La combinaison de tri magnétique des cellules mères et Tests de fluctuation à Analyser instabilité du génome cours mitotique vieillissement cellulaire dans Saccharomyces cerevisiae

L’objectif général de l’expérience suivante est de déterminer si les fréquences de mutation changent avec l’augmentation de la réplication L’âge des cellules de levure est dû simplement à des cycles supplémentaires de division cellulaire ou à des changements spécifiques à l’âge dans les taux d’accumulation de mutations. Ceci est réalisé en mesurant d’abord les fréquences et les taux de mutation dans les cellules jeunes en répartissant les cellules sur des milieux sélectifs et non sélectifs afin de calculer une fréquence de mutation prédite pour les cellules d’âges croissants en raison de l’accumulation de mutations à chaque cycle de division cellulaire.

Ensuite, une population de cellules de levure est marquée avec de la biotine cultivée en culture liquide et les cellules marquées d’origine sont récupérées par tri magnétique pour obtenir des cellules mères âgées qui ont subi plusieurs divisions cellulaires. Ensuite, les cellules mères âgées sont soit repoussées pour augmenter leur âge, puis triées à nouveau, soit colorées pour les cicatrices des fesses, puis étalées sur des milieux sélectifs et non sélectifs afin de déterminer leur âge réplicatif moyen et des résultats de fréquence de mutation sont obtenus qui montrent s’il y a des augmentations ou des diminutions spécifiques à l’âge des mutations accumulées sur la base d’une comparaison de la fréquence de mutation observée expérimentalement à la fréquence de mutation prédite pour les cellules de la Âge moyen observé. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du vieillissement, telles que les changements dans les taux d’accumulation des dommages génétiques contribuent-ils au vieillissement normal, ou les effets modifiant la durée de vie de divers facteurs génétiques et environnementaux, en partie dus à des changements dans les taux de mutation.

Melissa Patterson, une étudiante diplômée de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure afin d’établir un taux de mutation de base par génération de cellules à l’aide de tests de fluctuation pour des cellules cultivées dans des conditions de culture standard. Pour chaque culture répétée, diluez les cellules de une à 2000 et épandez un à quatre microlitres sur un milieu non sélectif pour déterminer les unités formant colonies par millilitre. Granulez les cellules restantes à 2 400 G pendant une minute dans une micro-centrifugeuse et utilisez 100 microlitres d’eau pour les remettre en suspension avant de les étaler sur un milieu sélectif pour identifier les mutants.

Après avoir incubé les plaques à 30 degrés Celsius pendant trois jours, comptez les colonies et déterminez le taux et la fréquence de mutation initiaux selon le protocole d’accompagnement pour étiqueter charmy CCI avec de la biotine Commencez par strier la culture d’un stock de glycérol sur un milieu YPD et incubez à 30 degrés Celsius pendant un à trois jours. À l’aide d’une pointe de pipette stérile, transférez les cellules de la plaque dans au moins un millilitre d’eau. En gardant à l’esprit qu’un à un centimètre et demi d’une partie épaisse de la traînée donnera environ 10 aux huit cellules.

Utilisez un hémocytomètre pour déterminer la densité cellulaire exacte pour chaque souche ou condition de traitement. Utilisez un stock de réactifs de biotine de cinq millimolaires pour étiqueter 10 à huit cellules par point de collecte conformément à la procédure standard du fabricant. Effectuez toutes les étapes de centrifugation pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius après le lavage final.

Utilisez de l’eau pour suspendre les cellules marquées à une concentration finale de 10 à huit cellules par millilitre pour vérifier la viabilité cellulaire pour diluer 10 microlitres de cellules avec 23 microlitres d’eau et 67 microlitres de bleu triam à 0,4 % dans un XPBS, incubez les cellules pendant 40 minutes à température ambiante avant d’utiliser un hémocytomètre pour noter les cellules vivantes ou non colorées et les cellules mortes ou colorées. Après avoir mesuré les valeurs de référence pour l’âge cellulaire et la fréquence des mutations, conformément au protocole de texte, transférez les cellules marquées à la biotine dans 20 millilitres de milieu YPD. Faites semblant d’avoir les huit cellules.

Cultivez les cultures pendant 16 à 18 heures à 20 degrés Celsius jusqu’à environ 10 à huit cellules par millilitre. Ne laissez pas les cellules atteindre la phase stationnaire et, si nécessaire, maintenez les cellules à quatre degrés Celsius pendant plusieurs heures pour optimiser le moment de la période de croissance et de collecte. Après avoir déterminé la densité cellulaire et granulé les cellules à quatre degrés Celsius, lavez les cellules en ajoutant 30 millilitres de marquage de billes, de tampon et de vortex, puis faites tourner la suspension et versez le surnageant.

Après un deuxième lavage, nous suspendons les cellules dans 50 microlitres de tampon d’étiquetage des billes. Imaginez les huit cellules totales en vortexant. Ajoutez deux microlitres de billes magnétiques, faites semblant aux huit cellules totales et après avoir vortex, incubez brièvement sur de la glace pendant 10 minutes en inversant périodiquement.

Ensuite, utilisez 30 millilitres de tampon d’étiquetage pour laver les cellules trois fois. Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de tampon d’étiquetage des billes. Faites semblant d’avoir les huit cellules au total et faites brièvement vortex la pastille sur un réglage moyen jusqu’à ce que les cellules soient remises en suspension.

Versez la suspension à travers une crépine de 40 microns dans un tube de 50 millilitres pour éliminer tous les amas de cellules restants. Au besoin, laissez les cellules sur la glace pendant une à deux heures avant de les charger sur la colonne. Suivez le protocole recommandé par le fabricant pour les colonnes magnétiques en utilisant jusqu’à deux fois 10 à neuf cellules au total par.

Prenez soin d’enlever tout aérable lors du chargement des colonnes et de retirer et de replacer la colonne sur le séparateur entre les lavages pour éviter que les cellules ne se coincent entre les billes. Lorsque vous utilisez des séparateurs à plusieurs colonnes pour traiter plusieurs colonnes du même échantillon, éluez-les toutes dans le même tube de collecte afin de réduire le temps de manipulation et de diminuer la perte de cellules si vous le souhaitez. Conservez le flux des étapes de liaison et de lavage pour analyser les jeunes cellules produites par les cellules mères après avoir concentré les cellules par centrifugation à 3000 Gs pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, aspirez tout sauf un millilitre de tampon.

Faites semblant d’avoir les huit cellules originales marquées à la biotine. Ensuite, faites un bref vortex pour suspendre les cellules dans le tampon restant. Utilisez du triam blue pour colorer une aliquote de cellules diluées et utilisez un hémocytomètre pour déterminer la densité et la viabilité des cellules.

Calculez ensuite le nombre total de cellules récupérées. Si le nombre de cellules est nettement plus élevé que prévu, faites passer l’échantillon d’élution dans une autre colonne pour essayer d’éliminer les jeunes cellules contaminantes. Si le nombre de cellules est nettement inférieur à celui prévu, transmettez le flux enregistré.

Échantillonnez à travers une autre colonne pour essayer d’améliorer le rendement des cellules mères si vous le souhaitez. Faire repousser les cellules pour augmenter l’âge de réplication et suivre le marquage et le tri des billes sans marquage à la biotine. Pour déterminer l’âge réplicatif, transférez 25 microlitres de cellules récupérées dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre et utilisez un millilitre d’un XPBS pour laver les cellules deux fois afin d’étiqueter les cicatrices de bourgeons à la surface des cellules.

Utilisez 180 microlitres d’un XPBS et 20 microlitres de WGA conjugué par fluorescence pour remettre les cellules en suspension, couvrir le tube de centrifugation de 1,5 millilitre d’une feuille et incuber avec un léger balancement à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes après l’incubation. Utilisez un XPBS pour laver les cellules trois fois. Ensuite, pour la microscopie fluorescente, utilisez un réactif Antifa pour monter les cellules sur des lames afin d’éviter le mouvement des cellules pendant l’imagerie.

Durcissez complètement les lames dans l’obscurité jusqu’à quelques jours. Comptez les cicatrices des bourgeons sur au moins 50 cellules par échantillon pour obtenir une mesure représentative de l’âge cellulaire. Alternativement, après avoir suspendu les cellules d’un XPBS, effectuez une cytométrie en flux à l’aide des paramètres décrits dans le graphique de protocole textuel des cicatrices de bourgeons sur les jeunes cellules et les cellules d’âge comptées par microscopie sur l’axe Y par rapport à la moyenne géométrique normalisée de la fluorescence conjuguée WGA des mêmes populations cellulaires sur l’axe X.

Enfin, obtenez l’équation d’une droite de tendance linéaire pour cette relation Pour le substitut suivant, la moyenne géométrique normalisée de l’intensité de fluorescence conjuguée WGA d’une population cellulaire pour X dans l’équation et résolvez pour Y pour déterminer l’âge cellulaire moyen d’un échantillon. Ce graphique illustre que le taux de mutation dans le gène Can One était similaire avant et après le marquage de la biotine Dans les populations de jeunes levures indépendantes, les fréquences de mutation étaient également similaires dans les jeunes cellules avant et après le marquage de la biotine lorsqu’elles étaient cultivées à 20 degrés Celsius ou 30 degrés Celsius. Le graphique présenté ici montre ce que l’on peut observer lors du comptage des cellules récupérées après le marquage à la biotine et du tri des cellules non traitées ou des cellules traitées avec un peroxyde d’hydrogène millimolaire après le premier tri.

Le nombre de cellules peut apparaître plus élevé que prévu après le premier tri, et une petite perte progressive de cellules est attendue avec un tri continu. L’âge réplicif a été déterminé par comptage manuel des cellules marquées par fluorescence, mais les cicatrices sur les cellules sont comme le montre cette figure. Le signal fluorescent mais cicatriciel de la cytométrie en flux a été comparé à des comptages manuels pour obtenir une relation linéaire qui permet de déterminer l’âge réplicatif des populations de cellules mères et de cellules témoins par cytométrie en flux.

Ces graphiques montrent des exemples de fréquences de mutation observées similaires ou élevées de cellules mères âgées par rapport aux fréquences prédites calculées à partir de l’âge moyen des cellules mères et des fréquences et taux de mutation obtenus pour les populations de cellules jeunes. En fonction de l’emplacement génomique de la boîte un gène Suite à cette procédure. D’autres méthodes peuvent être utilisées, comme la coloration des espèces réactives de l’oxygène ou de la morphologie oculaire, pour répondre à des questions supplémentaires telles que les changements dans la physiologie cellulaire associés aux changements liés à l’âge dans l’accumulation de mutations.