D'un spot 2DE-Gel de la fonction des protéines: Leçons apprises De HS1 dans la leucémie lymphoïde chronique

L’objectif global de l’expérience suivante est d’utiliser une approche protéomique combinée pour identifier des marqueurs pronostiques et/ou des cibles thérapeutiques potentiels dans les maladies humaines. Ceci est réalisé en isolant les cellules leucémiques primaires du sang périphérique du patient, porteuse d’un bon ou d’un mauvais pronostic, et en exprimant à la fois CD 19 et CD cinq marqueurs de surface à utiliser pour l’analyse protéomique dans un deuxième temps. Les lysats de cellules leucémiques sont résolus par électrophorèse bidimensionnelle ou deux de, et la comparaison des cartes protéomiques permet d’identifier des points exprimés différemment chez les patients de bon et de mauvais pronostic, qui peuvent ensuite être identifiés par spectrométrie de masse ou MS.

Ensuite, différents tests peuvent être utilisés afin de valider et de disséquer le rôle des protéines identifiées dans l’histoire naturelle de la maladie. Les résultats montrent que l’état différent de phosphorylation de HS, détecté par deux de gels, est en corrélation avec le résultat clinique des patients. L’implication de cette technique s’étend au traitement de la leucémie lymphoïde chronique car elle peut aider à identifier les protéines impliquées dans la progression de la maladie qui peuvent être exploitées comme marqueur pronostique et/ou cibles thérapeutiques démontrant que cette procédure sera avec moi.

Avant de commencer cette procédure, prélevez du sang périphérique dans des tubes de prélèvement sanguin vacutainer avec de l’héparine sodique. Transférez le sang dans un tube de 15 millilitres et ajoutez un cocktail d’enrichissement en lymphocytes B humains à 50 microlitres par millilitre de sang total. Ensuite, mélangez bien et incubez pendant 20 minutes à température ambiante.

Après l’incubation, diluez l’échantillon avec un volume égal de mélange PBS plus 2 % FBS doucement et superposez soigneusement le sang sur l’appel à la mouche en veillant à ne pas briser l’interface. Centrifugez l’échantillon à 400 fois G à température ambiante pendant 20 minutes sans interruption. Lorsque vous avez terminé, aspirez soigneusement l’interface pour récupérer les cellules et placez-les dans un nouveau tube.

Lavez les cellules une fois avec du PBS après centrifugation et élimination du surnageant. Resus. Mettez la pastille en suspension dans le surnageant restant en faisant pivoter manuellement le tube d’avant en arrière après la dilution. Avec un milieu RPMI complet, comptez les cellules à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu de Trian.

Ensuite, ajoutez les anticorps suivants à 100 microlitres de suspension cellulaire purifiée dans un tube de télécopie. Incuber l’échantillon pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Après avoir lavé l’échantillon avec quatre millilitres de PBS, vérifiez la pureté par cytométrie en flux.

Vérifiez le pourcentage de cellules de leucémie lymphoïde chronique ou LLC, qui Coex expriment le CD 19 et le CD cinq à leur surface. Assurez-vous que les préparations sont pratiquement dépourvues de lymphocytes et de monocytes NK t en vérifiant le pourcentage de CD trois, CD 14 et CD 1656 dans le graphique, qui doit être proche de zéro à ce stade. Solubiliser les pastilles de cellules CLL avec un volume final de 380 microlitres de tampon d’électrophorèse bidimensionnel.

Appliquez un milligramme d’échantillons de protéines sur 18 bandes IPG pour effectuer une électrofocalisation iso. Après le passage, équilibrez les bandes dans deux millilitres de tampon d’équilibrage, complété par 2 % de DTT frais pendant 15 minutes à température ambiante. Après avoir jeté la solution, ajoutez deux millilitres de tampon d’équilibration, complété par 2,5 % I oto acétamide.

Ensuite, incubez l’échantillon pendant 15 minutes à température ambiante sur une plate-forme à bascule. Ensuite, séchez les bandes sur du papier sans toucher le gel pour éliminer l’excès de solution. Une fois sec, chargez chaque bande sur un gel de page SDS de 9 à 16 % de gradient

Ajoutez un petit volume de tampon d’électrophorèse SDS sur le gel pour faciliter le chargement de la bandelette. Ensuite, scellez le gel en ajoutant environ cinq millilitres de solution de gélose à 0,8 % pour éviter que la bande ne flotte. Une fois l’unité d’électrophorèse assemblée, remplissez-la avec le tampon d’électrophorèse SDS.

Ensuite, effectuez l’exécution à 60 milliampères par gel pendant quatre heures, quatre degrés Celsius ou en utilisant un système de refroidissement. Après avoir retiré le gel de l’unité électrophorétique, placez-le dans la boîte de coloration appropriée. Préparez environ 200 millilitres de chaque solution.

Ajoutez soigneusement chaque solution dans la boîte de coloration contenant le gel. Effectuez toutes les incubations sur une plate-forme à bascule. Après la coloration, retirez la solution d’arrêt et laissez le gel dans une solution d’acide acétique à 1 % jusqu’à l’acquisition.

Pour le test de migration, mettre en suspension les cellules précédemment purifiées. Dans le RPMI complet, préparez la chambre inférieure du transwell en ajoutant 600 microlitres de RPMI complet avec ou sans les stimuli spécifiques. Pour mesurer respectivement la migration induite et la migration spontanée, placez la chambre supérieure sur le dessus et laissez le système s’équilibrer pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans l’incubateur.

Une fois terminé, ensemencez 10 à six cellules par 200 microlitres dans la chambre supérieure et incubez la plaque pendant quatre heures à 37 degrés Celsius dans l’incubateur. Après l’incubation, retirez la chambre supérieure et récupérez le milieu dans la chambre inférieure. Ensuite, lavez une fois la chambre inférieure avec un millilitre de PBS.

Après avoir recueilli le PBS dans un tube, centrifuger l’échantillon pendant cinq minutes à 300 fois G après l’élimination du surnageant. Remettre l’échantillon en suspension dans 500 microlitres de PBS par cytométrie en flux. Comptez le nombre de cellules migrées après une minute d’acquisition.

Vérifiez le nombre de cellules dans un graphique à points bidimensionnel en tenant compte des dispersions latérales des cellules et du nombre d’événements visualisés en une minute, qui est le nombre à utiliser pour le calcul. Des échantillons isolés de cellules leucémiques primaires provenant de patients atteints de LLC ont été regroupés en deux sous-ensembles principaux en fonction des caractéristiques cliniques de chaque patient et analysés par deux masses d’DE et de SEP dans une certaine tolérance de masse. Ils ont été assignés à des séquences peptidiques dans la base de données, puis assemblés en une protéine qui est considérée comme identifiée si elle passe un certain score de probabilité.

Par cette analyse, des protéines principalement impliquées dans l’activité cytosquelettique et les processus métaboliques ont été identifiées parmi ces protéines. Lignée hématopoïétique, protéine spécifique de la cellule ou hs. L’un d’entre eux dont la phosphorylation différentielle fortement associée à l’évolution clinique de la maladie a été exprimée de manière différentielle.

En particulier, les patients portant une seule tache ont un mauvais pronostic clinique tandis que les patients avec deux taches ont un bon pronostic. Les cellules LLC portant HS un comme un point ont une activité cytosquelettique altérée en termes de migration, d’adhésion et de polymérisation de l’actine par rapport à l’HS hypophosphorylée. Un, deux échantillons ponctuels. Expliquant ainsi un comportement clinique différent.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la protéomique pour identifier les candidats biologiques impliqués dans la progression de la maladie qui peuvent être utilisés comme marqueur pronostique et/ou cibles thérapeutiques.