Name: Injection virale intracérébro du cerveau de souris nouveau-né pour la transduction neuronale persistante et généralisée (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Découvrez l'injection virale intracérébroventriculaire chez la souris nouveau-née pour une transduction neuronale persistante et généralisée. Cette méthode utilise l'AAV pour obtenir une expression transgénique à vie dans le cerveau.

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Cette recherche a été soutenue par la Fondation de la famille Robert A. et René E. Belfer, le AG038856 R21 du NIA (JLJ), la subvention de recherche sur la maladie d’Alzheimer A2010097 de la Fondation BrightFocus (JLJ) et la subvention de formation T32 du AG000183 de la biologie du vieillissement du NIA (soutien aux ODD).

Effectuer toutes les procédures et protocoles impliquant des animaux conformément aux National Institutes of Health Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. Les procédures décrites ici ont été examinés et approuvés par le Baylor College of Medicine institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité. virus adéno-associé (AAV) vecteurs de réplication incompétent pour la livraison du transgène dans le cerveau de rongeurs sont approuvés pour le niveau de biosécurité 1 utilisation. Consultez le site Web CDC pour la publication du gouvernement américain &quot;prévention des risques biotechnologiques en microbiologie et biomédicales Laboratories (BMBL)&quot; qui détaille les exigences spécifiques concernant les procédures de protection et de transport de virus appropriés. Vérifiez auprès du personnel de sécurité vétérinaire et environnementale locale pour connaître les exigences spécifiques de procédures institutionnelles pour utilisant des virus. Règlement concernant les pièces de la procédure, la quarantaine, et l&#39;identification des cages de risque biologique varient selon les institutions. 1. Prépare P0 chiots et Foster mères <ol><li> Fournir haute chow de graisse pour toutes les femmes enceintes et allaitantes de soutenir les besoins énergétiques de la reproduction et la lactation. </li><li> Dans la soirée, mettre en place une cage d&#39;élevage en ajoutant une ou deux femelles en bonne santé à la cage d&#39;un mâle résident unique. Le lendemain matin, vérifiez les femmes pour une prise d&#39;accouplement et de séparer les femmes des hommes, si une prise est présente. <ol><li> Utilisez mères adoptives pour élever les petits à partir d&#39;un fond génétique avec les caractéristiques maternelles pauvres (par exemple, C57BL / 6 ou C3HeJ). Mères adoptives acceptent chiots d&#39;une autre portée si les chiots sont nés transférés dans les quatre jours de la litière propre de la mère nourricière. </li><li> Mettre en place une cage d&#39;accouplement séparé à l&#39;aide ICR femelles ou FVB à côté des éleveurs expérimentaux, afin que les deux groupes de femmes accouchent à peu près au même moment. </li></ol></li><li> Les femelles livrer dans 19 ± 1 jours à compter de la date de la prise, en fonction de la souche de fond. Trois jours avant dIVRAISON (16 jours après la date de prise), placer la femme enceinte dans une cage propre avec du matériel de nidification frais et un abri couvert. </li><li> Vérifiez nouveaux-nés deux fois par jour à partir 2 jours avant la date prévue de l&#39;accouchement (17 jours après la date de prise). Examinez la cage avec un minimum de stress pour les mères en regardant à travers le fond de la présence de nouveau-nés roses. Souris délivrent des petits le matin, mais en de rares occasions prononcera dans l&#39;après-midi. </li><li> Planifiez à pratiquer des injections dès que les chiots sont allaitent (qui sera évident par les taches de lait visibles), ou dans les 6 heures de la naissance, selon la première éventualité. </li></ol> 2 Préparer l&#39;équipement pour injection <ol><li> Préparer une seringue d&#39;injection de 10 pi avec une aiguille de 32 G pour les nouveau-nés généraux P0. Si vous effectuez injection stéréotaxique, monter la seringue dans le bras manipulateur. </li><li> Si vous utilisez un cadre stéréotaxique pour préparations injectables, refroidir le stade néonatal à 4-8 ° C en ajoutant 100% ethanet d&#39;utilisation de la neige carbonique dans le réservoir à l&#39;extrémité avant du bloc. Maintenir la température au-dessus de 1 ° C pour éviter les gelures des chiots. </li></ol> 3 Préparer les dilutions virales pour injection <ol><li> Préparer un trypan solution de colorant bleu de 1% (20x stock). </li><li> Préparer des aliquotes 5-25 ul de virus adéno-associé (AAV) de bouillon dans une enceinte de sécurité biologique de classe 2. Placez ces aliquotes à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. Eviter les cycles de congélation-décongélation supplémentaires que cela entraîne la transduction du virus à perdre leur efficacité. </li><li> Retirer une aliquote de l&#39;AAV de -80 ° C congélateur et placer sur la glace à dégeler. </li><li> Préparation de la solution pour injection virale par le virus de dilution dans une solution saline de phosphate de 1x glacée tamponnée (PBS). Commencer avec une dilution en série de dix fois (10 oct-10 août particules virales / hémisphère) pour l&#39;optimisation de la configuration initiale de transduction. </li><li> Ajouter 20x bleu trypan à la solution de l&#39;AAV à une concentration finale de 0,05%. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Mise en scène du nouveau-nés pour injection <ol><li> Placer une petite plaque d&#39;aluminium sur la glace pour refroidir. Placer une tâche chiffon sec sur le dessus de la plaque pour protéger la peau du chiot à partir du métal froid. Cela sert comme une surface froide plat pour anesthésier et injecter les chiots. </li><li> Préparer un coussin chauffant approprié pour garder souriceaux nouveau-nés au chaud avant et après l&#39;injection. </li><li> Une fois que les nouveau-nés ont commencé à infirmière, d&#39;éliminer environ la moitié d&#39;entre eux de la cage et laisser l&#39;autre moitié avec leur mère. Placez les petits recueillies sur le coussin chauffant en attendant injection. REMARQUE: Si la mère biologique ne se soucie pas pour les chiots, retirez la litière de la cage immédiatement et placer les chiots sur un coussin chauffant à attendre injection. Cette situation peut se produire avec la première portée née à C57BL / 6 femelles ou avec d&#39;autres souches consanguines qui ont des caractéristiques de reproduction pauvres. Dans cette situation, les taches de lait ne seront pas visibles sur nouveau-nés. </li><li>Transférer un chiot de la coussin chauffant sur la plaque de métal froid pour induire une hypothermie anesthésie. Attendez 2-3 min pour le chiot à devenir pleinement anesthésiés. Confirmez l&#39;anesthésie en pressant très doucement une patte et surveiller l&#39;absence de mouvement ou la respiration. </li></ol> 5. injection de l&#39;AAV à des souris nouveau-né <ol><li> Gratuit main d&#39;injection intracrânienne de l&#39;AAV à des souris nouveau-né: <ol><li> Charge 5 ul de AAV dilué avec 0,05% de bleu trypan dans la seringue d&#39;injection. </li><li> Essuyez doucement la tête du chiot anesthésié avec un coton-tige imbibé d&#39;éthanol à 70%. </li><li> Identifier les points d&#39;injection à 5.2 de la distance à partir de la suture lambda à chaque oeil. Site d&#39;injection de remplacement est située à environ 0,8 à 1 mm latéralement à partir de la suture sagittale, à mi-chemin entre le bregma et lambda. Ces points de repère sont visibles à travers la peau à P0. </li><li> Marquer le point d&#39;injection avec un stylo de laboratoire non-toxique. </li><li> Tenez la seringue avec l&#39;échelle visible pour moniveillance le volume de solution distribuée. </li><li> Assurez-vous que le pouce puisse atteindre le haut du piston. Ensuite, retirer le pouce du piston tout en positionnant l&#39;aiguille pour éviter accidentellement distribution virus. </li><li> Trouver une position confortable pour caler le bras pour injection en plaçant le coude sur le banc et se penchant sur le bras le seau à glace. </li><li> Placez le chiot sur le côté avec la tête directement sous la seringue. Tournez la tête du chiot afin que le site d&#39;injection marquée vers le haut, et doucement mais fermement tenir cette position avec une main ouverte. </li><li> En tenant la seringue perpendiculaire à la surface du crâne et introduire l&#39;aiguille au niveau du site d&#39;injection marqué jusqu&#39;à une profondeur d&#39;environ 3 mm. Injecter l&#39;aiguille jusqu&#39;à ce que la résistance diminue légèrement, ce qui indique que l&#39;aiguille a pénétré dans le ventricule latéral. Si l&#39;on avait besoin d&#39;une référence, marquer 3 mm de la pointe de l&#39;aiguille avec machine non-toxique. Régler la profondeur d&#39;injection pour la taille de chiot et de la souche sur la base de colorant targeting des ventricules. </li><li> En tenant la seringue de façon rigide de sorte que le plongeur peut être enfoncé sans déplacer l&#39;aiguille plus loin dans le cerveau. Si l&#39;injection est déplacé dans le thalamus, la propagation virale sera sévèrement limitée. </li><li> Commencer l&#39;injection de virus lentement tout en surveillant le volume distribué à partir de la seringue. L&#39;administration d&#39;un volume maximal de 2 ul dans chaque ventricule. Si l&#39;aiguille est dans la position correcte, le colorant se propage à remplir le ventricule. </li><li> Retirer lentement l&#39;aiguille. </li><li> Laisser le premier site d&#39;injection avant l&#39;injection pour fermer l&#39;autre hémisphère. NOTE: Ne pas injecter le même site plus d&#39;une fois. Réinsérer le virus des forces de l&#39;aiguille qui a déjà été injecté à s&#39;échapper et cause un préjudice ou la mort du chiot. </li><li> Injecter le ventricule controlatéral en utilisant la même procédure. </li></ol></li><li> Injection stéréotaxique de l&#39;AAV à des souris nouveau-né: <ol><li> Charge 5 pi d&#39;AAV dilué avec 0,05% trypan int bleuo la seringue d&#39;injection a eu lieu par le manipulateur stéréotaxique. </li><li> Placez délicatement la tête du chiot entre les barres d&#39;oreilles de la trame du nouveau-né. Assurez-vous que la tête est au niveau de l&#39;axe Y (avant vers l&#39;arrière) en vérifiant que la ligne entre lambda et bregma est parallèle à la scène. Assurez-vous que la tête est au niveau de l&#39;axe des X (côté à l&#39;autre) en vérifiant que une ligne imaginaire entre les oreilles, ou une ligne entre les deux yeux, est parallèle à la scène. </li><li> Essuyez doucement la tête du chiot anesthésié avec un coton-tige imbibé d&#39;éthanol à 70%. </li><li> Utilisez le manipulateur stéréotaxique pour positionner la seringue au-dessus de lambda, puis zéro les coordonnées X et Y. Déplacez les bras stéréotaxiques à (X, Y) = (0,8, 1,5) mm pour bébés P0 standard. NOTE: taille de chiot et coordonnées stéréotaxiques peuvent varier selon la souche et l&#39;âge. Réglez coordonnées basé sur des injections de colorants nécessaires pour cibler les ventricules latéraux. </li><li> Abaissez lentement l&#39;aiguille dans le site d&#39;injection. La surface du crâne sera indent puis relâchez une fois l&#39;aiguille a pénétré dans la peau. Rétracter l&#39;aiguille jusqu&#39;à ce que le crâne retrouve sa forme concave normale, mais garder le biseau de l&#39;aiguille sous la peau. Zéro la coordonnée Z à ce point. </li><li> Insérer l&#39;aiguille jusqu&#39;à Z = -1,7 mm et puis se rétractent à -1,5 mm. </li><li> Lentement injecter le virus. Chaque hémisphère peut accepter jusqu&#39;à 2 pi de solution. </li><li> Conserver la seringue en place pendant 30-60 secondes après la fin de l&#39;injection, puis retirer lentement l&#39;aiguille sur 1-2 min. </li><li> Répétez l&#39;opération pour l&#39;hémisphère controlatéral, à l&#39;aide des coordonnées négatives sur l&#39;axe X pour le site d&#39;injection. REMARQUE: coordonnées alternatifs pour l&#39;injection sont (X, Y, Z) = (0,8, 2,0, -1,5) mm et (1.2, 1.0, -1.5) mm. Effectuer la première injection à (0,8, 2,0), puis passer à (0,8, -2,0), (1.2, 1.0) et enfin (1.2, -1.0). Injecter 1 pl de solution sur chaque site, pour un total de 2 pi par hémisphère. Déplacez-vous rapidement entre les injections pour terminer la procédure dans less à 10 min. </li></ol></li></ol> 6. post-injection de soins <ol><li> Après avoir terminé les injections dans les deux hémisphères, placez le chiot de retour sur le coussin chauffant jusqu&#39;à son retour de la couleur de la température du corps et de la peau à la normale et le chiot commence à se déplacer. </li><li> Si vous utilisez la mère biologique pour soigner les nouveau-nés injectés, retourner les chiots injecté à la mère biologique après qu&#39;ils récupèrent le mouvement normal. Placez les petits non-injecté restant sur le coussin chauffant. Répétez la procédure jusqu&#39;à ce que toutes les souris ont été injectées. </li><li> Si vous utilisez une mère d&#39;accueil pour soigner les nouveau-nés injectés, transférer tous les petits injecté à la mère d&#39;accueil pour les soins après qu&#39;ils récupèrent le mouvement normal. <ol><li> Enlever la plupart ou la totalité des chiots appartenant à la mère nourricière de la cage pour assurer le succès des animaux injectés. </li><li> Si les chiots de la mère adoptive et chiots injectés ont la même couleur de peau et des yeux, marquer chiots de la mère d&#39;accueil avec un stylo de laboratoire afin qu&#39;ils puissent êtredistinguer par la suite. </li><li> Placez les chiots de la mère nourricière et une partie de leur literie avec les chiots injectés. Veiller à ce que les chiots injectés acquérir l&#39;odeur de sa progéniture biologique afin d&#39;améliorer l&#39;acceptation des nouveaux chiots. </li><li> Placez seulement les chiots réinjecté dans la cage de la mère nourricière. Abattre des petits restants de la mère nourricière. </li></ol></li><li> Assurez-vous que la mère assiste à nourrir leurs petits et injectés dans les 10 min de les placer dans la cage. Si la mère ne recueille pas les chiots dans ce délai, le transfert à un autre chiots mère adoptive. </li><li> Étiqueter la cage avec une carte de risque biologique pour montrer qu&#39;il contient des animaux d&#39;origine virale injectés. Maison de la cage dans un endroit approuvé pour 72 heures. </li><li> Après la période de quarantaine de 72 heures, transférer la mère et les petits (mais pas de literie ou d&#39;autres articles de la cage) à une cage propre. Effectuez ce transfert dans une enceinte de sécurité biologique de niveau 2 pour éviter l&#39;exposition à toute la literie contaminés par un virus. ReTurn la cage propre avec les animaux injectés à l&#39;établissement régulier de la souris. </li><li> Placez la cage sale dans un sac de risque biologique, stériliser à l&#39;autoclave, puis retourner la cage pour le vivarium. </li></ol> 7 Nettoyage <ol><li> Placer la solution de virus restant à 4 ° C pour une utilisation ultérieure. Le virus conserve l&#39;efficacité de transduction pendant au moins 2 mois lorsqu&#39;elle est stockée à 4 ° C 8. </li><li> Désinfecter l&#39;aiguille d&#39;injection et une seringue avec 2% d&#39;agents blanchissants, suivi par des rinçages répétés dans de l&#39;eau désionisée. </li><li> Nettoyer la zone de travail avec 2% de l&#39;eau de Javel suivie par 70% d&#39;éthanol. </li><li> Collecter tous les objets jetables, y compris les embouts de pipette, tubes, masque et des gants dans un sac en plastique risque biologique. Éliminer les déchets conformément à la loi locale et les politiques institutionnelles (c.-à-autoclave ou incinérer). </li></ol> 8 Préparer cerveaux de souris pour l&#39;imagerie <ol><li> Passer une souris injectée dans une chambre de l&#39;euthanasie de dioxyde de carbone à 34 semaines après l&#39;injection. Suivez les directives institutionnelles pour les procédures d&#39;euthanasie appropriées. Ne pas perfuser les animaux avec du paraformaldéhyde comme cela éteindre l&#39;étiquette de fluorescence. </li><li> Retirer l&#39;ensemble des cerveaux de crâne et de fixer pour 3-12 heures dans du paraformaldéhyde 4% dans du PBS à 4 ° C. </li><li> Transférer le cerveau fixe à 30% de saccharose pour la cryoconservation. Incuber à 4 ° C jusqu&#39;à ce que le cerveau coule au fond. </li><li> Recueillir un seau de glace sèche finement broyée. Couper le cerveau en deux en bas de la ligne médiane. Enterrez les moitiés du cerveau dans la glace sèche à geler. </li><li> Refroidir le stade de microtome en ajoutant de la neige carbonique et de l&#39;éthanol à 100%. </li><li> Fixez le cerveau de la scène avec la ligne médiane vers le bas à l&#39;aide de PBS, et le gel. </li><li> Section à travers le cerveau à 30-45 um d&#39;épaisseur à l&#39;aide d&#39;un microtome de congélation coulissant. </li><li> Placer les articles dans des plaques à 24 puits contenant une solution d&#39;antigel (250 ml de glycerol, 300 ml d&#39;éthylène glycol, 500 ml de 0,1 M de tampon phosphate, pH 7,4). plaques de couverture wie papier d&#39;aluminium et conserver à -20 ° C pour une utilisation future. </li><li> Recueillir sections de 1-4 puits et laver 3x PBS. </li><li> Sections de montage sur des lames de microscope et lamelle. Laisser les lames sécher dans un endroit sombre. </li><li> Les diapositives d&#39;images à l&#39;aide de filtres appropriés pour YFP natif ou tdTomato pour vérifier le motif de transduction du virus. </li></ol>

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</ol>

Auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Nous avons décrit un procédé polyvalent pour la manipulation de l&#39;expression génique en utilisant des neurones AAV comme vecteur de livraison répandu dans le cerveau de souris nouveau-nés. Comparé à d&#39;autres méthodes de transgénèse neuronale tels que électroporation in utero ou une injection intracrânienne stéréotaxique 2,3, injection virale néonatale est relativement facile et simple. La procédure de base peut être réalisé en quelques minutes seulement avec un seau à glace et une seringue ...

Les méthodes traditionnelles pour modifier l&#39;expression des gènes de neurones ont besoin de temps et les manipulations de la lignée germinale coûteux. Alternative de novo approches comme dans l&#39;électroporation in utero ou injection stéréotaxique lentiviral donner des résultats plus rapides et moins coûteuses mais présentent l&#39;inconvénient de nécessiter une intervention chirurgicale complexe 1-3. En outre, l&#39;expression du transgène a une portée spatiale limitée avec ces méthodes. Ici, nous décrivons une méthode rapide, simple et économique pour la manipulation neuronale généralisée par injection intraventriculaire de virus adéno-associé (AAV) dans le cerveau de souris nouveau-nés. La méthode a été décrite par John Wolfe et Marco Passini en 2001, où ils ont suggéré petite taille de particule d&#39;AAV a permis de se diffuser dans le liquide céphalo-rachidien qui passe à partir des ventricules latéraux à travers la barrière épendymaire immatures et dans le parenchyme cérébral 4, 5. L&#39;injection intraventriculaire de l&#39;AAV à l&#39;intérieur de la fIRST 24 h après la naissance des rendements de transduction virale généralisée des sous-ensembles de neurones couvrant toutes les régions du cerveau, des bulbes olfactifs de tronc cérébral 6,7. Transgènes d&#39;origine virale livrés sont exprimés et active dans les jours suivant l&#39;injection et persistent jusqu&#39;à un an après la transduction. Ainsi, cette manipulation polyvalent permet des études allant du développement du cerveau postnatal précoce de vieillissement et la dégénérescence chez l&#39;adulte. En adaptant la technique à nos besoins expérimentaux spécifiques, nous avons mis l&#39;accent principalement sur ​​AAV8 sérotype car elle est la plus efficace pour transduire des neurones 6. Nous montrons que le titre viral peut être dilué pour contrôler la densité de neurones transduites pour essai de conséquences expériences cellulaires intrinsèques de manipulation génétique. De plus, nous démontrons que les deux virus peuvent être co-injectés pour produire des profils d&#39;expression qui sont sollicités vers des ensembles distincts de neurones ou qui se chevauchent, en fonction des sérotypes choisis pourencapsidation virale. Notre travail se développe la polyvalence de cette technique pour une utilisation dans un large éventail de paramètres de neurosciences expérimentales.

<table><tbody><tr><td>Souris consanguines ICR</td><td>Harlan</td><td>Hsd :ICR (CD-1)</td><td>Cette souche est également connue sous le nom de souris consanguines CD-1</td></tr><tr><td>FVB</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>1800</td><td>5-6 semaines</td></tr><tr><td>Nestlets</td><td>Lab Supply</td><td>NESTLETS</td><td></td></tr><tr><td>Shepherd shacks</td> Lab <td>Supply</td><td>SS-mouse</td><td></td></tr><tr><td>Chow de rongeurs à haute teneur en gras</td><td>Purina Mills</td><td>PicoLab Régime pour souris 20, #5058</td><td>Il s’agit de notre nourriture d’élevage standard</td></tr><tr><td>Chow pour rongeurs riches en matières grasses (alternative)</td><td>Harlan Laboratories</td><td>Teklad Global 19 % protéines rongeurs régime #2019S</td><td>Si faible en phytoestrogènes, un régime autoclavable est nécessaire</td></tr><tr><td>Seringue d’injection</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td>Seringue de 10 ml</td></tr><tr><td>Aiguilles d’injection</td><td>Hamilton</td><td>7803-04, RN 6PK PT4, 0,375"</td><td>32 G, pour injections standard P0</td></tr><tr><td>Plaque métallique pour cryoanesthésie</td><td>McMaster Carr</td><td>8975K439</td><td>Plaque en aluminium brut, 6 » x 12 », 0,25 » d’épaisseur, devra être coupée en 3 morceaux égaux et les bords poncés par un atelier d’usinage local</td></tr><tr><td>Appareil stéréotaxique pour petits animaux avec affichage numérique</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modèle 940</td><td></td></tr><tr><td>Porte-seringue universel avec pied de support d’aiguille</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modèle 1772-F1</td><td></td></tr><tr><td>Cadre néonatal</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td>Officiellement appelé adaptateur souris et rat nouveau-né</td></tr><tr><td>Sacs d’élimination des risques biologiques avec indicateur stérile</td><td>VWR</td><td>14220-030</td><td>Important ! &ndash ; Renseignez-vous auprès du personnel vétérinaire et de sécurité environnementale local pour connaître votre institut. s pour l’élimination des déchets à risque biologique</td></tr></tbody></table>

injection virale intracérébro du cerveau de souris nouveau-né pour la transduction neuronale persistante et généralisée

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Avec le rythme des progrès scientifiques accélérer rapidement, de nouvelles méthodes sont nécessaires pour neurosciences expérimentales de manipuler rapidement et facilement l&#39;expression des gènes dans le cerveau de la souris. Nous décrivons ici une technique introduite par Passini et Wolfe pour la livraison intracrânienne directe des transgènes d&#39;origine virale codée dans le cerveau de souris nouveau-né. Dans sa forme la plus simple, la procédure exige seulement un seau à glace et une seringue microlitre. Toutefois, le protocole peut également être adapté pour une utilisation avec des cadres stéréotaxiques d&#39;améliorer la cohérence de nouveaux chercheurs de la technique. Le procédé repose sur la capacité des virus adéno-associé (AAV) de se déplacer librement dans les ventricules cérébraux dans le parenchyme du cerveau tandis que le revêtement épendymaire est encore immature au cours de la première de 12 à 24 heures après la naissance. Injection intraventriculaire de l&#39;AAV à cet âge, les résultats dans la transduction généralisée des neurones dans le cerveau. Expression commence dans les jours suivant l&#39;injection et persiste pendant la lifetime de l&#39;animal. Titre viral peut être réglé pour contrôler la densité de neurones transduites, tandis que la co-expression d&#39;une protéine fluorescente fournit une étiquette vital de cellules transduites. Avec la disponibilité croissante des installations de base virales pour fournir des réactifs à la fois hors-the-shelf, pré-emballés et préparation virale coutume, cette approche offre une méthode opportune pour la manipulation de l&#39;expression des gènes dans le cerveau de la souris qui est rapide, facile et beaucoup moins coûteux d&#39;ingénierie traditionnel de la lignée germinale.

Le succès d'injection intraventriculaire rendement viral d'expression généralisée et robuste neuronale. Ici, nous avons évalué la transduction virale utilisant YFP ou tdTomato gènes fluorescents sous le contrôle du promoteur de la bêta de poulet de l'actine (promoteur de l'ABC). Ces constructions ont été emballés dans AAV8 et injecté dans les ventricules latéraux de souris (P0) ICR néonatales. Titres viraux élevés (10 à 10 particules par hémisphère) ont donné lieu à l'étiquetage dense du bulbe olfactif, le st...

Ici, nous démontrons une technique de transduction neuronale généralisée par injection intraventriculaire d’un virus adéno-associé dans le cerveau de souris néonatale. Cette méthode offre un moyen rapide et facile d’obtenir l’expression à vie des transgènes délivrés par le virus.

Injection virale intracérébro du cerveau de souris nouveau-né pour la transduction neuronale persistante et généralisée

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

L’objectif global de cette procédure est de transduire viralement les neurones dans tout le cerveau. Ceci est accompli par cryo-anesthésie des petits nouveau-nés, suivie du transfert du nouveau-né vers l’étape refroidie pour l’injection. Ensuite, identifiez le site d’injection pour cibler les ventricules latéraux entre la suture Lambda et chaque œil ou latéral de la suture sagittale à mi-chemin entre Lambda et Bgma.La dernière étape consiste à insérer l’aiguille à la bonne profondeur et à perfuser lentement jusqu’à deux microlitres de solution virale dans le ventricule latéral de chaque hémisphère. En fin de compte, une étiquette fluorescente ou une immunofluorescence pour le gène d’intérêt est utilisée pour montrer le modèle d’expression du transgène résultant de l’injection intraventriculaire. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette technique auront du mal à cibler avec précision les ventricules latéraux.Cette technique est démontrée à la fois par injection intracrânienne à main levée et par injection stéréotaxique, démontrant la technique à main levée sera faite par un autre post-doctorant dans mon laboratoire. Pour commencer, préparez une seringue d’injection de 10 microlitres avec une aiguille de calibre 32 pour les nouveau-nés postnatals généraux. Placez ensuite une petite plaque d’aluminium sur de la glace pour refroidir et placez une lingette sèche sur le dessus de la plaque pour protéger la peau du chiot du métal froid.Il s’agit d’une surface plane et froide pour l’anesthésie et l’injection des chiots. Ensuite, préparez un coussin chauffant adapté pour garder les souris nouveau-nées au chaud avant et après l’injection. Une fois que les chiots nouveau-nés ont commencé à téter, retirez environ la moitié d’entre eux de la cage et laissez l’autre moitié avec leur mère.Placez les chiots collectés sur le coussin chauffant en attendant l’injection. Transférez un chiot du coussin chauffant sur la plaque métallique froide pour induire l’hypothermie. Anesthésie. Attendez deux à trois minutes pour que le chiot soit complètement anesthésié.Confirmez l’anesthésie en serrant très doucement une patte et surveillez l’absence de mouvement ou de respiration gratuite. L’injection intracrânienne manuelle charge cinq microlitres de virus adéno-associé dilué, ou un A V avec 0,05 % de bleu de Trian dans la seringue d’injection. Essuyez doucement la tête du chiot anesthésié avec un coton-tige imbibé d’éthanol à 70 %.Identifiez les sites d’injection aux deux cinquièmes de la distance entre la suture lambda et chaque œil et le site d’injection alternatif est situé à environ 0,8 à un millimètre latéral de la suture sagittale à mi-chemin entre Lambda et Bgma. Ces repères sont visibles à travers la peau au jour zéro postnatal. Marquez le site d’injection avec un stylo de laboratoire non toxique.Tenez la seringue à l’aide d’une balance visible pour surveiller le volume de solution distribué. Assurez-vous que le pouce peut atteindre le haut du piston. Retirez ensuite le pouce du piston tout en positionnant l’aiguille.Pour éviter de distribuer accidentellement le virus, allongez le chiot sur le côté, la tête directement sous la seringue. Tournez la tête du P de manière à ce que le site d’injection marqué soit tourné vers le haut et doucement mais fermement. Maintenez cette position avec une main ouverte.Tenez la seringue perpendiculairement à la surface du crâne et insérez l’aiguille au site d’injection marqué à une profondeur d’environ trois millimètres. Injectez l’aiguille jusqu’à ce que la résistance diminue légèrement, indiquant que l’aiguille a pénétré dans le ventricule latéral. Commencez à injecter lentement le virus tout en surveillant le volume distribué par la seringue.Administrer un volume maximal de deux microlitres dans le ventricule. Retirez lentement l’aiguille. Laissez le premier site d’injection se refermer avant d’injecter l’autre hémisphère.Si l’aiguille est dans la bonne position, le colorant s’étalera pour remplir le ventricule. Refroidissez le stade néonatal entre quatre et huit degrés Celsius en ajoutant de l’éthanol à 100 % et de la glace sèche dans le réservoir. À l’extrémité avant de la serrure de bloc.Maintenez la température au-dessus d’un degré Celsius pour éviter les engelures des chiots. Chargez cinq microlitres de A a V dilué avec 0,05 % de bleu trian dans la seringue d’injection tenue par le manipulateur stéréotaxique. Plus tard, placez doucement la tête du chiot entre les barres d’oreille du cadre néonatal.Assurez-vous que la tête est de niveau dans l’axe Y en vérifiant que la ligne entre lambda et Bgma est parallèle à la platine. Assurez-vous que la tête est de niveau dans l’axe des x en vérifiant qu’une ligne imaginaire entre les oreilles ou une ligne entre les yeux est parallèle à la scène. Essuyez doucement la tête du chiot anesthésié avec un coton-tige imbibé d’éthanol à 70 %.Utilisez ensuite le manipulateur stéréotaxique pour positionner la seringue au-dessus de Lambda et zéro. Les coordonnées x et y. Déplacez les bras stéréotaxiques à une position de 0,8 millimètre sur le côté et de 1,5 millimètre en avant de la suture lambda ou du jour zéro postnatal standard des petits et abaissez lentement l’aiguille dans le site d’injection.La surface du crâne va s’indenter puis se libérer. Une fois que l’aiguille a pénétré la peau, rétractez l’aiguille jusqu’à ce que le crâne retrouve sa forme concave normale, mais gardez le biseau de l’aiguille sous la peau zéro. La coordonnée Z à ce stade.Insérez l’aiguille jusqu’à ce que Z soit égal à moins 1,7 millimètre, puis rétractez-la à moins 1,5 millimètre. Injectez lentement le virus. Chaque hémisphère peut accepter jusqu’à deux microlitres de solution.Gardez la seringue en place pendant 30 à 60 secondes après la fin de l’injection, puis rétractez lentement l’aiguille pendant une à deux minutes. Répétez l’opération pour l’hémisphère controlatéral en utilisant les coordonnées négatives dans l’axe des x pour le site d’injection. Après avoir terminé les injections dans les deux hémisphères, replacez le chiot sur le coussin chauffant jusqu’à ce que sa température corporelle et sa couleur de peau reviennent à la normale et que le chiot commence à bouger.Ensuite, retirez les chiots injectés restants dans le coussin chauffant et remettez les chiots injectés dans la cage après qu’ils aient récupéré un mouvement normal. Répétez la procédure jusqu’à ce que toutes les souris aient été injectées. L’injection virale intraventriculaire réussie donne des résultats généralisés et robustes.Les constructions du gène fluorescent de la tomate YFP ou TD ont été emballées dans un huit V et injectées dans les ventricules latéraux de souris néonatales. Des titres viraux élevés ont entraîné un marquage dense du bulbe olfactif, du striatum, du cortex cérébral, de l’hippocampe et du cervelet. Le marquage était également apparent dans les neurones cérébelleux de Purkinje, mais remarquablement absent des neurones granulaires cérébelleux qui ne sont pas encore présents en grand nombre au jour zéro postnatal.L’utilisation d’AA V huit dans une plage de concentration comprise entre 10 et 10 et 10 et 10 et 10 pour cent est un moyen facile et fiable de contrôler le degré de mosaïcisme transgénique produit par injection. Plusieurs transgènes peuvent être exprimés en co-injectant deux virus ou plus. La co-injection de deux virus emballés dans le même sérotype biaise la transduction résultante vers des populations neuronales qui se chevauchent, de sorte que de nombreuses cellules expriment les deux transgènes à des concentrations plus faibles.Les modèles d’expression deviennent plus indépendants et le pourcentage de cellules co-marquées est diminué. L’expression non chevauchante peut également être obtenue en injectant différents sérotypes a a v, co-injection d’AAV un et d’AAV huit. L’encodage de rapporteurs fluorescents distincts produit un motif largement indépendant de double mosaïcisme Une fois maîtrisé.Cette technique peut être complétée en cinq à 10 minutes par nouveau-né si elle est effectuée correctement.

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Découvrez l'injection virale intracérébroventriculaire chez la souris nouveau-née pour une transduction neuronale persistante et généralisée. Cette méthode utilise l'AAV pour obtenir une expression transgénique à vie dans le cerveau.

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