Génération de Enterobacter Sp. UEE auxotrophes utilisant mutagénèse par transposon

L’objectif global de l’expérience suivante est de produire des TRO d’une souche bactérienne de type sauvage qui se développent dans un milieu de sels minimal complété par du glucose. Ceci est réalisé en transformant une zone de transpo en souche hôte de type sauvage pour obtenir une population de bactéries résistantes à la mycine canna avec transposition aléatoire sur les inserts. Ensuite, les transformants sont criblés par placage réplique, qui identifie les TRO qui se développent sur un milieu riche, mais ne parviennent pas à se développer sur un minimum de sels, un milieu complété par du glucose.

Ensuite, l’ADN du mutant est digéré, ligaturé et transformé en e coli afin d’obtenir un plasmide contenant le transposon flanqué à chaque extrémité de segments du gène interrompu. On obtient des résultats qui montrent l’identité présumée du gène interrompu sur la base du séquençage de l’ADN et de l’analyse de base de l’outil de recherche d’alignement local. Le transposon utilisé dans cette technique a une origine de réplication, un gène résistant à la kanamycine et des extrémités en mosaïque.

Pour transposer la liaison aux protéines. Il manque le gène de la protéine transposée et nous devons donc ajouter ce gène de transposition avec le fragment d’ADN du transposon, puis le complexe entre l’ADN du transpos et la protéine est électroporé dans l’hôte. Les principaux avantages de l’électroporation sont l’élimination du besoin de transduction ou de conjugaison.

L’absence d’une transposition d’un gène produit généralement des inserts stables et la présence d’une origine de réplication et d’un gène de résistance à la CIN permet d’identifier facilement le gène muté, qui est récupéré sous la forme d’un plasmide recombinant. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la physiologie microbienne, telles que l’identification des gènes nécessaires à la biosynthèse des acides aminés, des acides nucléiques et des vitamines. J’ai eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque je cherchais des gènes de résistance aux métaux chez l’espèce d’enterobacter YSU et j’ai décidé de l’incorporer dans un laboratoire de physiologie microbienne que je développais pour électroporer des cellules compétentes en utilisant une culture nocturne d’espèces d’enterobacter

YSU prépare une dilution de un à 20 dans un milieu LB frais et incube à 30 degrés Celsius et 120 tr/min à un OD 600 entre 0,4 et 0,6. Lorsque les cellules ont atteint la bonne densité, refroidissez-les sur de la glace pendant cinq minutes, puis centrifugez-les à quatre degrés Celsius et 7 000 G pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et utilisez un volume égal d’eau glacée pour le Resus.

Mettez les cellules centrifugeuses en suspension à quatre degrés Celsius et 7 000 G pendant cinq minutes. Après avoir répété le lavage, jetez le surnageant et, avec de l’eau glacée, suspendez les cellules dans un volume égal au volume de la pastille cellulaire. Ensuite, ajoutez 0,5 microlitre de la zone de transport à 40 microlitres de cellules.

Ensuite, placez le mélange de la zone de transpo de la cellule dans un appareil d’électroporation glacé et tapotez le mélange au fond du Q Vet pour choquer les cellules à 25 micro phs, 200 ohms et 2,5 kilovolts. Ajoutez immédiatement 960 microlitres de milieu SOC stérilisé par filtre mélangé par pipetage de haut en bas avant de transférer les cellules dans un tube micro-fuge stérile de 1,5 millilitre. Incuber les cellules à 30 degrés Celsius et 120 tr/min pendant 45 à 60 minutes.

Ensuite, étalez 100 microlitres de cellules sur une plaque de gélose LB avant d’incuber la plaque pendant la nuit à 30 degrés Celsius pour griller les transformants. Collez une grille sur le couvercle d’une boîte de Pétri vide de 100 x 15 millimètres. Tracez une ligne sur le fond d’une plaque de gélose LB et utilisez un petit morceau de ruban adhésif pour l’ancrer au couvercle grillagé afin que la grille soit visible à travers la tarière avec un cure-dent stérile.

Choisissez un seul transformant et repérez-le au centre d’un carré de la grille, repérez un autre transformant dans un carré adjacent et continuez jusqu’à ce que la plaque soit pleine. Ensuite, incubez-le toute la nuit à 30 degrés Celsius. Il s’agit de la plaque maîtresse de chaque plaque qui a été quadrillée.

Faites une pile de trois plaques de tarière fraîches numérotées de un à trois. Numéro un pour LB can, numéro deux pour M, neuf can. Et le numéro trois pour LB peut sécher les plaques à l’envers pendant la nuit à 37 degrés Celsius avant utilisation.

Après avoir tracé une ligne sur le dessus de chaque plaque comme démontré précédemment, utilisez de l’éthanol à 70 % pour essuyer la réplique de l’outil de placage et placez un carré de veltin stérile dessus avant de serrer le carré de veltin vers le bas. Ensuite, alignez la ligne sur la plaque maîtresse avec une ligne tracée sur la pince et placez la plaque sur le carré de veltin. Appliquez une légère pression pour transférer les bactéries de la plaque vers le carré de veltin.

Alignez ensuite la ligne tracée sur la plaque numéro un avec la ligne de la pince et placez-la sur le carré de veltin. Appliquez une légère pression pour transférer les bactéries du carré de veltin à la plaque. Retirez la plaque numéro un.

Jetez le carré de velours pour adolescents dans un bécher d’eau et placez un carré de velours propre et stérile sur la réplique de l’outil de placage. Comme précédemment, alignez la ligne de la plaque numéro un avec la ligne de la pince et placez-la sur le nouveau carré de velours. Appliquez une légère pression pour transférer les bactéries de la plaque numéro un vers le carré de velours.

Retirez la plaque numéro un, alignez la ligne tracée sur la plaque numéro deux avec une ligne sur la pince et placez-la sur le carré de velours. Appliquez une légère pression pour transférer les bactéries du carré de velours adolescent dans l’assiette numéro deux, retirez la plaque numéro deux après avoir répété le processus pour la plaque numéro trois, incubez les plaques pendant la nuit à 30 degrés Celsius. Les colonies qui poussent sur les deux plaques de boîte LB mais ne parviennent pas à se développer sur M neuf plaques sont considérées comme des trésors.

Choisissez les TRO de la plaque numéro un et soyez-les sur une nouvelle plaque de boîte LB. Après une nuit d’incubation, choisissez trois colonies dans la plaque de stries et étalez-les sur une nouvelle plaque de boîte LB le lendemain. Repérez les colonies de la plaque nouvellement striée sur une plaque de grille de boîte LB et utilisez cette plaque pour répéter le placage de réplique comme cela vient d’être démontré.

Effectuer un sauvetage génétique. Utilisez une colonie mutante isolée pour faire pousser une livre de trois millilitres. Peut cultiver pendant la nuit à 30 degrés Celsius.

Ensuite, utilisez un kit de purification d’ADN génomique disponible dans le commerce pour purifier l’ADN d’un millilitre de la culture à 0,025 unité de BFUC une endonucléase de restriction à 14 microlitres d’un microgramme par microlitre d’ADN génomique dans une réaction de 20 microlitres sur glace. Ensuite, incubez la réaction à 37 degrés Celsius pendant 25 minutes avant de la transférer à 80 degrés Celsius pendant 20 minutes. Pour inactiver l’enzyme, analysez trois microlitres d’ADN partiellement digéré sur un gel AROS à 0,8 %.

Ensuite, ajoutez 800 unités d’ADN ligase T quatre à 15 microlitres d’ADN génomique partiellement digéré dans une réaction de 500 microlitres et incubez la réaction à quatre degrés Celsius pendant la nuit du lendemain. Précipitez l’ADN ligaturé en ajoutant 50 microlitres d’acétate de sodium à trois molaires pH 5,5 et un millilitre d’éthanol à 95 % incubez à moins 20 degrés Celsius pendant 20 minutes. Micro-fuge l’ADN à quatre degrés Celsius et 13 500 G pendant 10 minutes.

Videz les sites supernat, sept à 70 % d’éthanol pour laver le granulé. Séchez-le dans un concentrateur centrifuge sous vide et utilisez 10 microlitres d’eau sans nucléases. Pour remettre l’ADN en suspension, utilisez quatre microlitres d’ADN remis en suspension pour transformer par électroporation la souche e coli, ECD 100 DPIR ou ECD 100 DPIR un 16 inoculer cinq millilitres de LB peut milieu avec une seule colonie.

Cultivez-le à 37 degrés Celsius et 120 tr/min pendant la nuit. Le lendemain, après avoir purifié l’ADN de toute la culture, utilisez Joe one pour digérer 14 microlitres du plasmide. Analysez 10 microlitres de plasmide non digéré et digéré sur un gel d’agarro à 0,8 %.

Après le séquençage du plasmide, recherchez la séquence cinq première GA, G-A-C-A-G trois prime, qui est les sept dernières paires de bases de la transposée sur et sera suivie de la séquence du gène interrompu. Utilisez blast pour déterminer la fonction possible du gène interrompu. Une électroporation réussie a donné plusieurs milliers de transformants, chacun avec au moins une transposée sur insert dans cette figure.

Les carrés noirs montrent deux colonies qui se sont développées sur la plaque de boîte LB, mais pas sur la plaque moyenne minimale M neuf. Ces TRO contenaient probablement des interruptions dans des gènes impliqués dans la synthèse d’un acide aminé, d’un acide nucléique ou d’une vitamine, qui se trouvent tous dans lb, mais pas dans M nine, milieu minimal. Les 86 autres colonies n’ont pas présenté d’interruption d’un gène nécessaire à la croissance sur M neuf.

Comme on le voit ici, l’ADN génomique partiellement digéré d’un TRO isolé va de plus de 10 kilobases à moins de 0,5 kilobase. Le plasmide sauvé se compose du transposon de deux kilobases et de l’ADN flanquant de l’hôte. Cette figure montre un résultat d’explosion pour un plasmide isolé d’un tro.

La séquence interrompue est similaire à un gène d’enterobacter cloy pour ate mutase, qui est impliqué dans la biosynthèse de la L tyrosine, de la L phénylalanine et du L tryptophane en raison de plusieurs étapes de croissance nocturnes. Cette technique peut être complétée en 10 ou 11 jours si elle est correctement exécutée. Lors de la réplique du pla, il est important de se rappeler de ne pas étaler les plaques, et vous pouvez éviter cela en utilisant des plaques sèches et en ne déplaçant pas les plaques une fois qu’elles ont été placées sur le carré de veltin.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que des expériences de clonage ou de complémentation peuvent être effectuées pour vérifier la fonction du gène identifié. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des TRO à l’aide de la mutagenèse par transposon et de la façon d’identifier provisoirement les gènes mutés.