Le titrage à haut débit de la luciférase-virus recombinants exprimant

Cet article présente une méthode basée sur l’expression de la luciférase à haut débit pour titrer divers virus à ARN et à ADN à l’aide de manipulateurs de liquides automatisés et manuels.

L’objectif général de l’expérience suivante est d’estimer les titres viraux d’un virus marqué à la luciférase à l’aide d’une méthode de quantification à haut débit. Ceci est réalisé en transférant le surnageant des échantillons à titer, ainsi qu’une courbe standard virale sur une lignée cellulaire permissive pour permettre l’expression de la luciférase. Dans un deuxième temps, RESA zurin peut être ajouté aux échantillons originaux, qui seront utilisés pour évaluer la viabilité cellulaire.

Ensuite, après un temps d’incubation approprié, le luciférien est ajouté aux cellules afin de quantifier par luminescence. Les résultats montrent la quantité de virus dans l’échantillon en fonction de l’expression de la luciférase. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le titttering de plaques, est qu’un grand nombre d’échantillons peuvent être traités rapidement et simultanément.

Cette méthode peut également être étendue aux virus exprimant la luciférase non claquante. Comme elle ne dépend pas de la formation de plaques, une lecture de la cytotoxicité cellulaire peut facilement être intégrée dans le flux de travail et peut être utile dans le contexte d’un dépistage de médicaments. Vanessa Ramia et Colin, trois étudiants diplômés de mon laboratoire, effectueront d’abord des infections en utilisant le VSP Delta 51 exprimant la luciférase Firefly en 96.

Eh bien, les surnageants des plaques de culture tissulaire de ces plaques seront titrés après un temps d’incubation approprié 24 heures avant le titrage. Préparez une suspension de cellules Vero à une concentration de 2,5 fois 10 à la cinquième cellules par millilitre dans du DMEM contenant 10 % de FBS 30 tas millimolaires et 1 % de pénicilline streptomycine C, 2,5 fois 10 à la quatrième cellule dans 96. Des plaques à fond plat solides et bien blanches à l’aide d’un distributeur de microplaques pour préparer la suspension des cellules, nettoyez une cassette distributrice de microplaques en rinçant le tube avec 50 millilitres d’eau stérile.

Remplissez ensuite les lignes de distribution de microplaques avec une suspension cellulaire, permettant à cinq millilitres de suspension cellulaire de s’écouler. Sélectionnez un programme qui distribuera 100 microlitres dans chaque puits d’une distribution de plaques à 96 puits à parois blanches et répétez l’opération si nécessaire pour des plaques supplémentaires. Ensemencez également quelques puits dans une plaque inférieure blanche claire de 96 puits pour vérifier la santé et la densité des cellules.

Lorsque vous avez terminé, rincez les cellules dans le récipient d’origine. Nettoyez la cassette en faisant couler 50 millilitres d’éthanol à 70 %, suivis de 50 millilitres d’eau chaude stérile à travers le tube. Ensuite, incubez les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone.

Préparer une courbe standard de VSV Delta 51 dans du DMEM libre de manière à ce que la concentration finale d’unités de plate-forme par millilitre après transfert sur les cellules Vero soit la suivante. Préparez 50 microlitres de chaque concentration par plaque de cellules Vero, plus 10 % supplémentairesLa courbe standard peut être transférée dans une plaque à 96 puits profonds. Ensuite, vérifiez les cellules Vero plaquées dans la plaque à 96 puits à fond transparent sous un microscope optique pour confirmer que les monocouches sont au moins 95 % de transfert trans confluent.

25 microlitres de surnageant d’échantillon sur les cellules Vero placées dans les plaques à paroi blanche à l’aide d’une pipette multicanaux à 12 canaux à 25 microlitres de chaque dilution de la courbe standard vers les cellules Vero dans les deux colonnes désignées. Centrifugez les plaques pendant cinq minutes à 430 G à température ambiante. Ensuite, incubez les plaques pendant cinq heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone.

À ce stade, ajoutez de la zurine en quantité égale à 10 % du volume de chaque puits de la plaque de 96 puits contenant le virus et les cellules. Après deux à quatre heures, lire et enregistrer le signal à l’aide d’un lecteur de plaques de fluorescence utilisant 530 à 560 pour l’excitation et 590 pour le rapport d’émission. Viabilité cellulaire de l’échantillon selon la formule suivante.

30 minutes avant la fin de l’incubation de cinq heures, préparez le Lucifer pour obtenir une solution de deux milligrammes par millilitre dans une solution saline tamponnée au phosphate stérile. Protégez la solution de la lumière après la période d’incubation de cinq heures à 25 microlitres de Lucifer dans chaque puits de cellules Vero dans les plaques solides blanches avec un distributeur automatisé intégré au luminomètre. Lisez les plaques avec les paramètres suivants.

Agitez pendant cinq secondes et attendez 30 secondes. Lisez la luminescence à une valeur d’exposition à sensibilité fixe appropriée, puis enregistrez et enregistrez l’intensité bioluminescente quantifiée. Si un distributeur automatisé a été utilisé pour ajouter du luciférien, percher le luciférien et amorcer les lignes avec de l’eau stérile ou des résultats précis, résolvez la régression non linéaire pour générer une équation de colline à partir des courbes standard.

Appliquez cette équation aux échantillons titrés pour calculer les unités d’expression virale. Les résultats d’une courbe standard typique de VSV Delta 51 sont présentés ici, ou l’analyse de régression non linéaire des paramètres a généré un graphique de grêle à partir duquel des unités de formation d’entrée inconnues peuvent être interpolées. Les titres viraux obtenus par test standard sur plaque sur des cellules Vero ont été comparés aux titres viraux calculés à partir des mêmes échantillons.

À l’aide du test de luciférase à haut débit, les échantillons proviennent d’une expérience où divers produits chimiques ont été utilisés pour améliorer la réplication et la propagation des cellules VSV Delta 51 et 7 8 6 0. La corrélation linéaire entre les titres et les unités d’expression virale avec un R au carré de 0,8083 et un score R de Pearson de 0,899 est illustrée ici. Les données typiques de cytotoxicité cellulaire obtenues à partir d’un test métabolique sont présentées ici pour 7, 8, 6, 0 cellules traitées avec des produits chimiques avant l’infection.

Avec le VSV Delta 51, les courbes standard typiques obtenues avec le virus de l’herpès simplex, le virus de la vaccine et le virus adéno-associé, tous exprimant la luciférase des luciférases, sont affichées ici. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour réaliser des criblages à haut débit de banques de composés en combinaison avec votre virus d’intérêt afin de générer des titres et des données de cytotoxicité. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de diluer correctement la courbe standard, car cela est essentiel pour interpoler les unités d’expression virale.

N’oubliez pas que travailler avec des virus vivants peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que travailler dans une enceinte de sécurité biologique et porter l’équipement de protection individuelle approprié doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’estimer les titres viraux à l’aide d’une méthode de quantification à haut débit basée sur l’expression d’une mesure de bioluminescence du transgène de la luciférase en interpolation d’unités d’expression virale inconnues. À partir d’un échantillon de courbe standard, la cytotoxicité peut être déterminée simultanément par un test de viabilité approprié.