Immunodétection de la membrane externe de protéines par cytométrie en flux de mitochondries isolées

L’objectif principal de cette procédure est d’immuno-marquer les protéines d’intérêt sur la membrane mitochondriale du RE avec un anticorps de votre choix et de les analyser en même temps que la fonction mitochondriale. Pour ce faire, il suffit d’abord de prélever les tissus d’intérêt tels que le cerveau, la moelle épinière ou le foie d’un rat. La deuxième étape consiste à isoler les mitochondries du tissu, en l’occurrence la moelle épinière.

La moelle épinière est homogénéisée par une danse. L’homogénéisateur et d’autres organites et débris cellulaires sont éliminés par une série d’étapes de centrifugation jusqu’à ce qu’un palais mitochondrial brut soit atteint. La myéline, un contaminant majeur du tissu nerveux central, est éliminée en mélangeant les mitochondries avec une solution de préparation et de centrifusion à 12 %. Ensuite, les mitochondries isolées sont marquées avec un anticorps primaire de choix, suivi d’un anticorps secondaire conjugué à un Fluor.

La dernière étape consiste à ajouter des colorants fluorescents pour confirmer l’identité mitochondriale ou plutôt les paramètres fonctionnels. En fin de compte, la cytométrie en flux est utilisée pour montrer l’abondance relative des membranes alto mitochondriales dans la physiologie normale ou la maladie. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la microscopie est qu’elle permet un débit élevé et une quantification rapide de milliers de mitochondries individuelles.

Les animaux utilisés dans cette étude ont été traités en stricte conformité avec un protocole approuvé par le Comité institutionnel C-R-C-H-U-M pour la protection des animaux, qui suit les normes nationales décrites par le Conseil canadien de protection des animaux de l’air. Pour commencer cette procédure, placez une moelle épinière intacte entière prélevée sur un rat dans un homogénéisateur en verre de cinq millilitres contenant cinq volumes de tampon d’homogénéisation. Placez l’homogénéisateur en verre sur de la glace et homogénéisez le tissu à la main jusqu’à ce qu’il ne reste plus de gros morceaux de tissu, ce qui prendra environ huit coups.

Transférez l’homogénat dans deux ou trois microtubes de centrifugation et centrifugez à 1 300 fois G pendant 10 minutes de quatre degrés Celsius nous pipette ensuite Le surnageant S dans un tube ultracentrifuge de cinq millilitres. Ajoutez 750 microlitres de tampon d’homogénéisation au granulé et remettez doucement le granulé en suspension. Ensuite, centrifugez la suspension et remettez la pastille en suspension.

Deux fois de plus pour enlever les petits débris, tirez tous les surnageants dans le même tube d’ultracentrifugeuse de cinq millilitres, puis placez les tubes dans un rotor d’ultracentrifugeuse. Equipé de godets oscillants, centrifugez les tubes à 17 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Lorsque la centrifugation est terminée, conservez le surnageant pour un traitement ultérieur si la fraction cytosolique présente un intérêt.

Ensuite, mettez en suspension la pastille, qui est la fraction mitochondriale brute dans quatre millilitres de tampon d’homogénéisation contenant 50 millimolaires de chlorure de potassium centrifuge. Le granulé remis en suspension à 17 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius dans un rotor à godets oscillants, puis jette le supinate et remet doucement en suspension le granulé dans 800 microlitres de tampon d’homogénéisation dans un nouveau tube d’ultracentrifugation de cinq millilitres à exactement 800 microlitres du granulé remis en suspension. Ensuite, pipetez 200 microlitres d’iode dal aux 800 microlitres de granule remis en suspension pour créer une concentration finale de 12 % d’iode dal.

Mélangez doucement mais soigneusement le contenu du tube à l’aide d’une pipette P 1000, puis centrifugez à 17 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius dans un rotor à godets oscillant, aspirez la couche de myéline en haut du tube et jetez soigneusement le supinat car la palette peut être lâche. Resus suspend le granulé dans quatre millilitres de tampon d’homogénéisation. Ensuite, centrifugez votre gain à 17 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius dans un rotor à godets oscillants.

Jetez le supinate et le réus. Suspendre la pastille dans quatre millilitres de tampon d’homogénéisation. Ensuite, répétez à nouveau la centrifugation et retirez l’agent couché sur le dos.

Pliez le granulé final dans 100 à 200 microlitres de tampon d’homogénéisation et transférez-le dans un microtube de centrifugation de 1,7 millilitre. Déterminez la quantité de protéines dans chaque échantillon à l’aide d’un test standard de quantification des protéines, tel que le dosage de l’acide bionique ou BCA. Lors de la préparation des échantillons pour la quantification, diluer les échantillons et la courbe standard dans du sulfate de sodium à 2 % pour assurer une solubilisation adéquate des mitochondries.

Pour chaque mélange de coloration à tester, pipetez 25 microgrammes des mitochondries isolées dans un tube microcentri de 1,7 millilitre. Assurez-vous d’inclure un échantillon non coloré dans chaque expérience, ainsi qu’un contrôle isotypique approprié pour chaque centrifugeuse testée d’anticorps, chaque échantillon à 17 000 fois G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius dans une microcentrifugeuse de paillasse. Retirez ensuite le supinate et remettez en suspension les mitochondries isolées dans 50 microlitres de tampon mitochondrial.

Complété par 10 % de BSA sans acides gras, incubez la solution pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, puis ajoutez 20 microgrammes de l’anticorps primaire par millilitre de solution. Incuber les mitochondries isolées avec l’anticorps primaire pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer l’anticorps non lié, centrifuger chaque échantillon et jeter le natant en décubitus dorsal. Ensuite, remettez doucement la pastille en suspension dans 200 microlitres de tampon mitochondrial, puis répétez l’étape de centrifugation, jetez le natant en décubitus dorsal et remettez en suspension la pastille dans 50 microlitres de tampon mitochondrial.

Ajouter 0,5 microgramme de l’anticorps secondaire par millilitre d’échantillon. Ensuite, incubez les échantillons pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière. Lorsque l’incubation est terminée, centrifugez chaque échantillon et jetez le supinate qui contient l’anticorps secondaire non lié. Reese.

Mettez la pastille en suspension dans 200 microlitres de tampon mitochondriale et centrifugez l’échantillon. Encore. Retirez ensuite le supinate et le Reese. Suspendre la pastille dans 500 microlitres de tampon mitochondriale pour s’assurer que les événements observés sont bien des mitochondries.

Colorez l’échantillon avec un colorant fluorescent spécifique aux mitochondries tel que le MIT tracker green de Vitrogen pendant 15 minutes dans l’obscurité. Si aucune coloration supplémentaire n’est nécessaire pour étudier d’autres paramètres fonctionnels, transférez l’échantillon marqué dans un tube adapté au chargement dans un cytomètre en flux. Conservez les échantillons sur de la glace et passez à un cytomètre en flux pour l’acquisition afin de vérifier que les mitochondries isolées ont un potentiel transmembranaire intact colorer les mitochondries avec 100 bâtonnets de tétraéthyle nanomolaires domine ester méthylique pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité comme contrôle pour la coloration avec bâtonnet de tétraéthyle domine.

Colorer les mitochondries isolées avec 100 bâtonnets tétraéthyles nanomolaires domine ester méthylique en présence de 100 cyanure carbonyle micromolaire m chlorophénol HydroOne. Ce produit chimique est un découplement mitochondrial et dépolarisera les mitochondries pour vérifier que les mitochondries isolées produisent du superoxyde colorer les mitochondries avec un indicateur de superoxyde approprié tel que des chaussettes de mitoses rouges de in Vitrogen pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité comme contrôle de la production de superoxyde mitochondrial. Rester dans les mitochondries isolées avec colorant en présence de 10 micromolaires d’antimycine.

Une antimycine A est un inhibiteur du complexe trois de la chaîne respiratoire et augmentera la production de superoxyde mitochondrial avant le début de l’acquisition. Configurez l’instrument comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement. Mélangez ensuite les échantillons en tapotant doucement le tube, mais sans vortex.

Commencez à collecter les événements initiaux à basse pression pendant le gating. Assurez-vous de vous concentrer sur la population totale. Ensuite, ajustez les tensions des histogrammes en conséquence.

Le pic de l’échantillon non coloré correspond généralement à la deuxième décade. Ensuite, une fois que les vannes sont établies et que les échantillons sont en cours de traitement, passez la pression à la cytométrie à haut débit. L’analyse des préparations de la moelle épinière a révélé que 94 % des événements étaient positifs pour le colorant spécifique des mitochondries.

Dans cette expérience, 30 % des événements positifs pour les mitochondries ont été marqués avec un anticorps spécifique de la fusion MIT deux, qui est une protéine impliquée dans la fusion de la membrane externe des mitochondries. L’analyse du potentiel transmembranaire mitochondrial à l’aide de l’ester méthylique de tétraéthyle rumine a révélé que 95 % des mitochondries isolées ont un potentiel transmembranaire intact. Cette coloration s’est avérée spécifique car une diminution significative de la coloration a été observée lorsqu’elle est effectuée en présence d’une mitochondrie non fonctionnelle : les mitochondries produisent une quantité basale d’oxyde de SUP mesurée à l’aide d’un colorant perméable à la membrane.

Cela devient une réaction fluorescente P avec l’oxyde de SUP. Le traitement des mitochondries avec de l’antimycine A entraîne une augmentation d’environ 10 % de la production de superoxyde Une fois maîtrisé. Cette technique peut être réalisée en six à sept heures si elle est correctement exécutée.