Protein Isolation du développement embryonnaire Souris Coeur Région Valve
23 septembre 2014
L’analyse de l’expression des protéines dans les jeunes valves embryonnaires de souris a été entravée par le tissu limité disponible. Ce manuscrit fournit un protocole pour la préparation de protéines à partir de régions valvulaires embryonnaires de souris en développement pour l’analyse par transfert Western.
L’objectif global de cette procédure est d’isoler et d’extraire des protéines des valves cardiaques embryonnaires. Ceci est accompli en isolant d’abord un embryon d’une souris enceinte. Dans la deuxième étape, le cœur est disséqué de l’embryon, puis les valves cardiaques sont collectées dans la dernière étape.
Le tissu est lysé et l’échantillon de protéines obtenu est préparé pour une analyse ultérieure. En fin de compte, l’analyse occidentale du BLO peut être utilisée pour évaluer les niveaux d’expression des protéines. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de dissection sont difficiles à apprendre en raison de la petite forme compacte du cœur en développement.
Au jour souhaité du développement embryonnaire, utilisez de l’éthanol à 70 % pour stériliser l’abdomen de la femelle enceinte. Ensuite, soulevez la peau et les muscles du bas-ventre vers le haut et loin des organes internes, et disséquez la cavité abdominale inférieure pour permettre l’accès à la corne utérine. Ensuite, tenez le col de l’utérus avec une pince et coupez soigneusement le dorlotement jusqu’aux pointes.
Ensuite, soulevez la corne utérine, en coupant tout tissu conjonctif qui maintient la corne en place, et terminez l’ablation en coupant la jonction de la corne utérine avec l’uct. Placez la corne utérine disséquée dans une boîte de Pétri contenant un tampon de tris molaire froid de 0,1 molaire et rincez au besoin. Coupez ensuite la corne utérine.
Ouvrir dans le sens de la longueur pour exposer les sacs embryonnaires. Pour exposer un embryon, ouvrez un sac embryonnaire à la jonction du placenta et de l’embryon, et coupez les vaisseaux ombilicaux pour libérer l’embryon. Placez l’embryon disséqué dans une deuxième boîte de Pétri avec un tampon molaire froid de 0,1 molaire, et retournez la première boîte de Pétri avec les embryons restants et disséqués dans la glace jusqu’à la prochaine dissection embryonnaire.
Après la décapitation, placez l’embryon sur son dos et coupez la paroi thoracique verticalement le long du côté de la cage thoracique près de la boiterie et horizontalement au-dessus du diaphragme. Pour visualiser le cœur, ouvrez la paroi thoracique. Tenez ensuite la pince haut le long des gros vaisseaux, soulevez le cœur et coupez les vaisseaux en dessous.
Ensuite, coupez au-dessus de la pince pour libérer le cœur. Si les vaisseaux pulmonaires ne sont pas coupés, retirez les poumons avec le cœur avant de continuer aux stades embryonnaires décrits ici, l’artère pulmonaire est légèrement opaque. Après avoir identifié l’artère, coupez-la et retirez-la au-dessus du niveau de la valve.
Maintenant, coupez juste en dessous de la valve pulmonaire, en évitant le myocarde ventriculaire ECD, et retirez l’excès de tampon tris loin de la région d’intérêt. Avant de placer la valve dans un tube einor contenant deux microlitres de tampon de lyse comme l’artère pulmonaire, l’aorte apparaîtra légèrement opaque. Après son identification, coupez juste en dessous de la valve aortique.
Encore une fois, en évitant le myocarde ventriculaire trabéculé. Retirez tout excès de tri-solution, puis transférez la valve dans le tube einor contenant la lyse, le tampon et le tissu de l’artère pulmonaire. Une fois que tous les tissus ont été prélevés, placez immédiatement les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que vous les fassiez avancer.
Utilisez-le pour l’extraction des protéines, décongelez les tissus collectés sur de la glace, puis granulez les échantillons pendant une minute à 13, 100 G à quatre degrés Celsius. Vérifiez le volume de l’échantillon obtenu et utilisez un tampon de lyse pour porter le volume total à 40 microlitres. Ajoutez ensuite des billes d’acier inoxydable de cinq millimètres pour perturber et homogénéiser les échantillons dans un lyr pendant deux à quatre minutes à 50 hertz, selon les instructions du fabricant.
Après homogénéisation, faites tourner brièvement les tubes et transférez les échantillons dans de nouveaux tubes, en laissant derrière eux les débris insolubles pour une analyse expérimentale plus approfondie. En utilisant cette technique de préparation, smad 1 5 8 phosphorylé peut être détecté dans les régions valvulaires aortiques uniques à partir d’embryons E 13.5. Par exemple, la protéine isolée d’une seule région valvulaire est suffisante pour détecter une faible bande p smad, l’intensité du signal augmentant proportionnellement au nombre de régions valvulaires qui sont regroupées.
Il est important de noter que le rapport bêta-actine p smad reste clairement constant dans les différentes tailles d’échantillon en raison des faibles niveaux de protéines disponibles, le même transfert ne peut pas être éliminé et sondé à nouveau pour la smad totale. Cependant, un transfert séparé montrant le smad total et la bêta-actine présente le même modèle d’expression. Ces régions valvulaires sont presque entièrement dépourvues de myocarde ventriculaire contaminant en utilisant cette technique de préparation en combinaison avec des échantillons du ventricule droit, le marqueur du myocarde ventriculaire, une NP n’est pas détectable dans les régions valvulaires aortiques, alors que ce marqueur est facilement détecté dans le ventricule.
De plus, le marqueur myocardique ventriculaire de la chaîne légère de myosine deux V est également facilement détectable dans l’échantillon ventriculaire, mais est à peine détectable dans les régions de la valve aortique, ce qui souligne la précision de la dissection après cette dissection. D’autres méthodes comme la QPCR ou l’AIC RN peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que les gènes en aval qui sont affectés au cours des différentes étapes du développement.
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Aperçu
Cet article présente un protocole permettant d'isoler et d'extraire des protéines à partir des valves cardiaques embryonnaires chez la souris. La méthode répond aux difficultés d'analyse de l'expression protéique dues à la disponibilité limitée du tissu.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie du développement
- Recherche cardiovasculaire
Contexte
- L'analyse de l'expression protéique dans les tissus embryonnaires est souvent limitée par la taille de l'échantillon.
- Comprendre les niveaux protéiques dans les valves cardiaques est essentiel pour les études du développement.
- L'analyse par immunotransfert (Western blot) est une technique courante pour évaluer l'expression protéique.
- La dissection de petits tissus, comme les cœurs embryonnaires, peut présenter des difficultés techniques.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole détaillé pour l'extraction de protéines à partir des valves cardiaques de souris embryonnaires.
- Faciliter l'analyse par immunotransfert (western blot) pour l'étude des niveaux d'expression protéique.
- Améliorer la reproductibilité et la précision de l'analyse protéique à partir d'échantillons limités.
Méthodes utilisées
- Isolation d'embryons de souris gestantes.
- Disséction du cœur à partir de l'embryon.
- Prélèvement des valves cardiaques pour l'extraction de protéines.
- Lyse du tissu pour préparer des échantillons protéiques en vue d'une analyse.
Résultats principaux
- Extraction réussie de protéines à partir des valves cardiaques embryonnaires.
- Préparation d'échantillons adaptés à l'analyse par immunotransfert (western blot).
- Démonstration de techniques de dissection pour un apprentissage efficace.
- Évaluation des niveaux d'expression protéique dans les tissus cardiaques en développement.
Conclusions
- Le protocole permet une étude efficace de l'expression protéique dans les valves cardiaques embryonnaires.
- Les aides visuelles sont essentielles pour maîtriser les techniques de dissection.
- Cette méthode peut faire progresser la recherche en développement cardiaque et dans les domaines connexes.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'isolement de protéines à partir de tissus embryonnaires limités permet la détection de l'activation des voies de signalisation dans les modèles de développement précoce. Cette approche soutient la validation des cibles en fournissant des données semi-quantitatives sur les protéines phosphorylées issues de régions valvulaires microdissectées et regroupées. La méthode répond à un goulot d'étranglement majeur dans la recherche préclinique, où la rareté des échantillons entrave la caractérisation mécanistique permettant de réduire les risques associés aux cibles cardiovasculaires.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques dans le développement des valves cardiaques grâce à la détection de protéines de signalisation phosphorylées telles que pSmad1/5/8.
- Valeur opérationnelle : Fournit un protocole reproductible pour l'extraction de protéines à partir de quatre régions valvulaires aortiques de souris à E13,5, chacune fournissant environ ~1 µg de protéine.
- Valeur prédictive : Facilite le tri du portefeuille en permettant une évaluation semi-quantitative de l'activation des voies dans des systèmes embryonnaires pertinents pour la maladie.
Tests et développement de tests
- Valeur scientifique : Prépare des échantillons biologiques validés pour une analyse en immunotransfert en aval, permettant une évaluation fiable de composés dans le cadre de criblages phénotypiques.
- Valeur opérationnelle : Standardise les protocoles de lyse et d'homogénéisation à l'aide d'un tampon à base de Tris contenant des inhibiteurs de protéases et un tampon d'échantillonnage SDS pour la dénaturation.
- Extensibilité : Permet la réutilisation de la plateforme à différents points temporels du développement en regroupant les tissus afin de surmonter les limites dues à un faible rendement en protéines.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie les données d'expression protéique en phase de découverte à la validation préclinique grâce à des rapports pSmad/β-actine constants, quelles que soient les tailles d'échantillon.
- Dérisquage mécanistique : Réduit l'ambiguïté concernant l'engagement de la cible en confirmant l'exclusion du myocarde ventriculaire par l'absence des marqueurs MYL2V et ANP dans les régions valvulaires.
- Confiance prédictive : Permet de prendre des décisions d'avancement ajustées au risque en associant les profils d'expression protéique à des stades de développement à l'aide de contrôles internes.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du test d'hypothèses sur des cibles à l'identification de composés candidats, en fournissant des lectures mécanistiques issues de systèmes embryonnaires pertinents pour la maladie.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques par la détection de protéines de signalisation phosphorylées dans le tissu valvulaire.
- Écrans de composés : Fournit des échantillons prêts à l'analyse grâce à une extraction protéique standardisée, permettant des résultats reproductibles par immunotransfert pour l'évaluation de composés.
- Analytique : Génère des mesures quantitatives de variables dépendantes à partir de l'intensité du signal chimiluminescent, proportionnelle à la quantité de protéine, facilitant l'analyse comparative entre conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité entre la découverte chez l'embryon et les modèles précliniques en conservant les profils d'expression spécifiques aux voies biologiques, détectables sur des immunotransferts distincts pour Smad total et β-actine.
- Réutilisation à grande échelle : Met en place une capacité reproductible d'isolement protéique applicable à l'ensemble des études cardiovasculaires embryonnaires, réduisant ainsi le développement redondant de protocoles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en permettant la détection de protéines phosphorylées peu abondantes issues de tissus microdisséqués.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation grâce à des volumes de lyse définis, à une homogénéisation par billes magnétiques et à une préparation d'échantillons reproductible pour le western blot.
- Valeur stratégique : Affine les décisions d'orientation (go/no-go) en réduisant l'ambiguïté mécanistique lors de l'évaluation précoce des cibles cardiovasculaires.
- Impact sur le portefeuille : Facilite la priorisation ajustée au risque en fournissant des données semi-quantitatives sur l'activation des voies métaboliques provenant de régions valvulaires embryonnaires.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microdissection des structures cardiaques embryonnaires afin d'isoler les régions valvulaires sans contamination par le myocarde ventriculaire.
- Dépend d'un équipement permettant l'homogénéisation (lyseur avec billes en acier inoxydable) et la centrifugation à 13 100 × g pour la clarification des échantillons.
- Exige une standardisation inter-équipes concernant les volumes de tampon de lyse (volume final de 40 µL) et l'utilisation d'inhibiteurs de protéases afin d'assurer la cohérence des échantillons.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors de l'application du protocole à d'autres tissus embryonnaires ou à d'autres stades de développement que les régions de la valve aortique à E13,5.
- Comprend des limites pratiques telles que l'impossibilité de quantifier les protéines totales par spectrophotométrie en raison d'un rendement faible, nécessitant de s'appuyer sur une analyse semi-quantitative par immunoblotting (western blot).
