Name: Un In Vitro Modèle pour létude de la physiopathologie cellulaire en cellules globoïdes Leucodystrophie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Découvrez la transformation des microglies en cellules globoïdes dans la maladie de Krabbe à l'aide de cultures gliales primaires et de cycline. Cette méthode permet d'évaluer la phagocytose et la nucléation par microscopie immunofluorescente.

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Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de la National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 à S.J.C.), des National Institutes of Health (NS065808 à E.R.B. ; NS078392 à S.J.C.), des fonds de démarrage du UConn Health Center (à SJC) et du Kim Family Fund (UCHC en soutien à K.I.C.).

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été effectuées en conformité avec la Politique sur la protection des animaux soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire exposés par le Bureau de la protection des animaux de laboratoire (NIH) et seulement avec l&#39;approbation du Comité institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation (IACUC) de l&#39;Université de Connecticut Health Center. 1 Préparation de cultures gliales mixtes <ol><li> Stériliser tous les instruments avant de les utiliser. Ajouter 3 ml de solution glacée stérile de sel équilibrée de Hank (HBSS) ne contenant pas de cations (Mg2 + ou Ca2 +) à 60 mm de trois boîtes de Pétri stériles maintenus sur de la glace pour conserver au froid. </li><li> Isoler les cortex de souriceaux P0-P2 postnatales, comme décrit précédemment 17,18. REMARQUE: les structures sous-corticales, comme les hippocampes, ne sont pas inclus dans ces cultures. </li><li> Retirez délicatement les méninges et ensuite transférer les cortex isolés de HBSS frais et dissocier les tissus par voie enzymatique, en utilisant une amendeKit de dissection tissulaire ural selon le protocole du fabricant. </li><li> Plaque de cellules stériles dans des flacons T-175 et incuber pendant une nuit dans un milieu [milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) contenant 1 x pénicilline / streptomycine]. </li><li> Remplacer tous les médias le lendemain avec des milieux frais. Continuer à incuber les cultures, avec les changements de supports réguliers, pendant environ 3 semaines ou jusqu&#39;à une monocouche cellulaire est établie. NOTE: Cette monocouche sera composé des astrocytes et la microglie avec une participation d&#39;environ 10: 1 19. </li></ol> 2. Globoid induction de cellules dans les cultures gliales mixtes <ol><li> Préparer les lamelles ECM-enduit. <ol><li> Tremper les lamelles circulaires avec 1 acide stérile N chlorhydrique (HCl) dans une boîte de Pétri stérile pendant 30 min. Laver lamelles avec 3x d&#39;eau stérile, puis tremper dans EtOH à 95% pendant au moins 20 min. puis laisser sécher à l&#39;air. </li><li> La place des gouttelettes de matr extracellulaire diluéix matériaux (ECM) de la protéine de revêtement sur ​​une feuille de Parafilm (par exemple, 150 à 250 pl / gouttelette de la laminine de 10 pg / ml dissous dans une solution tampon de phosphate stérile [PBS]). Distribuez les gouttelettes de telle sorte que les lamelles ne toucheront pas lorsqu&#39;il est placé sur ces gouttelettes. Placez délicatement chaque lamelle séché sur une gouttelette en utilisant une pince. </li><li> Laissez les lamelles sur les gouttelettes pendant env. 4-6 h dans la hotte de culture avec la ceinture fermée. </li><li> Placer les lamelles de l&#39;ECM (ECM revêtu revêtu vers le haut) dans chacun des puits d&#39;une plaque à 24 puits. Laver chaque puits avec du PBS stérile 3x et conserver à 4 ° C jusqu&#39;au moment de servir. </li></ol></li><li> Préparation des cellules gliales pour placage sur des lamelles. <ol><li> Aspirer les médias des cultures gliales et laver délicatement les 3x monocouches gliales avec 10 ml de PBS stérile. Ensuite, ajoutez 8-10 ml de solution de trypsine-EDTA à la T-175, et incuber pendant 5-10 min à 37 ° C. </li><li> Lorsque la plupart de la monocouche a été détaché, ajouter 20 ml de milieu completà arrêter le ballon à la trypsine. Recueillir les médias contenant les cellules individuelles dans un tube conique de 50 ml et tourner pendant 10 min à 300 g à la température ambiante. </li><li> Aspirer le surnageant sans déranger le culot, puis remettre en suspension les cellules dans 2 ml de milieu complet frais à la pipette doucement la solution à l&#39;aide d&#39;une pipette P1000. </li><li> Déterminer le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre et ensuite remettre en suspension les cellules dans du milieu complet à la densité souhaitée (par exemple 10 5 cellules / ml). Plate cellules sur les lamelles de l&#39;ECM enduit (par exemple 500 pi dans chaque puits de la plaque de 24 puits). Ajouter des milieux complets frais supplémentaires à chaque puits pour 3-5 jours d&#39;incubation à 37 ° C, ou jusqu&#39;à ce que les cellules se développent à la confluence visuel désiré. </li></ol></li><li> Le traitement par psychosine. <ol><li> Reconstituer le psychosine à une concentration de stock (108,3 mM) dans du diméthylsulfoxyde (DMSO). Diluer ce stock dans EtOH à 100% pour faire un bouillon de travail qui peut l&#39;n est ajoutée dans chaque puits d&#39;une plaque à 24 puits pour obtenir une concentration finale de 10 uM. </li><li> Au moment de l&#39;addition du psychosine, agiter doucement la plaque de culture de mélanger le psychosine dans le milieu de culture. Compléter la psychosine en ajoutant l&#39;équivalent de 10 uM tous les deux jours pendant une semaine. </li></ol></li><li> Après 7 jours de traitement psychosine, recueillir les médias et pipette 500 ul de paraformaldéhyde 4% froid (PFA) dans chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 20 min pour fixer les cellules. Ensuite, lavez chaque puits 3 fois avec du PBS, puis conserver leurs plaques à 4 ° C jusqu&#39;à sa transformation pour immunocytochimie (voir ci-dessous). REMARQUE: milieux de culture cellulaire peuvent être collectées pour enzymatique ou test ELISA à ce point, si désiré. </li></ol> 3. immunocytochimie (ICC) pour visualiser les cellules Globoid <ol><li> Remplacer PBS avec du tampon de blocage [PBS + 0,3% de Tween-20 + 5% de sérum normal de chèvre (NGS)], et on incube les cellules pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Danscubate les cellules fixées à des antiserums primaires contre Iba-1 [(1: 1000) dilué dans du PBS + 0,3% de Tween-20 + 2% de NGS] pendant au moins 1 heure à température ambiante, puis laver chaque puits avec du PBS 3 x 5 min / laver. </li><li> Ajouter l&#39;anticorps secondaire conjugué à fluorescence approprié pour identifier le marquage de l&#39;anticorps et de la contre-colorant primaire avec 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 1: 1000) pour identifier les noyaux. Incuber dans une solution d&#39;anticorps secondaire pendant 1 heure à température ambiante et laver avec du PBS 3 x 5 min. </li><li> Montez chaque lamelle lames de microscope en utilisant un support de montage. Voir glisse sur un microscope à fluorescence pour des analyses visuelles et quantitatives. </li></ol> 4 Analyse et caractérisation des cellules en culture primaire Globoid <ol><li> Utilisez les trois critères morphologiques suivants pour identifier une cellule globoïde dans la culture: <ol><li> Identifier les cellules globoïdes utilisant la microscopie à fluorescence par étiquetage immunopositif pour le marqueur de la microglie, Iba-1 +. </li><li> Identifiercellules globoïdes que polynucléaires (c. contenant deux ou plusieurs noyaux positifs DAPI). </li><li> Identifier les cellules globoïdes par une morphologie arrondie distincte de l&#39;aspect très ramifié de cellules au repos microgliales. REMARQUE: Les cellules peuvent également être collectés pour l&#39;analyse et la quantification des marqueurs de surface cellulaire par cytométrie en flux à partir de ces cultures. </li></ol></li><li> Mesure de l&#39;activation de la microglie et de phagocytose des cellules globoïdes <ol><li> Pour évaluer l&#39;activité phagocytaire des cellules microgliales traitées de psychosine, ajouter des perles de latex marqués au FITC dans les puits selon les instructions du fabricant. Ajouter des billes de latex fluorescentes conjuguées 48 heures avant la fixation de PFA. Fixer les cellules traitées avec des perles (comme indiqué à la section 2.4), et le processus d&#39;immunocytochimie (comme décrit dans la section 3). </li><li> Sélectionner des anticorps secondaires conjugués à un fluorophore de sorte qu&#39;ils ne se chevauchent pas les spectres d&#39;émission de fluorescence des perles de fluorophores marqué. </li><li> Analyze les profils de phagocytose des Iba-1 + microglie par l&#39;identification des cellules qui co-localisent avec les billes marquées par fluorescence. REMARQUE: psychosine va activer la microglie. Perles phagocytés seront identifiés dans Iba-1 + les cellules mononucléées et multinucléées dans ce cadre de la culture. </li></ol></li></ol> 5. induction de cellules Globoid de cultures purifiée microgliales REMARQUE: Une autre approche de déchiffrer la signalisation intercellulaire entre les astrocytes et la microglie est un autre avantage de cette vitro globoïde modèle cellulaire. Purification des cellules microgliales primaires pour réensemencement ou la co-culture peut être réalisé par leur propriété d&#39;adhérence plus faible dans la culture, comme décrit dans les étapes suivantes (voir la section 5.2). <ol><li> Recueillir les médias dans les cultures mixtes gliales confluentes dans 50 ml tube conique et la maintenir à 37 ° C dans l&#39;incubateur. </li><li> Isolation de la microglie de cultures mixtes gliales primaires.<ol><li> Après avoir enlevé le support à partir d&#39;une culture gliale ballon T175 confluent mixte, ajouter supports serrant chauds [constitués de milieu complet 25 mM + 4 (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) + 25 mM de bicarbonate de sodium (Sigma)]. Agiter les flacons pour 3-4 heures dans un agitateur orbital à 100 tours par minute (37 ° C). Recueillir les médias de ces flacons secoués dans 50 ml tubes coniques. NOTE: Ce support inclura la microglie moins adhérente des flacons. </li><li> Spin médias à 300 g pendant 10 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 2 ml du milieu conditionné d&#39;astrocytes (collectées à l&#39;étape 5.1). </li><li> Établir le nombre de cellules acquises à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre et plaque les cellules microgliales sur des lamelles de substrat enduit (voir section 2.1) pour immunocytochimie, ou la plaque sur UltraLow ​​plaques respect de puits pour la collecte future des cellules globoïdes de co-culture avec d&#39;autres types de cellules, telles que les oligodendrocytes (comme described dans la section suivante). REMARQUE: Une fois plaqué la microglie peut être traitée avec psychosine (10 M) tel que décrit ci-dessus (voir section 2.3). </li></ol></li><li> Co-culture avec des oligodendrocytes primaires pour l&#39;analyse de cytotoxicité. REMARQUE: Collection de microglie de psychosine traitée à partir des plaques de faible adhérence pour la co-culture subséquente sur des cultures primaires d&#39;oligodendrocytes ou des cellules oligodendrocytes progénitrices, peut être utilisé pour étudier la fonction de potentiel cytotoxique de ces cellules globoïdes, comme in vitro. <ol><li> Développer des cultures d&#39;oligodendrocytes primaires en utilisant des méthodes établies 18,20. Pour recueillir les cellules microgliales traitées de psychosine, pipeter doucement pour détacher les cellules faiblement adhérentes à partir du fond des puits. Recueillir les cellules, centrifuger à 300 g pendant 10 min, puis remettre en suspension attentivement dans les médias de la différenciation des oligodendrocytes [composé de Neurobasal médias, L-glutamine (1x), B-27 supplément (1x) et triiodothyronine (T3, 10 ng / ml )]. </li><li> Compter le nombre de cellules en utilisant un hématimètre puis ensemencer les microglies sur la culture d&#39;oligodendrocytes à 1 x 10 5 cellules / ml, ce qui entraîne un approximatif de 1: 2 microglie / rapport des oligodendrocytes. Incuber à titre de co-culture pendant 3 jours. </li><li> Fixer les cellules pour immunocytochimie (voir section 2.4). Recueillir les milieux de culture cellulaire pour ELISA ou analyse chimique selon les besoins. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Le protocole décrit ici fournit un nouveau système modèle pour étudier le développement et la caractérisation fonctionnelle de la microglie et les cellules activées globoïdes. Des travaux antérieurs par Im et al. en utilisant une lignée cellulaire HEK293 a fourni un modèle pour le développement du présent Protocole pour l&#39;étude de la formation des cellules globoïde 21. Il est également important de souligner que les cellules globoïdes dérivés dans le modèle diffèrent des cellules globoïdes indigè...

Leucodystrophie à cellules globoïdes (GLD), également connue comme la maladie de Krabbe, est une maladie démyélinisante mortelle résultant de la perte de mutations de fonction dans le galatocerebrosidase (GalC) une gène. La forme la plus répandue de GLD est la variante infantile qui est caractérisée par l&#39;apparition de la petite enfance et se caractérise par une évolution clinique agressive de moteur et le déclin cognitif conduisant à la mort prématurée souvent avant cinq ans de 2,3 ans. Les tests génétiques sont utilisés pour vérifier un diagnostic de GLD 4. Neuropathologie de GLD révèle démyélinisation répandue, l&#39;atrophie neuronale, astrogliose et la présence de la microglie multi-nucléées engorgés appelé cellules globoïdes 5-7. L&#39;identification des cellules globoïdes, contenant souvent des inclusions tubuleuses dans leur cytoplasme, a été un élément déterminant de GLD pour les 97 dernières années, bien que la fonction spécifique de ces cellules visibles est resté inaccessible. La participation des non-MYELnaires gliales (astrocytes) et la microglie dans la pathogenèse de GLD a longtemps été considéré comme une réponse secondaire à la démyélinisation profonde dans cette maladie 8. Fait intéressant, la première description de cette maladie, faite par Knud Krabbe en 1916 5, la formation rapporté des phagocytes multinucléées contenant des débris de lipides qui ont été nommé «cellules globoïdes» et sont l&#39;une des caractéristiques de cette maladie. Cellules globoïdes sont le symptôme caractéristique de GLD pathologie, bien que leur rôle dans la GLD a longtemps été ignorée. Fait intéressant, ces cellules sont parmi les premiers changements caractéristiques dans les tissus du système nerveux central de GLD. Ce manque de connaissances peut être dû à l&#39;hypothèse que la formation des phagocytes multinucléées, appelées cellules géantes dans d&#39;autres maladies, sont généralement considérée comme une conséquence de la pathologie plutôt qu&#39;une force motrice pathogène initial 9. Par conséquent, il ya eu peu d&#39;études du mécanisme par whicellules globoïdes ch sont formées à partir des phagocytes, en particulier dans le système nerveux central de GLD. La procédure décrite dans le présent rapport met l&#39;accent sur ​​l&#39;importance de la formation des cellules globoïdes dans le SNC et notre démonstration précédente que de multinucléation induite psychosine-des microglies in vitro et ces cellules ont un sens élevé de l&#39;activité phagocytaire. En accord avec ces observations, les cellules globoïdes dans le cerveau twitcher contiennent souvent des débris de PAS-positif, suggérant des niveaux élevés de l&#39;activité phagocytaire. Cellules globoïdes sont également avérés immunopositif pour la ferritine (un marqueur de la microglie) 10, KP-1 / CD68 (un marqueur des monocytes), et certains sont également positives pour la vimentine (une protéine intermédiaire du filament et un marqueur des astrocytes et la microglie activée) 11, HLA-DRA (un récepteur de surface MHCII), le TNF-α et 7, et Iba-1 (une protéine de liaison de calcium utilisé pour identifier les cellules microgliales) 12. Sur la base de cette collection de marqueurs, les cellules globoïdes proviennent de la microglie qui se développentun phénotype unique. En dépit de leur caractère unique, la fonction spécifique et la contribution de GC à GLD pathogenèse a été largement négligé. Cellules globoïdes ont été pensé pour être une conséquence secondaire de démyélinisation chronique. Toutefois, des études antérieures portant sur le lien temporel de cellules globoïdes à la question pathologie blanc de GLD ont identifié la présence de cellules globoïdes à la fin du embryonnaire à la période postnatale précoce; fois précédentes oligodendrocytes apoptose et une démyélinisation manifeste 13. Ainsi, la séquence temporelle de développement de la neuropathologie dans GLD suggère que les cellules globoïdes sont formés à l&#39;avance de la démyélinisation dans la maladie 14. Cela a conduit à notre hypothèse que la formation précoce des cellules globoïdes dans GLD peut représenter un événement pathogène plutôt que de définir une réponse réactive secondaire à des lésions des oligodendrocytes 15. En outre, la dérégulation de l&#39;activité de la microglie dans GLD a été considéré comme un faitr limitant l&#39;efficacité à long terme des thérapies de cellules souches hematopeotic pour le traitement de cette maladie 16. Ainsi, l&#39;étude des fonctions cellulaires et la régulation de la microglie et les cellules globoïdes, en réponse à psychosine devrait fournir de nouvelles perspectives dans la pathogenèse de GLD. Jusqu&#39;à récemment, l&#39;absence d&#39;un modèle approprié pour étudier la formation des cellules globoïdes avait limité la compréhension de la fonction précise et la contribution de ces cellules à la pathologie de la GLD. Dans des études récentes, il a été déterminé que les cellules globoïdes analogue peuvent être formées en réponse directe à la psychosine, une toxine pathogène lipidique qui s&#39;accumule dans GLD. Nous avons constaté que la microglie, des macrophages, mais non, sont activés et transformés dans des cellules globoïdes dans les cultures gliales primaires en réponse à psychosine 15. Cette transformation en cellules globoïdes a été trouvé pour être médiée par la protéase extracellulaire, la matrice métalloprotéinase (MMP) -3 15. Plus récemment, nousont étendu ces résultats et déterminé que les cellules de la microglie et globoïdes psychosine activé développés dans ce système in vitro de modèle sont puissamment toxique pour les oligodendrocytes et les cellules progénitrices oligodendrocytes. Par conséquent, lorsqu&#39;il est considéré dans le contexte de GLD, l&#39;accumulation rapide de psychosine et la formation de cellules globoïdes avant démyélinisation appuierait un rôle principal et éventuellement pathogène émergent de la microglie dans cette maladie. Nous proposons que l&#39;étude de la formation des cellules globoïde va révéler de nouvelles informations sur la pathogenèse de GLD qui contribuera à notre compréhension de cette maladie. En outre, ce nouveau modèle cellulaire de GLD peut fournir un nouveau format à partir de laquelle de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter des changements pathologiques dans cette maladie pourraient être testés. Par conséquent, dans ce rapport, nous proposons un protocole détaillé pour le développement in vitro de cellules globoïdes induite psychosine-de cultures primaires de cellules gliales non-myélinisation.

<table><tbody><tr><td>Hank' s solution saline équilibrée (HBSS) ne contenant pas de cations (Mg2+ et Ca2+).</td><td>Technologies du vivant</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dissociation du tissu neural</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>40 &#956 ; crépine à cellules Fisherbrand</td><td></td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Hank' contenant des cations (Mg2+ et Ca2+).</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Péniciline/Streptomycine</td><td>Life technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Solution trypsine-EDTA</td><td>Technologies de la vie</td><td>25299-056</td><td></td></tr><tr><td>Psychosine</td><td>Sigma</td><td>P9256</td><td></td></tr><tr><td>Diméthyl sulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Microscopie électronique Science</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal (NGS)</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>Iba-1</td><td>WAKO</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor conjugué antisera</td><td>Life Technologies</td><td>Divers</td><td></td></tr><tr><td>Supports de montage</td><td>Southern Biotech</td><td>OB100-01</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dosage phagocytaire</td><td>Cayman Chemicals</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>BP310-500</td><td></td></tr></tbody></table>

un in vitro modèle pour l'étude de la physiopathologie cellulaire en cellules globoïdes leucodystrophie

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

La fonction précise de la microglie multi-nucléées, appelées cellules globoïdes, qui sont uniquement abondant dans le système nerveux central de la leucodystrophie à cellules globoïdes (GLD) n&#39;est pas claire. Cette lacune dans les connaissances a été entravée par l&#39;absence d&#39;un modèle in vitro approprié pour l&#39;étude. Nous décrivons ici un système de culture primaire gliale de souris dans lesquelles un traitement avec des résultats psychosine multinucléation de la microglie ressemblant aux cellules globoïdes caractéristiques trouvées dans GLD. L&#39;utilisation de ce nouveau système, nous avons défini les conditions et les modes d&#39;analyse pour l&#39;étude des cellules globoïdes. L&#39;utilisation potentielle de ce système modèle a été validé dans notre précédente étude, qui a identifié le rôle potentiel de la métalloprotéinase matricielle (MMP) -3 GLD. Ce roman système in vitro peut être un modèle utile pour l&#39;étude de la formation et de la fonction, mais aussi la manipulation thérapeutique potentielle, de ces cellules uniques.

Ce protocole, tel qu'il est rédigé, devrait prendre environ 36 jours pour terminer du début à la fin (Voir Figure 1: Schéma expérimental de workflow). Il a été notre expérience que le développement des cellules «globoïde-comme» dans ce système de culture primaire est à la fois fiable et reproductible: la formation de cellules multinucléées en réponse à psychosine est toujours observé avec 7 jours de traitement. Coloration immunocytochimique de la microglie utilisant Iba-1 en...

Les cellules globoïdes sont une caractéristique pathologique déterminante de la maladie de Krabbe, une leucodystrophie actuellement sans traitement efficace à long terme. Nous avons développé un modèle de culture cellulaire pour étudier la biologie innée et le potentiel pathogène des microglies activées et leur transformation en cellules globoïdes.

Un In Vitro Modèle pour l'étude de la physiopathologie cellulaire en cellules globoïdes Leucodystrophie

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

L’objectif global de cette procédure est de démontrer la transformation unique de la microglie en cellules GLO en présence de la toxine cycline. Ceci est accompli en enrobant d’abord les lamelles de recouvrement avec des protéines de matrice extracellulaire. Dans la deuxième étape, les cellules gliales sont plaquées sur les lamelles de recouvrement, puis des billes de cycline et de latex sont administrées aux cultures.Dans la dernière étape, les cellules sont colorées par l’immunochimie. En fin de compte, les effets de la cycline sur la nucléation et la capacité phagocytaire des cellules microgliales peuvent être évalués par microscopie immunofluorescente. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’utilisation de lignées cellulaires microgliales, est que l’utilisation de cultures gliales primaires imite les interactions hypothétiques entre les astrocytes I et la microglie dans le cerveau d’individus atteints de leucodystrophie à cellules vides GLO ou GLD.Pour préparer les lamelles revêtues de matrice extracellulaire ou d’ECM, faites d’abord tremper des lamelles circulaires avec de l’acide chlorhydrique stérile dans une boîte de Pétri stérile. Après 30 minutes, lavez les lamelles trois fois avec de l’eau stérile, puis trempez-les dans de l’éthanol à 95 % pendant au moins 20 minutes. Après avoir laissé les lamelles sécher à l’air, ajoutez 150 à 250 gouttelettes de microlitres de matériaux d’enrobage protéique ECM dilués sur une feuille de paraforme répartissant les gouttelettes de manière à ce que les lamelles ne se chevauchent pas après la mise en place.Ensuite, à l’aide d’une pince, placez délicatement une lamelle sur chaque gouttelette, puis placez le paraforme à l’intérieur d’un capot de culture cellulaire avec le châssis fermé après quatre à six heures, placez les lamelles de couverture ECM côté enduit vers le haut dans des puits individuels d’une plaque de 24 puits. Ensuite, lavez bien chaque fois avec du PB S3 stérile et conservez les lamelles à quatre degrés Celsius. Pour préparer les cellules gliales à être plaquées sur les lamelles, aspirez le milieu des cultures de cellules gliales, puis lavez doucement les monocouches trois fois avec 10 millilitres de PBS stérile.Détachez les cellules avec huit à 10 millilitres de trypsine EDTA après cinq à 10 minutes. À 37 degrés Celsius, ajoutez 20 millilitres de milieu complet dans le ballon pour arrêter la réaction. Transférez ensuite la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres et faites tourner les cellules pendant 10 minutes.À 300 g et à température ambiante, utilisez un P 1000 pour remettre doucement le palais en suspension dans deux millilitres de milieu frais et complet. Après le comptage, diluez les cellules à environ une fois 10 à la cinquième cellules par millilitre. Maintenant, plaquez 500 microlitres de cellules sur chacune des lamelles revêtues d’ECM.Ajoutez un milieu complet frais supplémentaire dans chaque puits, puis incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq jours. Une fois que les cellules ont atteint la confluence souhaitée, ajoutez de la cycline fraîchement préparée dans chaque puits et faites tourner doucement la plaque de culture pour mélanger. Après une semaine de traitement à la cycline, collectez le milieu et fixez les cellules dans 500 microlitres de froid, 4 % de para formaldéhyde par puits à température ambiante.Ensuite, lavez chaque puits trois fois avec du PBS et conservez les assiettes à quatre degrés Celsius. Pour visualiser les cellules GLO par immuno-chimie, remplacez d’abord le PBS par un tampon bloquant et incubez les cellules à température ambiante. Après une heure, incubez les cellules dans l’antisérum primaire contre le marqueur de la microglie IO un pendant au moins une heure à température ambiante, puis lavez chaque puits trois fois dans du PBS pendant cinq minutes.Après avoir incubé les cellules avec l’anticorps secondaire conjugué à la fluorescence approprié, contre-colorez les cellules avec du DAPI pour identifier les noyaux. Ensuite, après avoir lavé les cellules comme nous venons de le démontrer, utilisez un support de montage pour monter chaque lamelle de recouvrement sur des lames de microscope individuelles et visualisez les lames sur un microscope à fluorescence pour une analyse visuelle et quantitative. Pour évaluer l’activité phagocytaire de la microglie traitée à la cycline après le traitement à la cycline, mais avant la fixation, ajoutez des billes de latex marquées FITC à chaque culture cellulaire G OID conformément aux instructions et au fabricant.Après 48 heures, fixez les cellules dans le PFA comme nous venons de le démontrer, puis traitez les cellules pour l’immunochimie comme indiqué. Enfin, évaluez le nombre de microglies IBO positives qui se localisent avec les billes marquées par fluorescence par microscopie à fluorescence immunochimique. La coloration de la microglie à l’aide d’IO one en conjonction avec une contre-coloration nucléaire permet l’identification de grandes cellules multinucléées arrondies.Notons que dans de nombreux cas, l’élargissement grossier de la taille du noyau reflète le statut multinucléé de ces cellules comme observé sur cette image, le traitement à la cycline évoque également une activation généralisée de la microglie qui est mesurable par une augmentation de l’activité acide PHA de la microglie mononucléée, ainsi que des cellules GLO multinucléées. Comme on l’observe sur cette image représentative, les profils actifs acides PHA de la microglie positive IBO one peuvent être facilement identifiés lors de la co-culture avec des cellules progénitrices d’oligodendrocytes. Les implications de cette technique s’étendent au traitement de la GLD, car la formation de ces cellules multinucléées en réponse au traitement à la cycline est une caractéristique déterminante de la neuropathologie de la GLD et la contribution de ces cellules à cette pathologie n’a pas été explorée de cette manière auparavant.

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Ce protocole décrit la dérivation de précurseurs gliales fœtales restreintes de la moelle épinière et maintenues in vitro, soit à la transplantation ou à l'étude de la lignée oligodendrogliome.

Dérivation de précurseurs gliales restreint de souris E13

La vidéo démontre un protocole permettant de différencier les cellules précurseurs d’oligodendrocytes (OPC) en oligodendrocytes et d’induire la myélinisation dans une co-culture avec des neurones du ganglion de la racine dorsale (DRG). Les OPC sont transduits avec des vecteurs lentiviraux codant pour une protéine de signalisation qui régule la myélinisation. Les OPC transduits sont co-cultivés avec des neurones DRG pour évaluer la différenciation en oligodendrocytes et la myélinisation induite...

Un test de myélinisation induite par transduction in vitro pour des cellules précurseurs d’oligodendrocytes

Ici, nous présentons une approche systématique de développement physiologiquement pertinente, sensible et...

In Vivo modélisation du génome humain morbide utilisant Danio rerio

Les astrocytes phénotypiquement sauvages et les cellules souches neurales récoltées sur des souris modifiées avec des allèles oncogéniques conditionnels floxés et transformés par recombinaison virale médiée par Cre peuvent être utilisés pour modéliser la pathogenèse de l’astrocytome in vitro et in vivo par injection orthotopique de cellules transformées dans le cerveau de compagnons de portée syngéniques et immunocompétents.

Modélisation astrocytome pathogenèse In Vitro Et In Vivo Utilisation corticale astrocytes ou cellules souches neurales à partir de, souris génétiquement modifiées conditionnelle

Nous présentons ici des protocoles qui offrent une base flexible et stratégique pour manipuler viralement les cellules précurseurs d’oligodendrocytes afin de surexprimer des protéines d’intérêt afin d’interroger spécifiquement leur rôle dans les oligodendrocytes via le modèle in vitro de myélinisation du système nerveux central.

Production et utilisation de lentivirus à des cellules sélective transduction primaire Oligodendrocyte précurseur pour In Vitro Les dosages de la myélinisation

Pour aborder les mécanismes de démyélinisation et d’apoptose neuronale dans les lésions corticales des troubles inflammatoires démyélinisants, différents modèles animaux sont utilisés. Nous décrivons ici une approche ex vivo en utilisant des lymphocytes T CD8+ spécifiques des oligodendrocytes sur des coupes de cerveau, entraînant la mort oligodendrogliale et neuronale. Les applications potentielles et les limites du modèle sont discutées.

Une Ex vivo Modèle de T-Cell Attaque de Oligodendrocyte dirigée dans aigus tranches cérébrales

Dans ce protocole, nous présentons les procédures pour établir la dystrophie 1 modèles de myoblastes myotonique, y compris la maintenance optimisée C2C12 cellulaire, la transfection de gènes / transduction, et la différenciation des myocytes.

Modélisation de la dystrophie myotonique 1 dans les cellules C2C12 myoblastes

L’objectif de cette technique consiste à préparer une culture fortement enrichie des motoneurones primaires (MNs) de moelle épinière murine. Afin d’évaluer les conséquences des mutations responsables de maladies MN, nous décrivons ici l’isolement de ces isolés MNs et leur transfection par magnétofection.

Maladie de Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro de modélisation par transfectants souris primaire motoneurones

Les organoïdes cérébraux servent de modèle précieux pour les études sur l’encéphalomyopathie mitochondriale, l’acidose lactique et les épisodes similaires à l’accident vasculaire cérébral (MELAS), offrant un aperçu de leur physiopathologie sous-jacente et fournissant une plate-forme pour le dépistage des médicaments. Les organoïdes dérivés de lignées cellulaires présentant des niveaux variables d’hétéroplasmie de gènes pathogènes présentent des différences phénotypiques significatives.

Modélisation des maladies mitochondriales à l’aide d’organoïdes cérébraux : un accent sur l’encéphalomyopathie mitochondriale, l’acidose lactique et les épisodes semblables à ceux d’un accident vasculaire cérébral

Les ataxies spinocérébelleuses à la polyglutamine sont causées par des expansions CAG produisant des protéines sujettes à l’agrégation. Ce protocole décrit la production de vecteurs, la délivrance stéréotaxique et l’analyse des inclusions et de la perte de marqueurs neuronaux, fournissant une plateforme contrôlée pour étudier les mécanismes et évaluer les thérapies ciblées pour les maladies neurodégénératives.

Pathologie striatale induite par les lentiviraux comme modèle préclinique des ataxies spinocérébelleuses polyglutamine

Découvrez la transformation des microglies en cellules globoïdes dans la maladie de Krabbe à l'aide de cultures gliales primaires et de cycline. Cette méthode permet d'évaluer la phagocytose et la nucléation par microscopie immunofluorescente.

Un In Vitro Modèle pour l'étude de la physiopathologie cellulaire en cellules globoïdes Leucodystrophie

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