Expression de protéines recombinantes pour la Biologie Structurale HEK 293F cellules en suspension: une approche nouvelle et accessible

L’objectif général de la vidéo suivante est de démontrer une technique simple et abordable pour produire un bon rendement de protéines ou de complexes protéiques à l’aide d’un système d’expression de mammifères. Ceci est réalisé en cultivant des cellules HEC 2 93 F en suspension dans un incubateur à agitation humidifié avec une atmosphère maintenue à 5 % de dioxyde de carbone. Dans un deuxième temps, les cellules sont transfectées transitoirement avec un ou plusieurs plasmides d’expression à nombre de copies élevé.

À l’aide de l’agent de transfection polyéthylène EIN ou PEI, les cellules ont été laissées se développer pendant 48 heures avant d’être récoltées. Ensuite, la purification des protéines est réalisée à l’aide d’une résine d’affinité, suivie d’une filtration sur gel pour purifier le complexe protéique d’intérêt afin de réaliser des études structurales et fonctionnelles. En fin de compte, ce système d’expression simple et abordable permet l’expression et la purification de protéines et de complexes protéiques difficiles à exprimer dans les cellules bactériennes.

Le principal avantage de cette approche est sa commodité et sa polyvalence pour l’expression de complexes protéiques. C’est presque aussi facile que de fabriquer des protéines dans des bactéries, d’autant plus que vous pouvez mélanger et assortir des vecteurs d’expression de protéines. La méthode peut initialement être utilisée à petite échelle pour tester l’expression de compresses de protéines, mais elle est facilement évolutive afin de produire un bon rendement de compresses de protéines. Pour les études structurelles et fonctionnelles, la clé du succès est de maintenir les cellules dans un état sain, exemptes de bactéries ou d’infections à levures.

Comme les antibiotiques dans les milieux réduisent considérablement votre rendement en protéines. Pour commencer, retirez de l’azote liquide un flacon cryogénique contenant un millilitre de cellules HEC 2 9 3 F à une densité de 20 millions de cellules par millilitre et décongelez-le rapidement dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Brisez les amas en pipetant de haut en bas et pipetez tout le contenu dans un flacon de culture cellulaire conique de 250 millilitres contenant 34 millilitres de milieu de préchauffage.

Placez la culture dans un incubateur à agitation orbitale humidifié à 37 degrés Celsius, 120 tr/min et 5 % de dioxyde de carbone après 48 heures. Vérifiez la viabilité cellulaire par le bleu trian. La coloration de la viabilité cellulaire normale à ce stade est d’environ 70 % lorsque les cellules auront atteint un nombre d’environ 1 million de cellules par millilitre.

Massez-les jusqu’à un comptage final de 0,35 million de cellules par millilitre dans un flacon de culture cellulaire conique de 250 millilitres contenant 60 millilitres de milieu préchauffé, continuez à masser les cellules toutes les 48 heures ou lorsqu’elles atteignent environ 2 millions de cellules par millilitre. Voici un échantillon de cellules de coloration bleue de Trian HEC 2 9 3 F à 2,3 millions de cellules par millilitre d’un stock prêt à être ensemencé pour la transfection Les cellules ne doivent être présentes que sous forme de cellules simples ou en division. Si les cellules sont envahies par la végétation, elles formeront de gros amas et auront une très faible viabilité, comme le montre cette image.

Si les cellules forment des amas, ceux-ci peuvent être brisés par un vortex vigoureux pendant 25 secondes. Pour commencer, les cultures à grande échelle ensemencent les cellules à raison d’un demi-million de cellules par millilitre dans un volume final de 300 millilitres dans chaque bouteille à roulettes d’un litre. Incuber pendant 24 heures dans un agitateur orbital humidifié à 37 degrés Celsius, 135 tr/min et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce que les cellules atteignent une densité de 1 million de cellules par millilitre.

Ensuite, pipetez un total de 300 microgrammes d’ADN stérilisé par filtre dans 30 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate ou PBS et vortex vigoureusement pendant trois secondes. Ajoutez ensuite 1,2 millilitre de 0,5 milligramme par millilitre. Filtrez l’IPE stérilisé à la solution PB SDNA et agitez vigoureusement pendant trois secondes supplémentaires.

Incuber le mélange à température ambiante pendant 20 minutes avant d’ajouter le mélange dans les cellules suivantes du lit. La transfection incube les cellules dans un incubateur à agitation orbitale humidifié pendant 48 heures supplémentaires à 37 degrés Celsius, 135 tr/min et 5 % de dioxyde de carbone après 48 heures. Récoltez les protéines intracellulaires en centrifugeant les cellules à 3000 fois G pendant cinq minutes.

Si la pastille cellulaire n’est pas destinée à une utilisation immédiate, elle peut être stockée à moins 80 degrés Celsius. Ce protocole est optimisé pour la purification des complexes protéiques du noyau dans lequel l’une des protéines a une étiquette de drapeau. Pour commencer la purification de la réanimation, suspendez la palette cellulaire dans environ 40 millilitres de lyse pré-refroidie, tampon par litre de culture, en utilisant une combinaison de pipetage de haut en bas plusieurs fois, et un sonicate d’homogénéisateur en verre pendant trois cycles de 15 secondes sur 15 secondes d’arrêt.

Ensuite, centrifugez vos 108 000 fois G pendant 25 minutes à quatre degrés Celsius et conservez le natant en décubitus dorsal. Ensuite, équilibrez 1,2 millilitres de résine d’aros tassée Anti-Flag par litre de culture en lavant trois fois avec un tampon d’équilibrage de résine incubez le supinate, qui représente l’extrait cellulaire entier avec la résine d’affinité dans un ou plusieurs tubes de centrifugeuse de 50 millilitres tournant doucement pendant 30 à 120 minutes de quatre degrés Celsius après l’incubation centrifugeuse à 3000 fois G pendant une minute à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le supinate, transférez la résine dans un tube à centrifuger de 15 millilitres et lavez-la avec un total de 45 millilitres de tampon pré-réfrigéré, une centrifuge avant, puis jetez le lavage et la centrifugation répétés du supinate à l’aide d’un tampon à haute teneur en sel, suivi d’un tampon à faible teneur en sel et d’un tampon de clivage TEV.

Assurez-vous que chaque lavage est suffisant pour remettre complètement la résine en suspension, mais pas plus. Ensuite, prélevez un échantillon de 10 microlitres de résine et diluez-le dans un volume de deux fois le tampon de charge protéique pour l’analyse afin de représenter l’échantillon de protéines lié. N’utilisez pas d’agents réducteurs car ils libéreront l’anticorps de la résine.

Ensuite, réinstallez la résine dans 10 millilitres de tampon de clivage TEV pré-refroidi à environ 40 microgrammes de protéase TEV par litre de culture originale et mélangez en inversant le tube plusieurs fois. Les niveaux de protéase TEV peuvent être optimisés en fonction de la quantité de protéine exprimée. Remplacez l’atmosphère du tube par de l’azote gazeux à 100 % pour éviter l’oxydation des protéines avant de tourner doucement pendant la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain.

Centrifugez l’échantillon à 3000 fois G pendant 10 minutes, puis transférez le supinate dans un filtre ultra-centrifuge avec une coupure de poids moléculaire appropriée et concentrez-vous jusqu’à 500 microlitres. Prélever un échantillon de 10 microlitres de protéine concentrée et diluer dans un volume de deux fois le tampon de charge protéique pour l’analyse. Cet échantillon représente l’échantillon d’éluat TEV.

Ensuite, prélevez un échantillon de 10 microlitres de résine et diluez-le en un volume de deux fois le tampon de charge de protéines. Cet échantillon représente l’échantillon de résine post-TEV. L’étape suivante consiste à faire passer la protéine à travers une colonne d’exclusion de taille et une matrice de filtration sur gel appropriée doit être utilisée en fonction de la taille du complexe d’intérêt.

Dans ce cas, nous avons utilisé une colonne de chromatographie d’exclusion de taille S 200 de 10 x 300 millimètres A, équivalant à la colonne de chromatographie d’exclusion de taille avec un tampon de filtration sur gel. Filtrez la protéine à travers un filtre de 0,22 micron et chargez l’échantillon dans la colonne. Procédez à la collecte des fractions au fur et à mesure qu’elles se détachent de la colonne.

Comme dernière étape, effectuez l’électrophérèse sur gel de poly acrylamide SDS ou la page SDS sur les échantillons collectés, ainsi que les fractions de filtration sur gel, l’histone DS SLA un ou HD un suppresseur de silençage défectueux trois ou SDS trois et syn trois, un domaine d’interaction HDAC ou syn trois, un HID forment un complexe tournant stable. La purification par affinité du complexe turny peut être observée via la page SDS. On voit ici le complexe purifié produit par le cot, traversant deux litres de cellules.

La voie protéique liée montre le complexe lié à la résine d’affinité. Après la digestion TEV, l’étiquette présente sur le péché trois A HID est clivée et le complexe est évoqué. La résine représentée ici est un chromatogramme du complexe protéique purifié à l’aide d’une colonne de chromatographie d’exclusion de taille S 200 de 10 x 300 millimètres.

Notez que le complexe pur échappe à proximité du volume du vide car il forme un dimère en solution. Enfin, l’analyse de la page SDS révèle la protéine purifiée dans les fractions de filtration du gel. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver, d’entretenir et de cultiver des cellules d’application HEC deux et trois, ainsi que de la façon d’affinité, de purifier et de concentrer vos protéines.

Complexe Les cellules saines seront essentielles pour le succès des expériences, alors assurez-vous qu’elles sont cultivées et maintenues dans leurs conditions et leur passage régulièrement. Ne vous laissez pas décourager par la culture tissulaire. Il est facile pour les biologistes structuraux d’exprimer et de purifier de grandes quantités de protéines et de complexes protéiques à partir de cellules de mammifères.