Un In Vitro Modèle pour l'étude de la physiopathologie cellulaire en cellules globoïdes Leucodystrophie

L’objectif global de cette procédure est de démontrer la transformation unique de la microglie en cellules GLO en présence de la toxine cycline. Ceci est accompli en enrobant d’abord les lamelles de recouvrement avec des protéines de matrice extracellulaire. Dans la deuxième étape, les cellules gliales sont plaquées sur les lamelles de recouvrement, puis des billes de cycline et de latex sont administrées aux cultures.

Dans la dernière étape, les cellules sont colorées par l’immunochimie. En fin de compte, les effets de la cycline sur la nucléation et la capacité phagocytaire des cellules microgliales peuvent être évalués par microscopie immunofluorescente. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’utilisation de lignées cellulaires microgliales, est que l’utilisation de cultures gliales primaires imite les interactions hypothétiques entre les astrocytes I et la microglie dans le cerveau d’individus atteints de leucodystrophie à cellules vides GLO ou GLD

Pour préparer les lamelles revêtues de matrice extracellulaire ou d’ECM, faites d’abord tremper des lamelles circulaires avec de l’acide chlorhydrique stérile dans une boîte de Pétri stérile. Après 30 minutes, lavez les lamelles trois fois avec de l’eau stérile, puis trempez-les dans de l’éthanol à 95 % pendant au moins 20 minutes. Après avoir laissé les lamelles sécher à l’air, ajoutez 150 à 250 gouttelettes de microlitres de matériaux d’enrobage protéique ECM dilués sur une feuille de paraforme répartissant les gouttelettes de manière à ce que les lamelles ne se chevauchent pas après la mise en place.

Ensuite, à l’aide d’une pince, placez délicatement une lamelle sur chaque gouttelette, puis placez le paraforme à l’intérieur d’un capot de culture cellulaire avec le châssis fermé après quatre à six heures, placez les lamelles de couverture ECM côté enduit vers le haut dans des puits individuels d’une plaque de 24 puits. Ensuite, lavez bien chaque fois avec du PB S3 stérile et conservez les lamelles à quatre degrés Celsius. Pour préparer les cellules gliales à être plaquées sur les lamelles, aspirez le milieu des cultures de cellules gliales, puis lavez doucement les monocouches trois fois avec 10 millilitres de PBS stérile.

Détachez les cellules avec huit à 10 millilitres de trypsine EDTA après cinq à 10 minutes. À 37 degrés Celsius, ajoutez 20 millilitres de milieu complet dans le ballon pour arrêter la réaction. Transférez ensuite la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres et faites tourner les cellules pendant 10 minutes.

À 300 g et à température ambiante, utilisez un P 1000 pour remettre doucement le palais en suspension dans deux millilitres de milieu frais et complet. Après le comptage, diluez les cellules à environ une fois 10 à la cinquième cellules par millilitre. Maintenant, plaquez 500 microlitres de cellules sur chacune des lamelles revêtues d’ECM.

Ajoutez un milieu complet frais supplémentaire dans chaque puits, puis incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq jours. Une fois que les cellules ont atteint la confluence souhaitée, ajoutez de la cycline fraîchement préparée dans chaque puits et faites tourner doucement la plaque de culture pour mélanger. Après une semaine de traitement à la cycline, collectez le milieu et fixez les cellules dans 500 microlitres de froid, 4 % de para formaldéhyde par puits à température ambiante.

Ensuite, lavez chaque puits trois fois avec du PBS et conservez les assiettes à quatre degrés Celsius. Pour visualiser les cellules GLO par immuno-chimie, remplacez d’abord le PBS par un tampon bloquant et incubez les cellules à température ambiante. Après une heure, incubez les cellules dans l’antisérum primaire contre le marqueur de la microglie IO un pendant au moins une heure à température ambiante, puis lavez chaque puits trois fois dans du PBS pendant cinq minutes.

Après avoir incubé les cellules avec l’anticorps secondaire conjugué à la fluorescence approprié, contre-colorez les cellules avec du DAPI pour identifier les noyaux. Ensuite, après avoir lavé les cellules comme nous venons de le démontrer, utilisez un support de montage pour monter chaque lamelle de recouvrement sur des lames de microscope individuelles et visualisez les lames sur un microscope à fluorescence pour une analyse visuelle et quantitative. Pour évaluer l’activité phagocytaire de la microglie traitée à la cycline après le traitement à la cycline, mais avant la fixation, ajoutez des billes de latex marquées FITC à chaque culture cellulaire G OID conformément aux instructions et au fabricant.

Après 48 heures, fixez les cellules dans le PFA comme nous venons de le démontrer, puis traitez les cellules pour l’immunochimie comme indiqué. Enfin, évaluez le nombre de microglies IBO positives qui se localisent avec les billes marquées par fluorescence par microscopie à fluorescence immunochimique. La coloration de la microglie à l’aide d’IO one en conjonction avec une contre-coloration nucléaire permet l’identification de grandes cellules multinucléées arrondies.

Notons que dans de nombreux cas, l’élargissement grossier de la taille du noyau reflète le statut multinucléé de ces cellules comme observé sur cette image, le traitement à la cycline évoque également une activation généralisée de la microglie qui est mesurable par une augmentation de l’activité acide PHA de la microglie mononucléée, ainsi que des cellules GLO multinucléées. Comme on l’observe sur cette image représentative, les profils actifs acides PHA de la microglie positive IBO one peuvent être facilement identifiés lors de la co-culture avec des cellules progénitrices d’oligodendrocytes. Les implications de cette technique s’étendent au traitement de la GLD, car la formation de ces cellules multinucléées en réponse au traitement à la cycline est une caractéristique déterminante de la neuropathologie de la GLD et la contribution de ces cellules à cette pathologie n’a pas été explorée de cette manière auparavant.