Name: Dun spot 2DE-Gel de la fonction des protéines: Leçons apprises De HS1 dans la leucémie lymphoïde chronique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Découvrez une approche protéomique combinant électrophorèse bidimensionnelle et spectrométrie de masse pour identifier des marqueurs pronostiques dans la leucémie lymphoïde chronique. Cette méthode permet d'isoler des cellules leucémiques primaires et d'analyser l'expression différentielle des protéines.

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Nous remercions l&#39;Unité des affections malignes lymphoïdes, Elisa dix Hacken, Lydia Scarfo, Massimo Alessio, Antonio Conti, Angela Bachi, et Angela Cattaneo. Ce projet a été soutenu par: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant et moléculaire Programme spécial Clinical Oncology - 5 pour mille # 9965) CS et BA conçus l&#39;étude, les expériences réalisées, ont analysé les données et rédigé le manuscrit. MTSB, UR, FBPR aidé à la rédaction du manuscrit. PG et FCC conçus les échantillons de l&#39;étude ont fourni des patients et des données cliniques.

REMARQUE: Tous les échantillons de tissus ont été obtenus avec l'approbation du comité d'éthique de l'hôpital San Raffaele (Milan, Italie). 1. échantillons de tissus humains et de cellules purification (Figure 1) REMARQUE: les lymphocytes leucémiques ont été obtenues à partir du sang périphérique (PB) de patients atteints de LLC, diagnostiqués selon Mulligan et al 9. 1.1) cellules leucémiques séparation de PB <ol><li> Recueillir PB en collecte de sang tubes Vacutainer avec héparine de sodium. </li><li> Transférer le sang dans un tube de 15 ml et ajouter des cellules B humaines enrichissement cocktail à 50 ul / ml de sang entier. Bien mélanger et incuber 20 min à température ambiante. </li><li> Diluer l'échantillon avec un volume égal de PBS + 2% de FBS, mélanger le sang avec douceur et précaution superposition sur le Ficoll, veillant à ne pas briser l'interface. Utilisez au moins une partie de Ficoll à 2 parties de l'échantillon dilué (soit 4 ml de Ficoll + 10 ml de sang dans un 15 ml tube). </li><li> Centrifuger à 400 xg, à température ambiante (20 ° C) pendant 20 min sans frein. Les cellules mononucléaires seront à l'interface. </li><li> Aspirer soigneusement l'interface pour récupérer les cellules et les placer dans un nouveau tube. Laver les cellules une fois avec du PBS et on centrifuge à 300 x g, 4 ° C dans l'obscurité pendant 5 minutes. Le culot sera en bas. </li><li> Jeter le surnageant. Reprendre le culot dans le surnageant restant en tapotant le tube d'avant en arrière avec les doigts. On dilue le culot avec 10 ml de milieu RPMI complet (RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal et 15 mg / ml de gentamicine) et compter les cellules à l'aide de la méthode d'exclusion au bleu Trypan. </li></ol> 1.2) L'évaluation de la pureté REMARQUE: Pureté de toutes les préparations doit toujours être supérieure à 99%. <ol><li> Incuber 100 pi de suspension cellulaire purifiée avec les anticorps suivants (disponibles dans le commerce; voir le tableau des matériaux): CD3 FITC (5 pi / test), CD14 PE (5 pi / essai), CD19 DPE (6 pi / essai), CD16-CD56 PC5 (2 pi / essai), CD5 PC7 (4 pi / essai), pendant 20 min à 4 ° C dans un Tube FACS. </li><li> Laver l'échantillon avec 4 ml de PBS (centrifugeuse pendant 5 min à 300 g) et vérifier la pureté par flux cytometry.Check dans le complot du% de cellules leucémiques (&gt; 99%) qui co-expriment CD19 et CD5 sur leur surface comme représenté sur la figure 1 (6). Veiller à ce que les préparatifs sont pratiquement dépourvues de NK, lymphocytes T et les monocytes en cochant la% de CD3, CD14 et CD16-56 dans le complot, qui devrait être proche de zéro. </li></ol> 1.3) Les échantillons de stockage <ol><li> Pour les études protéomiques, collecter 25 x 10 6 cellules dans un tube de 1,5 ml, les cellules de centrifugation à 300 g pendant 10 min, jeter le surnageant et lyophiliser boulettes pendant 4 heures. Conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation. </li><li> Pour les essais de validation, remettre les cellules en RPMI complet (quantité dépend de l'analyse en outre que c'estchoisi) et passez à l'étape 4. </li></ol> 2 électrophorèse bidimensionnelle (2-DE) (figure 2) 2.1) isoélectrofocalisation (IEF) <ol><li> Solubiliser les cellules CLL pastilles avec un volume final de 380 ul de 2-DE tampon (344 ul d'une solution RBthio (9 M d'urée, Tris 10 mM, 4% de CHAPS), 30 pl de 65 mm de DTT, 6 ul de 2% IPG ampholine tampon pH 7.4). </li><li> Appliquer les échantillons de protéines (1 mg) à 18 bandes IPG (pH 4-7) et effectuer IEF suivant le protocole standard telle que décrite par Conti et al. 10 </li><li> Equilibrer les bandes dans 2 ml de tampon d'équilibration (EB: tampon 50 mM pH 8.8 contenant du Tris-HCl 6 M d'urée, 30% de glycerol, 2% de SDS), additionné de 2% de frais de DTT pendant 15 minutes à température ambiante. Jeter EB + TNT et ajouter 2 ml de EB complétés avec 2,5% Iodoacetamide. Incuber pendant 15 min à température ambiante sur un agitateur oscillant. </li></ol> 2.2) SDS-PAGE <ol><li> Sécher les plaques sur un papier sans toucher le gel pour éliminerl'excès de EB. Chargez chaque bande sur le dessus d'un gel de 9-16% de SDS-PAGE gradient. Ajouter une petite quantité d'électrophorèse SDS-tampon (Tris 25 mM, glycine 192 mM, SDS 0,1% p / v) sur le dessus du gel, pour faciliter le chargement de la bande. </li><li> Sceller le gel par addition de ~ 5 ml de solution d'agar (0,8%) afin d'éviter de flotter la bande, puis l'assemblage de l'unité d'électrophorèse et remplir avec du tampon SDS-électrophorèse. Effectuer la course à 60 mA / gel pendant 4 heures à 4 ° C. </li><li> Retirer le gel de l'unité d'électrophorèse et le placer dans la boîte de bonne coloration. </li></ol> 2.3) coloration à l'argent pour préparative de gel <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> FIXER </td><td> 50% methanol 12% d'acide acétique 0,05% de formol </td><td> 2 heures (ou toute la nuit) * </td></tr><tr><td> TAMPON DE LAVAGE </td><td> 35% Ehanol </td><td> 20 min (répéter l'étape trois fois) </td></tr><tr><td> SENSIBILISATION </td><td> 0,02% de thiosulfate de sodium </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> WASH </td><td> H 2 O </td><td> 5 min (répéter l'étape trois fois) </td></tr><tr><td> NITRATE D'ARGENT </td><td> 0,2% de nitrate d'argent 0,076% formol </td><td> 20 min </td></tr><tr><td> WASH </td><td> H 2 O </td><td> 1 min (répéter l'étape deux fois) </td></tr><tr><td> DÉVELOPPEUR </td><td> 6% de carbonate de sodium 0,0004% de thiosulfate de sodium 0,05% de formol </td><td> Jusqu'à ce que la coloration est suffisante </td></tr><tr><td> Arrêtez </td><td> 50% de méthanol </td><td> 30 min </td></tr><tr><td></td><td> * 2 heures est le temps minimum nécessaire pour fixation de la protéine </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. REMARQUE: les taches de protéines peuvent être visualisées par coloration des gels avec MS compatible coloration à l'argent 11. Toutes les solutions nécessairespour coloration à l'argent sont énumérées dans le tableau 1. <ol><li> Préparer environ 200 ml de chaque solution / gel et procéder comme indiqué dans le tableau 1. Ajouter délicatement chaque solution à la boîte de coloration contenant le gel. Effectuer toutes les incubations sur une plate-forme à bascule. </li><li> Après la coloration, enlever la solution d'arrêt et laisser le gel dans une solution de 1% d'acide acétique jusqu'à ce que l'acquisition. </li></ol> 2.4) Gel d'acquisition et d'analyse <ol><li> Acquérir des images à haute résolution à l'aide d'un densitomètre dans les 3 jours à partir de la coloration. </li><li> Analyser les modèles de protéines 2-D en utilisant un logiciel de 2-DE gels. REMARQUE: Le logiciel permet une comparaison d'image rapide et fiable. <ol><li> Créez un projet en choisissant "créer un nouveau projet" dans le menu contextuel. Créez un dossier et importer les gels en choisissant "images de gel d'importation" avec .tif, png. ou .gel prolongation. </li><li> Une fois que les gels sont importés et ajoutés à la workspace, effectuer une détection d'angle automatique en sélectionnant les gels pour la détection de place et en choisissant "edit&gt; place&gt; détecter" dans le menu. </li><li> Ensuite, effectuer une soustraction de fond en sélectionnant dans le menu "fond soustraction". Remarque: Après cela, il est possible de comparer plusieurs gels et de détecter des différences ou des similitudes par l'analyse quantitative et / ou qualitative. </li></ol></li></ol> 3 Identification des protéines par MALDI-TOF MS (Figure 3) 3.1) La digestion des protéines <ol><li> Rincer le gel avec des taches d'eau et d'accise d'intérêt à partir de gels soit par manuel (coupant avec un scalpel propre) ou par excision automatisée. </li><li> Laver les particules de gel avec de l'eau (100-150 pi), tourner vers le bas (30 sec à 400 xg) et enlever le liquide. </li><li> Ajouter un volume égal (en fonction du volume de gel) de CH 3 CN pour les morceaux de gel et attendre pendant 10-15 min jusqu'à ce que les morceaux de gel se rétrécir. Sécher les particules de gel ina centrifugeuse sous vide. </li><li> Ajouter 75 à 100 ul de 10 mM de dithioérythritol dilué dans 50 mM de NH 4 HCO 3 et incuber pendant 30 min à 56 ° C (étape de réduction). Réduction de nouveau les morceaux de gel avec CH 3 CN comme décrit à l'étape 3.1.3. </li><li> Procéder à alkylation en ajoutant 75-100 ul d'une solution à 55 mM Iodoacetamide dilué dans 50 mM NH 4 HCO 3 et incuber pendant 20 min à température ambiante dans l'obscurité. </li><li> Réduction de la taille des morceaux de gel une fois avec CH 3 CN en utilisant un volume suffisant pour recouvrir les morceaux de gel comme décrit dans l'étape 3.1.3. Sec dans une centrifugeuse sous vide. </li><li> Réhydrater les particules dans un tampon contenant 25 mM de NH 4 HCO 3, 5 mM de CaCl2, et 12,5 ng / ul de trypsine à 4 ° C pendant 20 min. Utilisez un volume suffisant de tampon pour couvrir les morceaux de gel. Eliminer le surnageant de non absorbé par les morceaux de gel et ajouter mM NH 25 4 HCO 3, 5 mM de CaCl2 sans trypsine à cover le gel. </li><li> Laisser les échantillons à 37 ° C au moins 3 heures (le délai minimum requis pour le peptide digestion) pour la nuit. </li></ol> 3.2) Spectrométrie de masse analyse (technique de gouttelettes séchées) <ol><li> Coin 1 ul aliquote de chaque échantillon sur une plaque MALDI en acier inoxydable et mélanger avec 1 pi d'α-cyano-4-hydroxycinnamique comme matrice, préparées dans 50% de CH 3 CN et 0,1% de TFA. </li><li> Obtenir des spectres de masse sur un spectromètre de masse MALDI-TOF. Accumuler environ 200 spectres par endroit, en ajustant l'intensité du laser pour éviter la saturation du signal ou pour augmenter le signal. spectres de processus via le logiciel Data Explorer comme décrit ci-dessous: <ol><li> Importez le fichier dat et effectuer la correction de base en choisissant "processus&gt; correction de base". Calibrer masses en utilisant les produits d'autolyse de la trypsine et les sommets de la matrice en choisissant "processus&gt; étalonnage de masse&gt; étalonnage manuel; sélectionnez pics proches de m / z 855,1 et 2163,1 by faisant glisser à gauche et sélectionner les masses de référence correspondant, puis cliquez sur «complot» et «s'applique calibrage" dans la fenêtre de calibrage manuel. </li><li> Régler le seuil de détection de crête ("pic&gt; détection de crête"), dupliquer la trace active ("affichage&gt; dupliquer trace active"), sélectionnez la nouvelle trace et effectuer la deisotoping ("pic&gt; deisotoping"). Utilisation de la macro "getpeaklist", générer une liste de masses à être utilisé pour l'identification. Si nécessaire, supprimer manuellement les signaux de bruit cueillis comme des pics pour nettoyer la liste et obtenir une meilleure identification. </li></ol></li><li> Identifier les protéines par la recherche d'une base de données de protéines non-redondant complet utilisant profonde et Mascot les moteurs de recherche 12. <ol><li> Utilisez les paramètres suivants dans toutes les recherches: on a manqué clivage par peptide, l'oxydation de la méthionine comme modification dans une variable, la cystéine carbamidomethylation que la modification fixe et une initial masse tolérance de 50 ppm. </li></ol></li></ol> 4. cytosquelette des tests d'activité (Figure 4) REMARQUE: Remettre en suspension les cellules purifiées à l'étape 1 dans du milieu RPMI complet (10 6 cellules / 200 ul). 4.1) Migration dosage. Cet essai permet la quantification de la capacité de migration des cellules analysées (lymphocytes). Utiliser une chambre Transwell de 6,5 mm de diamètre et 5,0 pm de taille de pores et effectuer les essais en triple exemplaire. Optimiser la taille des pores et le temps de migration (étape 4.1.3) dans le cas de différents types de cellules. <ol><li> Préparer la chambre inférieure en ajoutant 600 ul de RPMI complet avec ou sans stimuli spécifiques (SDF-1) pour mesurer la migration spontanée et induite par l'respectivement. </li><li> Mettre la chambre supérieure et à laisser le système s'équilibrer pendant 30 minutes à 37 ° C dans l'incubateur. </li><li> Semences 10 6 cellules / 200 pi dans la chambre haute (nombre total de cellules) et incuberla plaque pendant 4 heures à 37 ° C dans l'incubateur. </li><li> Retirer la chambre haute, recueillir les médias dans la chambre inférieure et laver la chambre basse une fois avec 1 ml de PBS. Recueillir le PBS dans le tube. </li><li> Centrifugeuse 5 minutes à 300 g, éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 500 ul de PBS. </li><li> Par cytométrie en flux, compter le nombre de cellules ayant migré après 1 min de l'acquisition. Dans le cas d'une population cellulaire isolée, il n'est pas nécessaire d'ajouter un anticorps de surface. Vérifiez le nombre de cellules dans un complot point bidimensionnel considérant les disperse secondaires des cellules et le nombre d'événements visualisés en 1 min, ce qui est le nombre à utiliser pour le calcul. </li><li> Calculer l'indice de migration (MI) que: <img alt="L'équation 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq1.jpg"></li></ol> 4.2) test d'adhérence. Ce test permet de mesurer la capacité d'adhérence des cellules. Effectuer les essais en triple exemplaire. <ol><li> Pré-manteau 96 wells plaque (-fond plat) avec 50 ul / puits soit de 2% de BSA-PBS (comme arrière-plan) ou 1 ug d'ICAM-1 dilué dans du PBS pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver la plaque deux fois avec du PBS et de bloquer les sites non spécifiques par addition de 2% de BSA-PBS (100 pl / puits) pendant 1 heure à 37 ° C. </li><li> Dans les cellules attendant de remettre les à 5 x 10 6 / ml dans RPMI complet, les étiqueter avec tracker cellule 1 mM CMFDA-vert et incuber 30 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 1 x 10 6 cellules / puits dans les puits pré-enduits après avoir écarté la solution de blocage (étape 4.2.2) et incuber 1 h à 37 ° C. </li><li> Quantifier l'adhérence à l'aide d'un lecteur ELISA (excitation filtre: 485 nM, filtre d'émission: 535 nm). Effectuer une première mesure sur l'apport total (INPUT). </li><li> Laver la plaque doucement avec 2% de BSA-PBS (200 pl / puits) 4 fois (x). Effectuer une lecture de la plaque après chaque étape de lavage (adhérence de x). </li><li> Après soustraction de fond pour chaque mesure, calculer ADHES spécifiquesion (ADHESION): <img alt="L'équation 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq2.jpg"></li></ol> 4.3) essai de polymérisation. Il s'agit d'un test colorimétrique qui quantifie la polymérisation de l'actine F. Effectuer les essais en triple exemplaire. <ol><li> Remettre en suspension 1x10 ^ 6 cellules dans 100 pl d'préchauffé RPMI complet et ajouter le stimulus spécifique (c.-à-α-IgM 20 pg / ml) pendant 10 min. </li><li> Arrêter la réaction avec 400 pl de 4% de paraformaldéhyde et de fixer les cellules pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Laver 3 fois avec du PBS (centrifugation à 300 xg pendant 5 min, 4 ° C). </li><li> Jeter le surnageant et perméabiliser les cellules avec du PBS-saponine 0,2% (200 ul) sur de la glace pendant 2 min. </li><li> Laver 3 fois avec du PBS-saponine 0,1% (centrifugeuse à 100 g pendant 5 min, 4 ° C), jeter le surnageant et remettre en suspension dans 100 ul de PBS-saponine 0,1%. </li><li> Colorer avec phalloïdine-AlexaFluor 488 (3 pg / ml) pendant 30 min à la salle tEMPÉRATURE dans l'obscurité. </li><li> Laver 3 fois avec du PBS-0.1% saponine. Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 300 ul de PBS. </li><li> Quantifier la quantité de F-actine par cytométrie de flux, calcul de l'intensité Floraison moyenne (MFI) de la phalloïdine. Analyser les données générées dans une parcelle de dimension unique afin de produire un histogramme basé sur l'intensité de fluorescence, la valeur de MFI est indiqué dans le rapport de graphique. </li><li> Mesurer la polymérisation d'actine (Δ F-actine) comme: <img alt="L'équation 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq3.jpg"></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

<html> Le but de ce manuscrit est de décrire un protocole optimisé pour l&#39;identification de molécules impliquées dans la pathogenèse de la CLL, même si cette approche peut être étendue à d&#39;autres maladies et / ou d&#39;autres types d&#39;échantillons de 16 à 18. En comparant les profils protéomiques de 2 sous-ensembles de patients atteints de LLC, de bons vs mauvais pronostic 19, nous avons démontré que ils diffèrent dans l&#39;état de phosphorylation de HS1 et que son activation af...

La leucémie lymphoïde chronique (LLC), la leucémie de l&#39;adulte le plus fréquent dans les pays occidentaux, découle de l&#39;accumulation de CD5 + lymphocytes B néoplasiques monoclonaux et est cliniquement très hétérogène. Il peut être présent sous une forme pré-leucémique, définie comme une lymphocytose monoclonal cellules B (MBL) 1,2,3. Dans d&#39;autres cas, la maladie peut apparaître soit avec une évolutivité clinique, qui peut rester stable pendant des années avant d&#39;avoir besoin de traitement, ou comme une maladie progressive avec chemorefractory mauvais pronostic malgré le traitement. Enfin, elle peut évoluer en un lymphome de haut grade fréquemment mortelle (syndrome RS de Richter) 2,3,4. Les patients sont généralement classés en deux sous-ensembles principaux: bon et mauvais pronostic, basé sur un ensemble de facteurs pronostiques qui fournit des informations complémentaires sur les prédicteurs de l&#39;issue de la maladie et de la survie. L&#39;hétérogénéité clinique reflète probablement l&#39;hétérogénéité biologique. Un certain nombre de facteurs génétiques, microenvironnement et CEIl a été démontré facteurs llular de concourir à la pathogenèse de la maladie mais pas de mécanismes fédérateurs ont été trouvés 5. Dans le détail, plusieurs études ont démontré que les différences dans l&#39;évolution clinique de la maladie peuvent s&#39;expliquer en partie par la présence (ou l&#39;absence) de certains marqueurs biologiques qui ont une valeur pronostique de 6,7,8. Ces données ont démontré qu&#39;une meilleure compréhension de la biologie de la maladie pourrait fournir des indices supplémentaires pour la prise en charge clinique de la pathologie, par l&#39;identification de deux marqueurs pronostiques et cibles thérapeutiques. L&#39;objectif du présent document est de montrer comment une combinaison de différentes techniques de protéomique peut être utilisé pour l&#39;identification de protéines impliquées dans la LLC apparition et la progression. Notre approche démontre qu&#39;il est possible de rejoindre protéomique ensemble de base et les données cliniques 5. Dans le présent flux de travail, les cellules leucémiques primaires chez certains patients(Bon vs mauvais pronostic) sont isolés et les lysats cellulaires sont ensuite utilisés pour obtenir des cartes protéomiques. 2DE permet la caractérisation du profil protéomique d&#39;une population de cellules, y compris des modifications post-traductionnelles, donnant ainsi des informations indirectes sur l&#39;activité biologique de chaque protéine. Des lysats de cellules entières sont réglées par un premier passage de dimension sur la base du point isoélectrique, suivie d&#39;une seconde dimension sur un gel de polyacrylamide qui permet de résoudre les protéines en fonction de leur poids moléculaire. Analyse comparative des cartes protéomiques permet l&#39;identification de protéines différentiellement exprimés (à la fois en termes d&#39;abondance et de modifications post-traductionnelles) comme des taches sur le gel qui peuvent être coupés et analysés par spectrométrie de masse. Le rôle de chaque candidat peut alors être exploité par différents tests. Cette approche, limitée à CLL dans le manuscrit actuel, peut être facilement étendue à d&#39;autres maladies / échantillons, fournissant ainsi des informations sur la proteomic / les différences biologiques entre les deux groupes (c.-à-pathologiques vs normale, stimulés vs, de type sauvage non stimulées vs knockdown).

<table><tbody><tr><td>Acétonitril</td><td>MERCK</td><td>61830025001730&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate d’ammonium</td><td>SIGMA</td><td>A6141-500G</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithioérythritol</td><td>SIGMA</td><td>D9680-5G</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacétamide</td><td>SIGMA</td><td>I6125-25G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>SIGMA</td><td>223506-25G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, grade séquençage</td><td>ROCHE</td><td>11418475001</td><td></td></tr><tr><td>&alpha ;- acide cyano-4-hydroxycinnamique</td><td>SIGMA</td><td>C2020-10G</td><td></td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique</td><td>SIGMA</td><td>T6580</td><td></td></tr><tr><td>ZipTip&micro ;-C18</td><td>MILLIPORE</td><td>ZTC18M096</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep Cocktail d’enrichissement des cellules B humaines</td><td>STEMCELL</td><td>15064</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>EUROCLONE</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>DOMINIQUE DUTSCHER</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>SENTINEL DIAGNOSTICS</td><td>1114547</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>SIGMA</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>CD19</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>082A07770</td><td>ECD</td></tr><tr><td>CD5</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>082A07754</td><td>PC5</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>082A07746</td><td>FITC</td></tr><tr><td>CD14</td><td>BD</td><td>345785</td><td>PE</td></tr><tr><td>CD16</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>082A07767</td><td>PC5</td></tr><tr><td>CD56</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>082A07789</td><td>PC5</td></tr><tr><td>Ettan IPGphor 3 unité de mise au point isoélectrique</td><td>GE-Healthcare</td><td>11-0033-64&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Urée</td><td>SIGMA</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL Buffer</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0799</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>SIGMA</td><td>C2020-10G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>SIGMA</td><td>D9163-5G</td><td></td></tr><tr><td>IPGstrips</td><td>GE-Healthcare</td><td>17-1233-01&nbsp ;</td><td>pH linéaire 4-7 18cm</td></tr><tr><td>IPGbuffer</td><td>GE-Healthcare</td><td>17-6000-86</td><td>pH 4-7</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>SIGMA</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>PROTEAN II XL Cellule</td><td>BIO-RAD</td><td>165-3188</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>INVITROGEN</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamide</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0156</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>INVITROGEN</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>SIGMA</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>VWR</td><td>631000</td><td></td></tr><tr><td>Formol</td><td>BIO-OPTIQUE</td><td>05-K01009</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>VWR</td><td>9832500</td><td></td></tr><tr><td>Thiosulfate de sodium</td><td>FLUKA</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>Nitrate d’argent</td><td>FLUKA</td><td>85228</td><td></td></tr><tr><td>Dynamique moléculaire Densitomètre laser SI personnel</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageMaster 2D Platinum 5.0</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbonate de sodium</td><td>MERCK</td><td>A0250292</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF Voyager-DE STR</td><td>Logiciel</td> d’exploration de données de biosystèmes <td></td><td></td>appliqués</tr><tr><td>(version 3.2)&nbsp ;</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>chambre transwell 6,6 mm de diamètre</td><td>CORNING</td><td>3421</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>EUROCLONE</td><td>ECB2000L</td><td>AVEC L-GLUTAMINE</td></tr><tr><td>GENTAMICINE</td><td>SIGMA</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1</td><td>PREPROTECH</td><td>300-28A</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à fond plat 96 puits</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SANTA CRUZ</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1 R</td><td>& D Systems</td><td>720-IC</td><td></td></tr><tr><td>CMFDA</td><td>Life Thechnology</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>Green IgM</td><td>SOUTHERNBIOTECH</td><td>2020-02</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>SIGMA</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Saponine</td><td>SIGMA</td><td>S-7900</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin&nbsp ;</td><td>Life Thechnology</td><td>A12379</td><td>Alexa fluor 488</td></tr></tbody></table>

d&#39;un spot 2de-gel de la fonction des protéines: leçons apprises de hs1 dans la leucémie lymphoïde chronique

From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

L&#39;identification des molécules impliquées dans l&#39;initiation et la progression de la tumeur est essentielle à la compréhension de la biologie de la maladie et, en conséquence, pour la prise en charge clinique des patients. Dans le présent travail, nous allons décrire une approche protéomique optimisé pour l&#39;identification des molécules impliquées dans la progression de la leucémie lymphoïde chronique (LLC). Dans le détail, les lysats de cellules leucémiques sont résolus par électrophorèse en 2 dimensions (2DE) et visualisées sous forme de &quot;taches&quot; sur les gels de 2DE. Analyse comparative des cartes protéomiques permet l&#39;identification de protéines exprimées de façon différentielle (en termes d&#39;abondance et de modifications post-traductionnelles) qui sont cueillies, isolé et identifié par spectrométrie de masse (MS). La fonction biologique des candidats identifiés peut être testée par des dosages différents (c.-à-migration, l&#39;adhésion et la polymérisation de l&#39;actine F), que nous avons optimisé pour les cellules leucémiques primaires.

Nous avons isolé les cellules leucémiques primaires B forment PB de patients atteints de LLC et nous avons analysé les cartes protéomiques. Les échantillons (n = 104) ont été regroupées en deux sous-ensembles principaux sur la base des caractéristiques cliniques de chaque patient (mauvais pronostic vs bon pronostic) et l'analyse comparative des gels 2DE a été réalisée. L'analyse a permis d'identifier des points exprimés de manière différentielle entre les deux sous-ensembles (en ter...

Nous décrivons ici un protocole que les couples deux techniques de protéomique, à savoir 2 dimensions électrophorèse (2DE) et la spectrométrie de masse (MS), d&#39;identifier exprimés de manière différentielle / protéines modifiées post-traductionnelles entre deux ou plusieurs groupes d&#39;échantillons primaires. Cette approche, avec des expériences fonctionnelles, permet l&#39;identification et la caractérisation de marqueurs / cibles thérapeutiques pronostiques.

D&#39;un spot 2DE-Gel de la fonction des protéines: Leçons apprises De HS1 dans la leucémie lymphoïde chronique

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a ...

L’objectif global de l’expérience suivante est d’utiliser une approche protéomique combinée pour identifier des marqueurs pronostiques et/ou des cibles thérapeutiques potentiels dans les maladies humaines. Ceci est réalisé en isolant les cellules leucémiques primaires du sang périphérique du patient, porteuse d’un bon ou d’un mauvais pronostic, et en exprimant à la fois CD 19 et CD cinq marqueurs de surface à utiliser pour l’analyse protéomique dans un deuxième temps. Les lysats de cellules leucémiques sont résolus par électrophorèse bidimensionnelle ou deux de, et la comparaison des cartes protéomiques permet d’identifier des points exprimés différemment chez les patients de bon et de mauvais pronostic, qui peuvent ensuite être identifiés par spectrométrie de masse ou MS.Ensuite, différents tests peuvent être utilisés afin de valider et de disséquer le rôle des protéines identifiées dans l’histoire naturelle de la maladie. Les résultats montrent que l’état différent de phosphorylation de HS, détecté par deux de gels, est en corrélation avec le résultat clinique des patients. L’implication de cette technique s’étend au traitement de la leucémie lymphoïde chronique car elle peut aid

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Ce protocole décrit une approche permettant d’interroger les régions VDJ recombinées de la chaîne lourde d’immunoglobulines des lymphomes par séquençage profond et de récupérer le réarrangement VDJ et l’état d’hypermutation somatique pour délimiter l’architecture clonale de la tumeur individuelle. La comparaison de l’architecture clonale entre le diagnostic apparié et les échantillons de rechute révèle les modes d’évolution clonale du lymphome.

VDJ-Seq: Analyse en profondeur de séquençage de Rearranged immunoglobuline chaîne lourde Gene à révéler des modèles clonale évolution de B Lymphome

Le protocole décrit ici représente une méthode simple et reproductible qui utilise la chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) pour mesurer le métabolisme des purines sur des cellules de leucémie lymphoïde chronique (LLC) cultivées dans différentes conditions.

base HPLC-Assay pour surveiller extracellulaires Nucleotide / nucléosidiques Métabolisme dans les chroniques cellules leucémie lymphocytaire humaines

Ici, nous décrivons un protocole de calcul de la cellule de cytométrie à flux combiné et un protocole de construction de bibliothèque de prochaine génération conçu pour produire des données de haute qualité et exhaustives des cellules Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) du lymphome de Hodgkin classique (CHL).

Le tri de flux et le séquençage Exome des cellules de Reed-Sternberg du lymphome de Hodgkin classique

Les algorithmes existants génèrent une seule solution pour un dataset de détection des biomarqueurs. Ce protocole ne démontre l’existence de plusieurs solutions de même efficaces et présente un logiciel convivial pour aider les chercheurs biomédicaux à enquêter sur leurs ensembles de données pour le défi proposé. Informaticiens peuvent également fournir cette fonctionnalité dans leur biomarqueur des algorithmes de détection.

Sélection de plusieurs sous-ensembles de biomarqueur de même Classification binaire efficace performances

Ici, nous présentons un protocole de détails les aspects techniques et des exigences essentielles pour assurer l’analyse de séquence génique IG robuste chez les patients atteints de leucémie lymphoïde chronique (LLC), basé sur l’expérience accumulée de l’initiative européenne de recherche sur CLL (ERIC).

Analyse des séquences de gène immunoglobuline dans la leucémie lymphoïde chronique : Patient matériel d’interprétation de la séquence

Leucémie lymphoïde chronique (LLC) est la leucémie la plus courante dans le monde occidental. Facteurs de transcription NFAT sont des régulateurs importants de développement et l’activation de nombreux types de cellules. Nous présentons ici un protocole pour l’utilisation de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) dans les cellules humaines de CLL pour identifier les gènes de la nouvelle cible de NFAT2.

Une analyse d’immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les gènes cibles de nouveaux NFAT2 dans la leucémie lymphoïde chronique

À l’aide de systèmes de culture de plusieurs étapes, les auteurs rapportent une in vitro de cellules B au modèle de différenciation de cellules de plasma.

Dans modèle de différenciation in Vitro des cellules de la mémoire humaine normale B à longue durée de vie des cellules de Plasma

Ici nous décrivons deux approches pour caractériser des événements de polarisation de cellules dans les lymphocytes de B pendant la formation d'un IS. La première, implique la quantification du recrutement d'organites et des réarrangements de cytosquelette à la membrane synaptique. La seconde est une approche biochimique, pour caractériser les changements dans la composition du centrosome, qui subit une polarisation à la synapse immunitaire.

Étudier la dynamique d'Organelle dans les cellules B pendant la formation immunitaire de synapse

Ce protocole permet l'optimisation et la production efficace subséquente de fractions nucléaires et cytoplasmiques à partir de cellules lymphocytiques chroniques primaires. Ces échantillons sont utilisés pour déterminer la localisation des protéines ainsi que les changements dans le trafic de protéines qui ont lieu entre les compartiments nucléaire et cytoplasmique lors de la stimulation cellulaire et le traitement médicamenteux.

Fractionnement subcellulaire des cellules de leucémie lymphocytique chronique primaire pour surveiller le trafic de protéines nucléaires/cytoplasmiques

Ici, nous présentons un protocole utilisé pour effectuer des expériences de microscopie de force de traction sur les cellules B. Nous décrivons la préparation de gels polyacrylamides mous et leur fonctionnalisation, ainsi que l’acquisition de données au microscope et un résumé de l’analyse des données.

Microscopie de force de traction pour étudier l’activation de lymphocyte de B

Nous avons utilisé la coloration de prolifération cellulaire pour identifier les cellules quiescentes dans le modèle de leucémie lymphoblastique aiguë T-poisson zèbre. La coloration est conservée dans les cellules non divisées et réduite pendant la prolifération cellulaire, ce qui permet de sélectionner les cellules dormantes pour une interrogation plus approfondie. Ce protocole fournit un outil fonctionnel pour étudier l’auto-renouvellement dans le contexte de la quiescence cellulaire.

Identification de cellules quiescentes dans un modèle de leucémie lymphoblastique aiguë à cellules T de poisson-zèbre à l’aide de la coloration de la prolifération cellulaire 

Découvrez une approche protéomique combinant électrophorèse bidimensionnelle et spectrométrie de masse pour identifier des marqueurs pronostiques dans la leucémie lymphoïde chronique. Cette méthode permet d'isoler des cellules leucémiques primaires et d'analyser l'expression différentielle des protéines.

D'un spot 2DE-Gel de la fonction des protéines: Leçons apprises De HS1 dans la leucémie lymphoïde chronique

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