Name: Imagerie en temps réel des cellules myéloïdes Dynamique Apc Min / + Intestinale tumeurs par Spinning Disk microscopie confocale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Découvrez la dynamique des cellules myéloïdes dans les tumeurs intestinales du modèle Apc Min/+ par microscopie confocale à disque tournant. Cette méthode permet d'observer en temps réel le comportement cellulaire dans le cancer colorectal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous tenons à remercier Ying Yu pour Apc Min / + souris génotypage. Cette étude a été soutenue par des fonds de l&#39;INSERM et de subventions (CA057621 et AI053194) des National Institutes of Health.

NOTE: Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément aux procédures approuvées par le Comité institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation (IACUC), UCSF. Toutes les expériences d&#39;imagerie sont des procédures non-survie et les animaux ont été euthanasiés immédiatement après la fin de l&#39;acquisition de l&#39;image. 1. génération de souris REMARQUE: Apc Min / + souris, porteuses d&#39;une mutation sur le gène Apc, développent spontanément 50-100 adénomes dans l&#39;intestin grêle. <ol><li> Cross Apc Min / + souris avec la ligne ACTB-ECFP, qui exprime ECFP sous le promoteur de l&#39;actine, et en outre avec la ligne c-fms-EGFP, qui exprime EGFP sous le promoteur c-fms pour détecter les cellules myéloïdes. Animaux hétérozygotes pour ACTB-ECFP et c-fms-EGFP sont utilisés pour détecter la fluorescence. </li><li> Utilisez la souris à 3-4 mois d&#39;âge à l&#39;image adénomes clairement détectables. </li></ol> 2 Préparation de Matières avant la chirurgie REMARQUE: Les détails du microscope set-up ont été décrites précédemment 6,7. <ol><li> Microscope <ol><li> Allumez la couverture chauffante. Allumez le laser à l&#39;argon pour excitation à 488 nm et à l&#39;état solide 405 nm, 561 nm et 640 nm lasers. Allumer le microscope, l&#39;unité de commande de disque en rotation, l&#39;AOTF, l&#39;unité de commande de laser, et l&#39;unité de commande de caméra. </li><li> Ouvrez le volet de microscope, qui transforme la LED rouge. Mettez le logiciel de l&#39;ordinateur et l&#39;appareil photo. </li></ol></li><li> Plate-forme d&#39;imagerie <ol><li> Assurez-vous que la pièce de théâtre est propre. Sinon, nettoyer à l&#39;eau et au savon puis séchez. </li><li> Prenez deux lamelles et utiliser du ruban de laboratoire pour les fixer sur l&#39;insert. Placer l&#39;insert sur la scène et le nettoyer avec des lingettes alcoolisées. </li><li> Avec du ruban de laboratoire, fixez la couverture chauffante sur le côté droit de la scène. </li><li> Vérifier l&#39;intégrité de la membrane de caoutchouc sur le cône de nez et la changer si nécessay. Positionner et fixer le cône de nez pour la livraison de l&#39;isoflurane à l&#39;animal à l&#39;aide d&#39;une gaze et bande de laboratoire. </li></ol></li><li> L&#39;isoflurane système anesthésie <ol><li> Remplir le réservoir de l&#39;isoflurane. </li><li> Allumez le vide et ajuster à 1,2 L / min. </li><li> Ajouter de l&#39;eau distillée pour le nébuliseur et connecter le nébuliseur au système isoflurane. </li><li> Mettez l&#39;analyseur d&#39;oxygène et le connecter au système de l&#39;isoflurane. Mettez le réservoir d&#39;oxygène et de s&#39;assurer que l&#39;analyseur d&#39;oxygène montre 100%. Réglez le débit O 2 à 0,2 L / min. </li><li> Mettez le réservoir d&#39;azote et régler le débit à 0,8 L / min. Assurez-vous que l&#39;analyseur d&#39;oxygène montre 21%. </li></ol></li><li> Préparation des outils de chirurgie et la plate-forme <ol><li> Nettoyer les 2 paires de pinces à dissection et ciseaux avec de l&#39;eau et du savon. </li><li> Allumez le stérilisateur à billes chaude et laisser atteindre 250 ° C. Stériliser les outils de chirurgie pendant 30 sec. Laissez-les refroidir. </li><li> Placez un maturateur de laboratoire sur le banc de la chirurgie. </li><li> Utilisez un couvercle en polystyrène comme une plate-forme chirurgicale. Couvrir avec un morceau de laboratoire suintant. Préparer un deuxième morceau de laboratoire suintant changer après le rasage de la souris. </li><li> Placez le cône de nez à la ligne de l&#39;anesthésie sur le couvercle en polystyrène recouvert, et fixez-le sur le couvercle en polystyrène (pas sur le maturateur de laboratoire) avec un peu de ruban et utiliser deux aiguilles des deux côtés du cône de nez à la maintenir en place. </li><li> Assemblez la bétadine, des tampons d&#39;alcool, gaze stérile, super colle, lames de microscope, rasoir électrique, et 4 morceaux de ruban de laboratoire. </li></ol></li></ol> 3 Préparation des injections <ol><li> Sous le capot, préparer une seringue à insuline (28 G x ½ po) avec 7 pi de Ly-6G (Gr1) anticorps actions AF647 conjugué (1 mg / ml) dans 100 ul de 2000 kDa rhodamine-dextran (4 mg / ml ) pour l&#39;injection de rétro-orbital. Injection rétro-orbitaire est recommandé Min / + souris Apc depuis l&#39;anémie qui se développe dans ces animaux fait la queue veines difficult pour détecter à travers la peau. </li><li> Préparer une seconde seringue d&#39;insuline de 1 mg / kg d&#39;atropine dilué dans 150 ul de PBS par voie sous-cutanée (sc), injection avant l&#39;imagerie pour amortir les mouvements péristaltiques de l&#39;intestin. </li></ol> 4 Préparation de l&#39;intestin pour l&#39;imagerie <ol><li> Vérifiez que la ligne de l&#39;anesthésie à la chambre d&#39;admission est ouverte, et les lignes de la table d&#39;opération et microscope sont fermés. </li><li> Transfert de l&#39;animal à la chambre d&#39;anesthésie. Fermer la chambre d&#39;anesthésie et tourner sur la isoflurane à 4% (avec 21% d&#39;O 2). </li><li> Lorsque la souris respire profondément et lentement (après 5-6 min), la transférer à l&#39;étape chirurgicale sur son flanc et injecter la solution d&#39;anticorps Gr1 et / ou une solution de dextrane rétro-orbitale. </li><li> Ouvrez la ligne de l&#39;anesthésie liée à la plate-forme chirurgicale. Fermer la ligne de la chambre d&#39;anesthésie et de mettre la souris sur le dos avec son nez dans le cône de l&#39;anesthésie. </li><li> Réduire le isofluraneconcentration de 4% à 2,5%. </li><li> Vérifiez que la souris est bien anesthésié en pinçant sa patte et tester le réflexe cornéen. </li><li> Ajouter ophtalmique lubrifiante pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse alors que sous anesthésie. </li><li> Fixez les membres de la souris à l&#39;étape chirurgicale en ajoutant bande de laboratoire. </li><li> Enlever les poils de la surface ventrale en utilisant un rasoir électrique. Également supprimer les cheveux de la patte arrière gauche pour positionner l&#39;oxymètre avant l&#39;acquisition. Retirer le maturateur de laboratoire de l&#39;étape chirurgicale et le remplacer par un propre pour éviter la contamination de cheveux. </li><li> Désinfecter la surface ventrale avec des lingettes d&#39;alcool et de la bétadine. </li><li> Injecter la solution d&#39;atropine (de 3,2) ms dans un flanc de la souris. </li><li> Faire une incision ventrale de 1 cm de la ligne médiane à travers la peau et le péritoine à l&#39;aide de ciseaux et une paire de forceps. Retirez doucement 3-4 cm de l&#39;intestin et d&#39;identifier un ou plusieurs tumeurs à l&#39;image. </li><li> Prenez un micr de verretoboggan oscope et la position d&#39;une boucle de l&#39;intestin sur elle avec une tumeur dans la partie supérieure. </li><li> Ajoutez un peu de super glue à quelques endroits le long de l&#39;intestin pour le fixer à la diapositive. Attendez une minute pour que la colle sèche. Utilisez un marqueur pour dessiner une ligne sur la diapositive montrant la tumeur afin de faciliter sa localisation avec le confocale. </li></ol> 5. positionnant la souris sur la scène et préparation pour l&#39;acquisition de l&#39;image <ol><li> Retirer le ruban de laboratoire de membres. </li><li> Ouvrez la ligne de l&#39;anesthésie à la platine du microscope et de fermer celui de la plate-forme chirurgicale. </li><li> Transférer la souris avec soin à la platine du microscope avec son côté ventral vers le bas et son nez dans le cône de nez. Fixer la ligne d&#39;anesthésie avec du ruban laboratoire. </li><li> Re-positionner la souris et / ou le chariot afin d&#39;avoir l&#39;intestin dans le centre de l&#39;une des fenêtres de couverture-glissé. Collez doucement la lame avec du ruban de laboratoire. </li><li> Fixer la sonde d&#39;oxymètre à la branche gauche de la souris poursuivre son taux et la saturation artérielle en oxygène niveaux respiratoires et cardiaques. </li><li> Couvrir la souris avec la couverture chauffante pour éviter l&#39;hypothermie. </li><li> Réduire la concentration d&#39;isoflurane de 2,5% à 1-1,5% pour l&#39;imagerie. </li></ol> 6 Acquisition d&#39;images à l&#39;aide du logiciel μManager <ol><li> Augmenter la vitesse de CSUX à 2500 rpm pour améliorer la qualité d&#39;image dans les paramètres de configuration. </li><li> Utilisez le menu déroulant pour choisir Objectif 10X 0,5 NA NA ou 20X 0,75 Fluar objectif de l&#39;objectif. </li><li> Choisissez le laser 405 nm de couleur menu déroulant. </li><li> Cliquez sur le Live et la mise au point avec le microscope. </li><li> Cliquer sur automatique pour ajuster automatiquement les intensités maximale et minimale de pixel de l&#39;image d&#39;affichage sur la base des valeurs des pixels extrêmes de l&#39;image. Un histogramme des intensités des pixels de l&#39;image d&#39;affichage est présenté dans le graphique de la partie inférieure de la fenêtre principale. </li><li> Réglez l&#39;exposition de l&#39;appareil photo dans la fenêtre Panneau de configuration Piper parla modification du nombre d&#39;impulsions d&#39;horloge (horloge est une 33,333 ms). </li><li> Si le signal est trop lumineuse à l&#39;exposition la plus faible, diminuer l&#39;intensité du laser à l&#39;aide de l&#39;unité de commande du microscope. </li><li> Vérifiez l&#39;intensité du signal pour 488 nm, 561 nm et 640 nm lignes laser. Ajuster l&#39;intensité du laser avec sa propre unité de contrôle du laser (488 nm et 561 nm) ou de l&#39;unité de commande du microscope. </li><li> Dans la fenêtre multi D Acquisition, cochez la case points de temps et entrez dans nombre de points dans le temps et l&#39;intervalle de temps souhaité. </li><li> Cochez la case Z-piles, choisissez &quot;Z relative» et de définir Z-start et Z-end par rapport à la position actuelle. REMARQUE: Pour 10X ou 20X objectif, commencez par 3 avions de Z, 8 pm ou 4 um part respectivement. </li><li> Cochez la case multiples positions (XY) pour l&#39;imagerie de plusieurs endroits, puis cliquez sur Modifier la liste de position, marquer 4 à 6 positions différentes. </li><li> Cochez la case Canaux et ajouter des canaux de Nouveau et sélectionnez lasers lignes dans le menu déroulant et type de l&#39;exposition pour chaque canal (par multiples de 33,333 ms). </li><li> Sélectionnez l&#39;option Enregistrer les images dans la fenêtre &quot;d&#39;acquisition multi D&quot;. </li><li> Sélectionnez un dossier et toutes les images acquises seront automatiquement enregistrés dans ce dossier avec le préfixe donné. REMARQUE: Chaque acquisition continue sera enregistré dans un sous-dossier séparé sous forme de fichiers TIFF individuels pour chaque tranche de Z dans chaque couleur à chaque point de temps. </li><li> Enregistrer tous les paramètres en cliquant sur Enregistrer les paramètres dans la fenêtre multi D acquisition. </li><li> Cliquez sur Acquérir dans la fenêtre Acquisition multi-dimensionnelle pour lancer l&#39;acquisition. </li><li> Si la sonde de l&#39;oxymètre n&#39;est pas utilisé ou bien cesse de travailler (quand le pouls n&#39;est pas stable ou difficiles à détecter), vérifier l&#39;efficacité de l&#39;anesthésie toutes les 15 minutes au cours de la procédure d&#39;imagerie en pinçant la patte et de vérifier le réflexe cornéen. Réglez l&#39;anesthésie si la souris est sensible à ces stimuli. </li><li> Après l&#39;acquisition, euthanasier la souris en augmentant la concent isofluraneration à 5%. En l&#39;absence de mouvements respiratoires sont détectables, retirez la souris de la scène et effectuer une dislocation cervicale. </li></ol> 7 Analyse des images à l&#39;aide du logiciel Imaris <ol><li> Conversion de fichiers .ims (complémentaire figure 1A) <ol><li> Ouvrez le logiciel de la caméra, cliquez sur Fichier, puis sur Batch Converter. </li><li> Cliquez sur Ajouter des fichiers et sélectionnez le premier fichier de la première position. Répétez l&#39;opération pour chaque position. </li><li> Pour chaque fichier téléchargé, cliquez sur Paramètres, puis vérifiez que les paramètres &quot;t&quot; pour l&#39;heure, &quot;c&quot; pour les canaux et &quot;z&quot; pour Z-piles apparaissent dans cet ordre. </li><li> Enregistrer dans le dossier souhaité. Parcourir et créer un nouveau fichier converti. </li><li> Cliquez sur Set pour tous et Lancer. </li></ol></li><li> Ajustements (complémentaire figure 1B) <ol><li> Allez dans le dossier Converted spécifique et ouvrez le premier fichier. </li><li> Dans la fenêtre de réglage de l&#39;affichage, régler le fondcoupure de signal en modifiant le nombre minimal pour chaque canal si nécessaire. </li><li> Si nécessaire, ajuster l&#39;intensité du signal en modifiant le nombre Max (plus le nombre de Max, plus l&#39;intensité du signal). REMARQUE: Les ajustements de l&#39;intensité du signal / contraste permettent le point culminant d&#39;un comportement de la cellule ou un compartiment afin d&#39;avoir une visualisation plus agréable. Il ne change pas le résultat lui-même. </li><li> Cliquez sur Modifier et Propriétés de l&#39;image. </li><li> Modifiez les x, y et z des valeurs (pour un objectif 10x, x et y = 0,712, z = 8 pm; d&#39;un objectif 20X: x et y = 0,36, z = 4 pm). </li><li> Cliquez sur Tous équidistante à ajuster les points de temps. Ajouter la date de début et l&#39;heure de début de l&#39;acquisition. Ajouter la date de fin et l&#39;heure de fin de l&#39;acquisition (complémentaire figure 1C). </li><li> Cliquez sur le bouton Play pour regarder le film. </li><li> Cliquez sur Modifier et supprimer des points de temps pour supprimer les images floues. </li><li> Pour joindre deux acquisitions séparées together dans un film, aller au dernier point du premier film de temps et cliquez sur Modifier&gt; Ajouter des points de temps pour ajouter le second fichier. </li></ol></li><li> Enregistrement comme un film (complémentaire figure 1D) <ol><li> Cliquez sur Enregistrer, choisissez l&#39;extension mov et un facteur de compression de 0. </li><li> Cliquez sur Enregistrer. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li>
<li>Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instruction+of+myeloid+cells+by+the+tumor+microenvironment%3A+Open+questions+on+the+dynamics+and+plasticity+of+different+tumor-associated+myeloid+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations.</a> Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).</li>
<li>Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+as+organs%3A+complex+tissues+that+interface+with+the+entire+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism.</a> Dev Cell. 18 (6), 884-901 (2010).</li>
<li>Lohela, M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+stromal+cell+dynamics+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 72-78 (2010).</li>
<li>Egeblad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1 (2-3), discussion 165 155-167 (2008).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+long-term+in+vivo+imaging+of+tumor-stroma+interactions+in+mouse+models+of+breast+cancer+using+spinning-disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dynamic long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb top97 (2011).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb prot5563 (2011).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mice+for+long-term+intravital+imaging+of+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb prot5562 (2011).</li>
<li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> J Vis Exp. (73), e50088(2013).</li>
<li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li>
<li>Walther, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+prognostic+and+predictive+markers+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer.</a> Nat Rev Cancer. 9 (7), 489-499 (2009).</li>
<li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of colorectal cancer.</a> Annu Rev Pathol. 6, 479-507 (2011).</li>
<li>Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dominant+mutation+that+predisposes+to+multiple+intestinal+neoplasia+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse.</a> Science. 247 (4940), 322-324 (1990).</li>
<li>Su, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+intestinal+neoplasia+caused+by+a+mutation+in+the+murine+homolog+of+the+APC+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiple intestinal neoplasia caused by a mutation in the murine homolog of the APC gene.</a> Science. 256 (5057), 668-670 (1992).</li>
<li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li>
<li>McDole, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goblet+cells+deliver+luminal+antigen+to+CD103%2B+dendritic+cells+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine.</a> Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).</li>
<li>Xu, C., Shen, Y., Littman, D. R., Dustin, M. L., Velazquez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+mucosal+homeostasis+via+single-+and+multiphoton+intravital+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of mucosal homeostasis via single- and multiphoton intravital fluorescence microscopy.</a> J Leukoc Biol. 92 (3), 413-419 (2012).</li>
<li>Haigis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+oncogenic+K-Ras+and+N-Ras+on+proliferation%2C+differentiation+and+tumor+progression+in+the+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Differential effects of oncogenic K-Ras and N-Ras on proliferation, differentiation and tumor progression in the colon.</a> Nat Genet. 40 (5), 600-608 (2008).</li>
<li>Sansom, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Apc+allows+phenotypic+manifestation+of+the+transforming+properties+of+an+endogenous+K-ras+oncogene+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (38), 14122-14127 (2006).</li>
<li>Janssen, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APC+and+oncogenic+KRAS+are+synergistic+in+enhancing+Wnt+signaling+in+intestinal+tumor+formation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">APC and oncogenic KRAS are synergistic in enhancing Wnt signaling in intestinal tumor formation and progression.</a> Gastroenterology. 131 (4), 1096-1109 (2006).</li>
<li>Takaku, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+tumorigenesis+in+compound+mutant+mice+of+both+Dpc4+%28Smad4%29+and+Apc+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal tumorigenesis in compound mutant mice of both Dpc4 (Smad4) and Apc genes.</a> Cell. 92 (5), 645-656 (1998).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans cet article, un protocole détaillé est décrit pour la filature disque imagerie confocale de la dynamique des cellules myéloïdes in tumeurs intestinales pendant plusieurs heures dans un animal vivant, imagé du côté de la séreuse de l&#39;intestin. Pour éviter l&#39;inflammation et d&#39;avoir des conditions physiologiques optimales, l&#39;imagerie de l&#39;intestin qui doit être fait sur l&#39;organe intact. Cependant, l&#39;imagerie de la face séreuse de l&#39;intestin est difficile, ét...

Des preuves irréfutables démontrent maintenant que le microenvironnement de la tumeur, constitué de populations cellulaires hétérogènes, y compris les fibroblastes, les cellules endothéliales, les cellules immunitaires et inflammatoires, la matrice extracellulaire et les facteurs solubles, joue un rôle crucial dans l&#39;initiation et la progression des tumeurs solides, en contribuant à la quasi-totalité caractéristiques du cancer 1. En effet, au cours de la progression de la tumeur, il existe des interactions dynamiques constants entre les cellules cancéreuses et les cellules transformées stromales qui évoluent à générer un micro-environnement favorable à la malignité 2. Parmi les cellules immunitaires infiltrant la micro-environnement de la tumeur, les cellules myéloïdes sont les plus abondants 3. Composé de macrophages associés aux tumeurs (TAM), les cellules suppressives myéloïdes dérivées (MDSC), les cellules dendritiques (DC) et les neutrophiles (PMN), les cellules myéloïdes sont recrutés dans la moelle osseuse et infiltrent progressivement les tumeurs, en libérant des cytokines, des facteurs de croissance et des protéases qui peut favoriserla croissance de la tumeur et la propagation 4. La diaphonie entre les cellules cancéreuses et les cellules myéloïdes est complexe mais dynamique. Ainsi, la compréhension de la nature de leurs interactions est cruciale pour déterminer pourquoi ces cellules favorisent la progression du cancer au lieu de participer à une réponse immunitaire anti-tumorale, et peut aider à trouver de nouvelles cibles pour le contrôler. L&#39;observation directe par microscopie intravitale fournit des informations sur la dynamique des cellules dans les tissus de souris vivantes 5. A quatre couleurs, multi-région, micro-lensed filature disque système confocal a été conçu pour étudier les cellules stromales dans les tumeurs mammaires 6. Cette approche permet une imagerie continue à long terme et comprend plusieurs avantages tels que (a) l&#39;acquisition des images rapides afin de minimiser les artéfacts de mouvement, (b) l&#39;anesthésie à long terme, (c) quatre d&#39;acquisition de couleur pour suivre différents types de cellules, (d) marquage fluorescent des différentes composantes tumorales, et (e) l&#39;observation de différents micro-environnements tumoraux esprithin la même souris pour éviter la souris à la variabilité de la souris 7-9. Avec cette technologie, les comportements cellulaires différentes ont été rapportées dans le virus de la tumeur mammaire de modèle (MMTV) polyome milieu de promoteur-oncogène T entraînée (PyMT) qui affiche les étapes progressives de la tumorigenèse. Lymphocytes T régulateurs (Treg, visualisées par le transgène Foxp3 EGFP) migrer préférentiellement à proximité des vaisseaux sanguins que DCs (CD11c-DTR-EGFP), des fibroblastes de carcinome associé (FSP1 + / + -EGFP) et des cellules myéloïdes (c-fms -EGFP) présentent une motilité supérieure à la périphérie de la tumeur à l&#39;intérieur de la masse tumorale. Dans la condition d&#39;hypoxie systémique aiguë, les cellules ont migré différemment: Tregs arrêter la migration contrairement aux cellules myéloïdes qui continuent à se déplacer 6. En outre, dans le même modèle de la souris, il a été montré que la sensibilité de la doxorubicine change avec le stade tumoral, la distribution du médicament est lié à la réponse aux médicaments, et de la doxorubicinetraitement conduit au recrutement de CCR2-dépendant des cellules myéloïdes à des tumeurs. Ainsi, l&#39;imagerie en direct peut également être utilisé pour mieux comprendre la réponse aux médicaments in situ et la biologie de la chimiorésistance 10,11. Polypose adénomateuse familiale (Apc) des mutations génétiques se produisent généralement dans les adénomes colorectaux humains et les carcinomes 12 et mutation d&#39;une seule copie des résultats de gène APC dans la polypose adénomateuse familiale (FAP), qui confère un risque extrêmement élevé de cancer du côlon 13. La souche de souris Apc Min / + porte une mutation de troncature au niveau du codon 850 du gène APC et développe spontanément plusieurs adénomes intestinaux à travers l&#39;intestin grêle, du 14 au 16. Imagerie intravitale à long terme de l&#39;intestin est difficile en raison de l&#39;envahissement de la procédure, depuis l&#39;ouverture de la cavité péritonéale est nécessaire pour accéder à l&#39;intestin. Imagerie en temps réel à court terme studies ont déjà été publiés sur l&#39;intestin sain 17,18, mais l&#39;observation directe à long terme des tumeurs intestinales n&#39;a pas été signalée. Une intervention chirurgicale a été conçu et raffiné pour visualiser des tumeurs à travers la surface séreuse de l&#39;intestin, en utilisant le système de microscopie intravitale disque rotatif utilisé auparavant à l&#39;image des tumeurs mammaires 6,10. Dans cet article, un protocole est décrit qui permet de suivre le comportement des cellules myéloïdes dans les tumeurs dans l&#39;intestin grêle en utilisant Apc Min / + souris.

<table><tbody><tr><td>souris ApcMin/+</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2020</td><td></td></tr><tr><td>ACTB-ECFP</td><td>souris Jackson Laboratory</td><td>3773</td><td></td></tr><tr><td>cfms-EGFP souris</td><td>Jackson Laboratory</td><td>18549</td><td></td></tr><tr><td>2 000 kDa Dextran, conjugué à la rhodamine</td><td>Invitrogen</td><td>D7139</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Animal Health Supply</td><td>29450</td><td></td></tr><tr><td>Azote</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxygène</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Installation de culture</td><td></td><td></td>cellulaire UCSF</tr><tr><td>Tampon salin</td><td>Installation de culture cellulaire UCSF Anticorps</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-souris Ly-6G (GR1) AF647</td><td>UCSF Noyau d’anticorps</td><td></td> monoclonal <td>Stock 1 mg/ml. Utilisation à 7 &mu ; g/souris</td></tr><tr><td>Atropine</td><td>LARC UCSF</td><td></td><td>Utilisation à 1 mg/kg</td></tr><tr><td>de souris Lingettes imbibées d’alcool</td><td>Becton Dickinson</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>28 G x 1/2 po Seringue à insuline</td><td>Becton Dickinson</td><td>329465</td><td></td></tr><tr><td>Remium Verre de protection</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td>24x50-1</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>LARC UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Couverture chauffante</td><td>Gaymar Industries Stérilisateur</td><td></td><td></td></tr> à <tr><td>billes chaudes</td><td>Outils de sciences fines</td><td>18000-45</td><td>Allumer 30 min avant utilisation</td></tr><tr><td>Applicateurs à pointe de coton Microscopie électronique 6 pouces</td><td>Sciences</td><td>72310-10</td><td></td></tr><tr><td>Système d’anesthésie</td><td>Summit Support d’anesthésie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td>Zeiss Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>Insert de platine</td> Instrumentation <td></td><td></td><td>Sientific</td></tr><tr><td>Appliquée Souris Ox oxymètre, logiciel et capteurs</td><td>Starr Life Sciences</td><td>MouseOx</td><td></td></tr><tr><td>Nébuliseur</td><td>Summit Anesthésie Support</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&mu ; Manager</td><td>Vale lab, UCSF</td><td></td><td>Logiciel open-source</td></tr><tr><td>Caméra ICCD</td><td>Stanford Photonics</td><td>XR-Mega-10EX S-30</td><td></td></tr><tr><td>Disque tournant confocal sacan-head</td><td>Yokogawa Corporation</td><td>CSU-10b</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie en temps réel des cellules myéloïdes dynamique apc min / + intestinale tumeurs par spinning disk microscopie confocale

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Les cellules myéloïdes sont des cellules immunitaires les plus abondants dans les tumeurs et il a été démontré pour favoriser la progression de la tumeur. Techniques d&#39;imagerie intravitale modernes permettent l&#39;observation du comportement cellulaire vivent à l&#39;intérieur de l&#39;organe, mais peut être difficile dans certains types de cancer dû à l&#39;accessibilité d&#39;organes et de la tumeur tels que l&#39;intestin. L&#39;observation directe des tumeurs de l&#39;intestin n&#39;a pas été rapportée précédemment. Une intervention chirurgicale décrite ici permet l&#39;observation directe de la dynamique des cellules myéloïdes dans les tumeurs intestinales chez des souris vivantes en utilisant des souris transgéniques rapporteurs fluorescent et traceurs injectables ou des anticorps. A cet effet, un quatre couleurs, multi-région, micro-lensed disque filature microscope confocal qui permet l&#39;imagerie continue à long terme avec l&#39;acquisition rapide d&#39;images a été utilisé. Apc Min / + souris qui développent de multiples adénomes de l&#39;intestin grêle sont croisés avec des souris c-fms-EGFP pour visualiser les cellules myéloïdes et des souris ACTB-ECFPà visualiser les cellules épithéliales de l&#39;intestin des cryptes. Les procédures pour le marquage de composantes de tumeurs, tels que les neutrophiles et les vaisseaux sanguins, et la procédure de positionnement de la tumeur pour l&#39;imagerie à travers la surface séreuse sont également décrits. Films time-lapse compilées à partir de plusieurs heures de l&#39;imagerie permettent l&#39;analyse du comportement des cellules myéloïdes in situ dans le microenvironnement intestinal.

En utilisant la microscopie confocale disque filage, de tissus non tumoraux et tumorales dans l&#39;intestin grêle de Apc Min / +; ACTB-ECFP; souris c-fms-ECFP peuvent être visualisées à partir de la surface séreuse. Après l&#39;exposition, le logiciel de l&#39;appareil photo est utilisé pour analyser et ajuster l&#39;acquisition (Figure 1 supplémentaire). Après l&#39;administration intraveineuse (iv) l&#39;injection de 2000 kDa fluorescent rhodamine-dextrane et un ...

En utilisant des souris rapporteures transgéniques et des marqueurs fluorescents injectables, la microscopie confocale à disque rotatif intravital à long terme permet de visualiser directement le comportement des cellules myéloïdes dans l’adénome intestinal dans le modèle de cancer colorectal ApcMin/+.

Imagerie en temps réel des cellules myéloïdes Dynamique Apc Min / + Intestinale tumeurs par Spinning Disk microscopie confocale

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

L’objectif global de cette procédure est de visualiser la dynamique des cellules myéloïdes dans les tumeurs intestinales d’un animal vivant. Ceci est accompli en injectant d’abord des molécules fluorescentes et de l’atropine dans une souris PC min. Dans un deuxième temps, l’intestin est préparé pour l’imagerie et la souris est positionnée sur la platine du microscope.Dans la dernière étape, des images de la tumeur à l’intérieur de l’animal vivant sont acquises, ce qui permet finalement de faire tourner le disque confocal. La microscopie peut être utilisée pour visualiser le comportement des cellules myéloïdes dans les tumeurs de souris PC en direct pendant plusieurs heures. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cancer, telles que quel est le rôle des cellules humaines dans le cancer colorectal ?Commencez par utiliser du ruban adhésif de laboratoire pour fixer deux lamelles de recouvrement sur l’insert de platine de la plate-forme d’imagerie microscope. Placez ensuite l’insert sur la scène et nettoyez-le avec des lingettes imbibées d’alcool. Ensuite, tournez le stérilisateur à billes chaudes à 250 degrés Celsius, puis stérilisez les instruments chirurgicaux pendant 30 secondes pendant que les outils refroidissent.Placez ce couvercle en polystyrène entre deux trempages de laboratoire sur la paillasse de chirurgie. Ensuite, lorsque la souris respire profondément et lentement, placez l’animal sur la scène chirurgicale sur son flanc et rétroorbitaire. Injectez la solution d’anticorps DExT strand, rod Domine et GR one.Après l’injection, retournez la souris sur le dos avec son nez dans le cône d’anesthésie et utilisez un rasoir électrique pour retirer les poils de la surface ventrale et du membre postérieur gauche de l’animal. Lorsque la fourrure a été enlevée, placez un nouveau trempage de laboratoire sur la scène chirurgicale pour éviter la contamination des poils, puis désinfectez la surface ventrale de l’animal avec des lingettes imbibées d’alcool et de la bétadine. Ensuite, par voie sous-cutanée, injectez la solution d’atropine dans un flanc de la souris, puis utilisez des ciseaux et une paire de pinces pour faire une incision ventrale d’un centimètre à travers la peau et le péritoine.Retirez délicatement trois à quatre centimètres d’intestin et identifiez une ou plusieurs tumeurs à imager. Positionnez ensuite l’anse de l’intestin contenant la tumeur d’intérêt sur le dessus d’une fente de microscope en verre. Placez quelques gouttes de super colle le long de l’intestin pour la fixer à la lame après que la colle ait séché pendant une minute, utilisez un marqueur pour tracer une ligne sur la lame pointant vers la tumeur afin de faciliter sa localisation lors de l’imagerie.Maintenant, transférez soigneusement la souris sur la platine du microscope avec sa face ventrale vers le bas et son nez dans le cône nasal. Fixez la ligne d’anesthésie avec du ruban adhésif de laboratoire, puis repositionnez la configuration de manière à ce que l’intestin soit au centre de l’une des fenêtres coulissantes du couvercle. Fixez doucement la lame avec du ruban adhésif et fixez la sonde de l’oxymètre au membre gauche de la souris pour suivre ses fréquences cardiaque et respiratoire ainsi que les niveaux de saturation artérielle en oxygène.Couvrez ensuite la souris avec la couverture chauffante pour éviter l’hypothermie et diminuer la concentration de fluor ISO pour l’imagerie. Enfin, dans la fenêtre d’acquisition multidimensionnelle, cliquez sur acquérir pour démarrer l’acquisition. Une fois l’acquisition terminée, le film est enregistré et sauvegardé à l’aide d’un logiciel Mars.En utilisant la microscopie confocale à disque rotatif, les tissus non tumoraux et tumoraux. Dans l’intestin grêle d’un PC, les souris peuvent être visualisées à partir de la surface séreuse après l’injection intraveineuse de dextran rodine fluorescent et d’un antigène lymphocytaire à six locus complexes G 6 47, l’anticorps conjugué, les vaisseaux sanguins et les cellules polymorphonucléaires peuvent être détectés respectivement. Des plaques IP qui sont des agrégations de tissu lymphoïde et pleines de cellules myéloïdes peuvent également être facilement observées.Les Crips de l’intestin grêle sont entourés de vaisseaux sanguins et de cellules myéloïdes. Le tissu tumoral est souvent plus vascularisé et plus infiltré par les cellules myéloïdes, et la structure des Crips est moins bien organisée en fonction de la taille de la tumeur. L’expression de l’ECFP d’actine par la couche musculaire lisse peut parfois rendre difficile la réalisation d’une focalisation aiguë de l’épithélium intestinal comme on peut l’observer sur cette image, la dynamique des cellules myéloïdes dans les tumeurs peut être suivie en temps réel pendant quelques heures comme le démontre ce film, tandis que les neutrophiles G one positifs circulent dans les vaisseaux sanguins et patrouillent les tissus.D’autres cellules myéloïdes, principalement des macrophages, entourent les Crips et sont moins modales. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser la dynamique des cellules myéloïdes dans les tumeurs intestinales chez les animaux vivants.

real-time-imaging-myeloid-cells-dynamics-apcmin-intestinal-tumors

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous montrons la méthode pour effectuer la microscopie intravitale de la rate à l'aide des parasites du paludisme transgéniques GFP et la quantification de la mobilité et la circulation sanguine du parasite au sein de cet organe.

Microscopie intravitale de la rate: Analyse quantitative de la mobilité des parasites et la circulation sanguine

Cette vidéo décrit l’imagerie de cellules T CD8 résidentes infiltrant la tumeur marquées avec des anticorps couplés par fluorescence dans des tranches de tumeurs pulmonaires humaines. Cette technique permet d’analyser en temps réel la migration des lymphocytes T CD8 à l’aide de la microscopie confocale.

Analyse en temps réel de la migration des lymphocytes T résidents dans différentes régions tumorales à l’aide de la microscopie confocale

L’immunité adaptative est contrôlée par des 'synapses immunologiques' dynamiques formées entre les lymphocytes T et les cellules présentatrices d’antigènes. Ce protocole décrit des méthodes d’étude des cellules endothéliales à la fois en tant qu’APC physiologiques sous-étudiées et en tant que nouveau type de « modèle d’APC cellulaire planaire ».

Une cellule endothéliale Planar Modèle for Imaging Dynamics Synapse immunologique

Nous détaillons un protocole pour surveiller le comportement des neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentériques à l’état d’équilibre et dans des conditions inflammatoires en utilisant la microscopie confocale intravitale sur des souris anesthésiées.

Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

Les mécanismes qui régissent la motilité interstitielle des cellules CD4 T effecteurs aux sites d'inflammation sont relativement peu connus. Nous présentons une approche non invasive pour visualiser et manipuler dans des cellules in vitro -primed T CD4 dans le derme de l' oreille enflammée, ce qui permet pour l' étude du comportement dynamique de ces cellules in situ.

Imagerie CD4 T Cellule interstitielle Migration dans les Derme Enflammé

Un microscope perfectionné permettant de rapides et de haute résolution d’imagerie de la membrane plasmique isolée et le volume intracellulaire environnant, est présenté. L’intégration de la filature de microscopie de fluorescence de réflexion interne disque et total dans un seul montage permet de vivre des expériences d’imagerie à des vitesses d’acquisition élevée jusqu'à 3,5 s par la pile de l’image.

Visualiser la Formation d’adhérences dans les cellules par le biais de pointe tourne disque-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Nous décrivons une méthode pour visualiser gFP-étiquetée IELs utilisant l'imagerie intravitale de l'intestin grêle murine par microscopie confocale de disque de rotation inversée. Cette technique permet le suivi des cellules vivantes dans la muqueuse jusqu'à 4 h et peut être utilisée pour étudier une variété d'interactions intestinales immunisées-épithéliales.

Imagerie intravitale des lymphocytes intraépithéliales dans l'intestin grêle de Murine

Ici nous présentons une méthode robuste et détaillée d'analyse de dynamique de microtubule dans les cellules synchronisées dans prometaphase utilisant la microscopie confocale de disque de filature de cellules vivantes et le traitement d'image MATLAB-basé.

Mesure de la dynamique des microtubules par la microscopie du disque filature dans des spindles mitotiques monopolaires

Nous présentons un protocole pour l’implantation chirurgicale d’une fenêtre optique stabilisée à demeure pour l’imagerie à résolution subcellulaire du pancréas murin, permettant des études en série et longitudinales du pancréas sain et malade.

Fenêtre stabilisée pour l’imagerie intravitale du pancréas murin

Le protocole présente un nouvel outil pour simplifier l’imagerie intravitale à l’aide de la microscopie confocale inversée.

Approche simplifiée de l’imagerie intravitale pour la surveillance à long terme de la dynamique du tissu épithélial sur un microscope confocal inversé

Cet article démontre une méthode pour visualiser et quantifier la motilité et le contact de la microglie avec les points postsynaptiques de la rétine à l’aide de la microscopie confocale à disque tournant.

Imagerie en direct et caractérisation de la dynamique de la microglie et des interactions avec les synapses dans la rétine murine malade

Découvrez la dynamique des cellules myéloïdes dans les tumeurs intestinales du modèle Apc Min/+ par microscopie confocale à disque tournant. Cette méthode permet d'observer en temps réel le comportement cellulaire dans le cancer colorectal.

Imagerie en temps réel des cellules myéloïdes Dynamique Apc^{Min / +} Intestinale tumeurs par Spinning Disk microscopie confocale

Explorer plus de vidéos