>divers</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo préparatifs de l&#39;ampoule vomeronasal organes et accessoire olfactive intact

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Le système olfactif accessoire de la souris (AOS) est une voie sensorielle spécialisé pour détecter les odeurs non volatiles sociaux, les phéromones, et kairomones. Le premier circuit de neurones dans la voie AOS, appelé le bulbe olfactif accessoire (AOB), joue un rôle important dans l&#39;adoption de comportements sexuels typiques tels que l&#39;agression territoriale et l&#39;accouplement. Ce petit (&lt;1 mm 3) circuit possède la capacité de distinguer des états comportementaux uniques, tels que le sexe, la souche et le stress à partir d&#39;indices chimiosensoriels dans les sécrétions et des excrétions de leurs congénères. Bien que l&#39;organisation de ce système compact offre des possibilités uniques pour l&#39;enregistrement de grandes portions du circuit simultanément, l&#39;enquête du traitement sensoriel dans le AOB reste difficile, principalement en raison de son emplacement expérimentalement désavantageuse dans le cerveau. Ici, nous démontrons une dissection multi-étape qui élimine l&#39;AOB intacte à l&#39;intérieur d&#39;un seul hémisphère du crâne de souris antérieure, laissant connecterions à la fois les voméronasal périphérique neurones sensoriels (VSN) et circuits neuronaux locale intactes. La procédure expose la surface de AOB pour diriger l&#39;inspection visuelle, ce qui facilite les enregistrements électrophysiologiques et optiques à partir des éléments de circuit AOB en l&#39;absence d&#39;anesthésiques. Lors de l&#39;insertion d&#39;une canule fine dans l&#39;organe voméronasal (VNO), qui abrite les VSN, on peut exposer directement la périphérie des odeurs et des phéromones sociaux tout en enregistrant l&#39;activité en aval dans la AOB. Cette procédure permet enquêtes contrôlées dans AOS traitement de l&#39;information, qui peuvent faire la lumière sur les mécanismes reliant l&#39;exposition à la phéromone à des changements de comportement.

Atteindre le succès avec cette préparation prend beaucoup de pratique, et a plusieurs étapes à laquelle il peut échouer. On devrait s'attendre à exiger de nombreuses tentatives avant de parvenir à la réussite. La chambre de dissection personnalisé est nécessaire pour la réussite de ce protocole, et doit être obtenue avant de commencer les étapes ultérieures de la dissection. La conception de la chambre présentée sur la figure 1 est suffisante à cette fin, et peut être réalisé en matière plastique relati...

L&#39;ampoule accessoire olfactif de la souris (AOB) a été difficile à étudier dans le contexte du codage sensoriel. Ici, nous démontrons une dissection qui produit in vivo préparation ex dans laquelle les neurones AOB restent fonctionnellement connectées à leurs entrées périphériques, ce qui facilite la recherche en traitement de l&#39;information des phéromones de souris et kairomones.

Ex Vivo préparatifs de l&#39;ampoule Vomeronasal organes et accessoire olfactive Intact

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

L’objectif global de cette procédure est de produire une préparation ex vivo de l’organe nasal de souris fonctionnellement connecté, ou VNO, un bulbe olfactif accessoire, ou un OB. Pour ce faire, il faut d’abord effectuer une dissection grossière du crâne de la souris afin d’isoler un seul hémisphère du museau et du bulbe olfactif. Dans la deuxième étape, les axones délicats du VNO et un OB sont exposés par une dissection secondaire dans une chambre de perfusion tissulaire. Enfin, une fine canule est insérée dans le VNO à travers laquelle l’odeur et le stimulus peuvent être introduits.En fin de compte, les enregistrements électrophysiologiques peuvent être utilisés pour mesurer l’activité neuronale au sein de l’OB A pendant la stimulation VNO. L’avantage de cette technique par rapport aux techniques existantes comme l’électrophysiologie en coupe in vitro, c’est qu’avec cette technique, l’organe sensoriel et les circuits neuronaux en aval restent fonctionnellement connectés. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car il existe de nombreuses étapes de dissection délicates qui sont difficiles à apprendre, et parce que des erreurs sur l’une de ces étapes peuvent en

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Multiélectrodes array (MEA) enregistrements fournissent une méthode pour étudier l'activité électrique des grandes populations de neurones. Ici, nous présentons les détails d'une préparation de la MEA pour enregistrer à partir de l'épithélium de souris voméronasal tout en stimulant le tissu.

Enregistrements tableau multiélectrodes de l&#39;épithélium Vomeronasal

Chez la souris, la capacité à détecter des phéromones est principalement médiée par l'organe voméronasal (VNO). Ici, une préparation tissulaire aiguë tranche de VNO pour effectuer l'imagerie calcique est décrite. Cette approche permet des observations physiologiques des sous-populations et / ou des neurones individuels dans un tissu vivant et est commode pour récepteur-ligand d'identification.

Imagerie phéromones détection dans une souris Vomeronasal tissus Préparation Trancher aiguë

L'organe voméronasal (VNO) détecte des signaux chimiques intraspécifiques qui transmettent des informations sociales et reproductives. Nous avons réalisé des expériences d'imagerie Ca2+ en utilisant des souris transgéniques exprimant G-CaMP2 dans le tissu du VNO. Cette approche nous permet d'analyser les schémas complexes de réponse des neurones voméronasaux à un grand nombre de stimuli de phéromones.

Réponses d&#39;imagerie neuronale dans les préparations d&#39;organe voméronasal Slice Exprimant un capteur de calcium codées génétiquement

Cette vidéo décrit l’isolement d’un organe voméronasal (VNO) de souris et la préparation des tissus pour la section du vibratome. Les coupes sont utilisées pour caractériser les attributs biophysiques et physiologiques d’un groupe spécifique de neurones sensoriels.

Préparation de l’organe voméronasal de souris pour la section du vibratome

Cette vidéo démontre l’enregistrement électrophysiologique des neurones sensoriels olfactifs (OSN) chez la souris à l’aide d’une technique de patch-clamp perforé. L’épithélium olfactif, contenant des OSN avec des récepteurs olfactifs marqués au fluorophore, est isolé d’une souris et fixé dans une chambre d’enregistrement. Une pipette d’enregistrement est fixée au bouton dendritique d’un OSN, et la nystatine à l’intérieur de la pipette perfore la membrane pour former une connectivité électrique...

ENREGISTREMENT PAR PATCH-CLAMP PERFORÉ DE NEURONES SENSORIELS OLFACTIFS CHEZ LA SOURIS

La vidéo du protocole décrit la mise en place d’un patch clamp de cellule entière pour l’enregistrement électrophysiologique des neurones sensoriels de l’organe voméronasal (VNO) chez la souris. Une tranche coronale de VNO avec des neurones sensoriels marqués par fluorescence est placée dans une configuration d’enregistrement. Un neurone marqué est patché à l’aide d’une pipette d’enregistrement dans une configuration de cellule entière pour l’enregistrement électrophysiologique en réponse à des...

Mise en place d’une pince de patch de cellule entière pour l’enregistrement électrophysiologique à partir de neurones sensoriels voméronasaux

Un désossage méthode manuelle en vigueur pour préparer Intact souris tissu nasal avec l&#39;organisation anatomique préservée

L’analyse des propriétés physiologiques des neurones sensoriels olfactifs se heurte encore à des limites techniques. Ici, nous les enregistrons à l’aide d’un patch-clamp perforé dans une préparation intacte de l’épithélium olfactif chez des souris ciblées par des gènes. Cette technique permet de caractériser les propriétés membranaires et les réponses à des ligands spécifiques de neurones exprimant des récepteurs olfactifs définis.

Perforé patch-clamp enregistrement des souris neurones sensoriels olfactifs dans neuroépithélium Intact: Analyse fonctionnelle des neurones exprimant un récepteur odorant Identifié

Ici, nous décrivons une approche physiologique qui permet l’identification et l’analyse approfondie d’une population définie de neurones sensoriels dans des coupes aiguës de tissu coronal de l’organe voméronasal de souris à l’aide d’enregistrements patch-clamp de cellules entières.

En profondeur Physiological Analyse des populations de cellules définies dans le tissu Tranches aiguë de l&#39;Vomeronasal Organ Souris

Les neurones sensoriels olfactifs expriment une grande variété de molécules de tri d'axones pour établir des circuits neuronaux appropriés. Ce protocole décrit une méthode de coloration immunohistochimique pour visualiser les expressions combinatoires des molécules de tri d'axones aux extrémités axonaires des neurones sensoriels olfactifs.

Immunomarquage quadruple de l&#39;ampoule olfactive pour la visualisation des codes d&#39;identité moléculaire des axes sensoriels olfactifs

Cet article fournit un protocole simplifié pour la dissection et la dissociation de l’épithélium olfactif murin à des fins de séquençage de l’ARN à noyau unique.

Dissection rapide et dissociation de l’épithélium olfactif de souris pour des suspensions à noyau unique

Découvrez une préparation ex vivo de la bulbe olfactif accessoire de souris maintenant la connectivité fonctionnelle avec l'organe voméronasal. Cette méthode permet d'étudier le codage sensoriel des phéromones par électrophysiologie.

Ex Vivo préparatifs de l'ampoule Vomeronasal organes et accessoire olfactive Intact

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