Name: Mesure spatiale et temporelle Ca 2 + Signaux de plantes dArabidopsis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Apprenez à mesurer les signaux calciques spatiaux et temporels chez Arabidopsis thaliana. Cette méthode par imagerie luminescente et fluorescente permet d'étudier les réponses cellulaires et à l'échelle de la plante entière face au stress abiotique.

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Nous sommes reconnaissants à B. Stevenson pour son assistance technique et au Dr Marc R. Knight pour avoir fourni la lignée transgénique Aecorin. Ce travail a été financé par la subvention R01 GM059138 des National Institutes of Health.

1. Aequorin Based Ca2 + Imaging Utilisation du système FAS <ol><li> Préparer les semis pour l&#39;imagerie de luminescence. Stériliser graines de plantes d&#39;Arabidopsis exprimant Aequorin avec une solution d&#39;eau de Javel à 10% contenant 0,01% de Triton-100. Semez les graines stériles sur une plaque carrée (10 x 10 cm de plat carré de Pétri avec grille,) contenant la pleine force MS (Murashige et Skoog basale sel Mélange), 1% de saccharose et 1,2% d&#39;agar. Placer les plaques verticalement dans une chambre de croissance après stratification à 4 ° C pendant 2 jours (Figure 1A). </li><li> Transférer les plants sur un film. Placer un film adhésif (figure 1B) sur la partie supérieure de 7-10 jours de culture des plantes de semis de la plaque. Poussez doucement le film par la main pour s&#39;assurer que les plants adhèrent au film (figure 1C). Retirer le film doucement pour que les plants restent collés au film (figure 1D et 1E) </li><li> Incuber les plants avec cofacteur. Placer la unesemis dhered sur la plaque carrée (10 x 10 cm) contenant 15 ml de 2 pg / ml h-CTZ (coelentérazine) dans l&#39;eau. Incuber les plants à la température ambiante pendant 4 heures à une nuit (figure 1F). </li><li> Préparez-vous pour l&#39;imagerie de luminescence. Retirer le film de la solution h-CTZ et le couper par le milieu, formant deux pièces. Placez chaque morceau de film avec des plants face vers le haut en deux plaques différentes. Laisser les plaques à l&#39;obscurité pendant 5 min. </li><li> Acquérir les images de luminescence. Dans l&#39;obscurité, placer les deux plaques côte à côte sur la scène du système d&#39;imagerie par luminescence (figure 1G). Acquérir des images immédiatement après l&#39;ajout de 20 ml de solution de stimuli à la fois les plaques. </li><li> Analyser les images de luminescence. Choisir la même plage d&#39;affichage de toutes les images de luminescence. Recadrage de la région d&#39;intérêt (ROI) et de générer les images que les fichiers JPEG (figure 2A). Sinon, exporter les images sous forme de fichiers au format SPE et les importer dans leImageJ logiciel d&#39;analyse d&#39;image. Mesures établies pour le calcul de la valeur de gris moyen de retour sur investissement. Sélectionnez la même taille de la zone ROI et de mesurer les données de gris et moyennes présents sous forme de graphiques à barres (figure 2B). </li></ol> 2 Live Cell Imaging confocale Ca2 + <ol><li> Préparer les semis pour l&#39;imagerie confocale. Stériliser graines de plantes d&#39;Arabidopsis exprimant cas12 avec une solution d&#39;eau de Javel à 10% contenant 0,01% de Triton. Semez les graines stériles sur une plaque contenant résistance plein sels MS, 1% de saccharose et 1,2% d&#39;agar. Placer les plaques verticalement dans une chambre de croissance après stratification à 4 ° C pendant 2 jours. </li><li> Chambres d&#39;imagerie de configuration <ol><li> Assembler une chambre d&#39;imagerie utilisant une lame et lamelle (Chambre A). Placez un morceau de coton imbibé d&#39;eau sur le milieu de la diapositive. Puis transférer un ou deux 5 jours plantules âgées de la plaque sur le dessus de la laine de coton imbibée d&#39;eau. Collez les petits morceaux d&#39;argile à chaque coin d&#39;une lamelle, uned lieu lamelle sur le dessus des plants de créer un espace (chambre) entre la lamelle et toboggan (figure 3A, panneau de gauche). Raccorder une extrémité du tube de polyéthylène (diamètre 0,58 mm) pour une seringue de 1 ml et placer l&#39;autre extrémité du tube immédiatement adjacente à la chambre. Tenir le tube en place avec du ruban adhésif (figure 3A, panneau de droite). </li><li> Assembler une chambre d&#39;imagerie utilisant une chambre en plexiglas (Chambre B). <ol><li> Étendre une mince couche de graisse de silicone autour de deux tubes en polyéthylène (diamètre 0,58 mm) et appuyez sur les tubes revêtus dans les canaux de chaque côté de la chambre de plexiglas (figure 3B gauche panneau). Étendre une mince couche de graisse de silicone sur la surface de la chambre qui contient les rainures du tube et appuyez sur une lamelle dans la graisse pour sceller un côté de l&#39;ouverture de la chambre (découper). </li><li> Transférer un vieux semis de cinq jours à partir de la plaque dans la chambre et placer un morceau de coton imbibé d&#39;eau sur le joint hautf le semis. Etaler de la graisse silicone sur l&#39;autre surface de la chambre, et appuyez sur une autre lamelle sur le dessus pour sceller. Connecter l&#39;extrémité de l&#39;un des tubes à une seringue de 1 ml. Laissez la fin de l&#39;autre tube ouvert (panneau de droite figure 3B). </li></ol></li><li> Préparer une chambre d&#39;imagerie utilisant un couvercle en verre chambré (chambre C). Stériliser le couvercle en verre chambré avec 70% d&#39;éthanol et laisser sur le capot jusqu&#39;à ce que sec. Ajouter 0,6 ml ou 0,2 ml de milieu MS de force complet contenant 1% de saccharose et 0,5% phytagel dans chaque puits d&#39;une chambre à 2 ou bien une chambre à 8 puits (Figure 3C panneau de droite), respectivement. Stériliser les semences et semer les graines directement dans un verre de couverture chambré contenant une fine couche de gel transparent et laisser pousser verticalement pendant 5 jours (figure 3C). </li></ol></li><li> Acquérir des images à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal. Pour appliquer des stimuli de stress, tels que le sel, le froid ou le peroxyde, injecter lentement environ 200 pi de 150 mM de NaCl, glace-cold eau ou de 1 mM de H 2 O 2 dans la chambre (chambre A ou B) juste avant l&#39;acquisition d&#39;images, ou ajouter doucement 500 ul ou 100 ul d&#39;une solution de stimulation pour le puits d&#39;une chambre 2 ou 8 puits, respectivement . Les images de capture, immédiatement après application de la solution de stimulus en utilisant un Nikon A1R confocal à balayage laser microscope inversé avec un objectif à immersion dans l&#39;eau 20x (ouverture numérique de 0,75). Recueillir une série temporelle d&#39;images à 4 secondes d&#39;intervalle avec excitation et d&#39;émission des longueurs d&#39;onde de 488 nm et de 500 à 550 nm, respectivement, et à une résolution de pixel de 512 x 512. </li><li> Analyse de l&#39;image L&#39;aide de Nikon éléments, ROI ont été établis autour de chaque cellule (ou région) d&#39;intérêt. L&#39;intensité totale dans chaque ROI a été mesurée au cours du temps en utilisant la boîte de dialogue Mesure du temps (ImageJ pourrait être utilisé à la place). Nombre de mesures d&#39;intensité ont été exportées et traitées dans Datagraph. Pointe l&#39;amplitude Ca a été définie comme l&#39;intensité de pointe moins l&#39;intensité de repos, la durée comme etemps de e entre le début et la fin d&#39;un pic, et la période de l&#39;intervalle de temps entre les pics de pointes adjacentes de deux pointes. -test T a été utilisé pour comparer les moyennes. </li></ol>

<ol><li>Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signals%3A+the+lead+currency+of+plant+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signals: the lead currency of plant information processing.</a> Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).</li>
<li>Pan, Z., Zhao, Y., Zheng, Y., Liu, J., Jiang, X., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+screening+Arabidopsis+mutants+with+disordered+abiotic+stress-induced+calcium+signal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for screening Arabidopsis mutants with disordered abiotic stress-induced calcium signal.</a> J. Genet. Genomics. 39 (5), 225-235 (2012).</li>
<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense-related+calcium+signaling+mutants+uncovered+via+a+quantitative+high-throughput+screen+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana.</a> Mol. Plant. 5 (1), 115-130 (2012).</li>
<li>Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin-based+luminescence+imaging+reveals+stimulus-+and+tissue-specific+Ca2%2B+dynamics+in+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants.</a> Mol. Plant. 6 (2), 444-455 (2013).</li>
<li>Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+plant+aequorin+reports+the+effects+of+touch+and+cold-shock+and+elicitors+on+cytoplasmic+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium.</a> Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).</li>
<li>Van der Luit, A. H., Olivari, C., Haley, A., Knight, M. R., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+calcium+signalling+pathways+regulate+calmodulin+gene+expression+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct calcium signalling pathways regulate calmodulin gene expression in tobacco.</a> Plant Physiol. 121 (3), 705-714 (1999).</li>
<li>Johnson, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+oscillations+of+cytosolic+and+chloroplastic+free+calcium+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants.</a> Science. 269 (5232), 489-503 (1995).</li>
<li>Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+calcium+signaling+in+Arabidopsis+involves+two+cellular+pools+and+a+change+in+calcium+signature+after+acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation.</a> Plant Cell. 8 (3), 489-503 (1996).</li>
<li>Logan, D. C., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+and+cytosolic+calcium+dynamics+are+differentially+regulated+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial and cytosolic calcium dynamics are differentially regulated in plants.</a> Plant Physiol. 133 (1), 21-24 (2003).</li>
<li>Mehlmer, N., Parvin, N., Hurst, C. H., Knight, M. R., Teige, M., Vothknecht, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolset+of+aequorin+expression+vectors+for+in+planta+studies+of+subcellular+calcium+concentrations+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana.</a> J. Exp. Bot. 63 (4), 1751-1761 (2012).</li>
<li>Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+calcium+responses+to+drought%2C+salt+and+cold+in+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root.</a> Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li>
<li>Souslova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+fluorescent+protein-based+Ca2%2B+sensors+with+increased+dynamic+range%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range.</a> BMC. Biotechnol. 7, 37-46 (2007).</li>
<li>Tanaka, K., Swanson, S., Gilroy, S., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+nucleotides+elicit+cytosolic+free+calcium+oscillations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular nucleotides elicit cytosolic free calcium oscillations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154 (2), 705-719 (2010).</li>
<li>Iwano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-tuning+of+the+cytoplasmic+Ca2%2B+concentration+is+essential+for+pollen+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fine-tuning of the cytoplasmic Ca2+ concentration is essential for pollen tube growth.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1322-1334 (2009).</li>
<li>Sieberer, B., Chabaud, M., Timmers, A., Monin, A., Fournier, J., Barker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear-targeted+Cameleon+demonstrates+intranuclear+Ca2%2B+spiking+in+Medicago+truncatula+root+hairs+in+response+to+rhizobial+nodulation+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A nuclear-targeted Cameleon demonstrates intranuclear Ca2+ spiking in Medicago truncatula root hairs in response to rhizobial nodulation factors.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1197-1206 (2009).</li>
<li>Loro, G., Drago, I., Pozzan, T., Lo Schiavo, F., Zottini, M., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Cameleons+to+different+subcellular+compartments+reveals+a+strict+cytoplasmic%2Fmitochondrial+Ca2%2B+handling+relationship+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Targeting of Cameleons to different subcellular compartments reveals a strict cytoplasmic/mitochondrial Ca2+ handling relationship in plant cells.</a> Plant J. 71 (1), 1-13 (2012).</li>
<li>Krebs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+genetically+encoded+sensors+allow+high-resolution+live+cell+imaging+of+Ca2%2B+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics.</a> Plant J. 69 (1), 181-192 (2012).</li>
<li>Bonza, M. C., Loro, G., Behera, S., Wong, A., Kudla, J., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+Ca2%2B+accumulation+and+dynamics+in+the+endoplasmic+reticulum+of+Arabidopsis+root+cells+using+a+genetically+encoded+Cameleon+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analyses of Ca2+ accumulation and dynamics in the endoplasmic reticulum of Arabidopsis root cells using a genetically encoded Cameleon sensor.</a> Plant Physiol. 163 (3), 1230-1241 (2013).</li>
<li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2O2+in+plant+peroxisomes%3A+An+in+vivo+analysis+uncovers+a+Ca2%2B+dependent+scavenging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">H2O2 in plant peroxisomes: An in vivo analysis uncovers a Ca2+ dependent scavenging system.</a> Plant J. 62 (5), 760-772 (2010).</li>
<li>Zhu, X., Caplan, J., Mamillapalli, P., Czymmek, K., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+endoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+in+innate+immunity-mediated+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Function of endoplasmic reticulum calcium ATPase in innate immunity-mediated programmed cell death.</a> EMBO J. 29 (5), 1007-1018 (2010).</li>
<li>Roszik, J., Lisboa, D., Szöllosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75 (9), 761-767 (2009).</li>
<li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%3A+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J. Physiol. 578 (Pt 1), 55-67 (2007).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons démontré un système FAS pour l&#39;enregistrement de la spatio-temporelle Ca2 + réponse des plants d&#39;Arabidopsis. Cette 2+ système d&#39;enregistrement FAS Ca offre une approche simple, sensible et robuste qui pourrait être adapté pour mesurer Ca2 + dynamique déclenchée par divers stimuli, en plus des stimuli de stress abiotiques qui sont présentés ici. Grâce à ce système, nous pouvons comparer facilement tissulaires ou des stimuli spécifiques spatio-temporelles Ca2 +...

La cellule de plante répond à l&#39;environnement par l&#39;intermédiaire d&#39;une signalisation qui coordonne les actions cellulaires. Événement de signalisation en réponse à des stimuli de l&#39;environnement d&#39;une cellule début est une augmentation transitoire de Ca2 +. Le modèle, ou la signature d&#39;une augmentation transitoire de la concentration de Ca2 + libre est caractérisé par son amplitude, la fréquence et la durée. Signatures Ca2 + spatio-temporelles distinctes régissent différentes activités cellulaires 1. Stimuli spécifiques, tels que la chaleur, le froid, le sel, la sécheresse, la lumière, ou des hormones végétales, peuvent affiner l&#39;activité spatio-temporelle de la membrane localisée canaux Ca2 + et / ou transporteurs, entraînant spécifiques Ca2 + signatures. Bien que Ca2 + transporteurs ont été bien caractérisés, on sait peu sur l&#39;identité et les fonctions moléculaires des canaux de Ca dans les plantes 1. Écrans génétiques pour les mutants avec altéré Ca2 + réponse au stress stimuli peuvent être une appr efficaceOach pour identifier les composants qui composent Ca de signatures. Ca2 + systèmes de détection récemment fondé plusieurs Aequorin ont été développés qui facilitent écrans génétiques pour Ca2 + composants de signalisation en réponse à l&#39;attaque d&#39;agents pathogènes et stress abiotique 2-4. A été utilisé pour la première Aequorin pour détecter des signaux Ca2 + dans les usines dans les années 1990 5. Depuis lors, l&#39;aequorine a été ciblée pour différents compartiments cellulaires, tels que le cytoplasme 5, le noyau 6, les chloroplastes 7, tonoplastique 8, les mitochondries 9, et le stroma 10, ainsi que de différents types de cellules dans la racine de surveiller cellule spécifique Ca 2 + 11 signaux. Les mesures sur la base de Ca de l&#39;aequorine révèlent le Ca2 + réponse spatiale et temporelle d&#39;une population de cellules pour souligner stimuli. Cependant, dans la plupart des cas, les réponses du Ca de cellules individuelles sont unsynchronized dans le tissu de répondre 4. Par conséquent, l&#39;enregistrement de Aequorin Ca ne rend pas nécessairement le signal Ca2 + dans des cellules individuelles. Au cours des dernières années, la protéine fluorescente génétiquement codé (FP) à base de Ca2 + indicateurs, tels que cameleon jaune (centres jeunesse) 12 et 13 cas12 ont été utilisés pour étudier la signalisation Ca2 + avec une résolution subcellulaire élevé. Centres jeunesse sont le transfert d&#39;énergie de fluorescence par résonance (FRET) à base d&#39;indicateurs de Ca2 +, contenant CFP et YFP variants lié par le liant le Ca2 + et calmoduline de la protéine de peptide liant la calmoduline M13. Calmodulin subit un changement de conformation telle qu&#39;elle se lie au Ca2 +, ce qui apporte CFP et YFP rapprocher, ce qui entraîne un transfert d&#39;énergie accrue (FRET accru). Le niveau de FRET avec le temps, plus ou moins calculé comme le rapport de la YFP à la PCP intensités de signal, traduit la dynamique intracellulaire de Ca2 +. Plusieurs versions YC ont été utilisés dans des plantes. YC3.6 était targeted vers le cytosol 14,15, 16 noyau, les mitochondries 17, et la membrane plasmique 18, et YC4.6 et D4ER ont été ciblés à l&#39;urgence 15,19, et D3cpv a été visé aux peroxysomes 20. Les plantes transgéniques exprimant des centres jeunesse permettent l&#39;imagerie des cellules vivantes de Ca2 + dynamique au sein de différents compartiments cellulaires de différents types de cellules. Cas (probablement Ca lcium soi RNDS) sont des protéines simples circulairement permutées fluorescentes (cpFPs) abritant une calmoduline et le peptide liant la calmoduline M13. Lors de la liaison à Ca2 +, les cas sont soumis à des changements de conformation, conduisant à une augmentation de l&#39;intensité de fluorescence. La corrélation entre la réponse de fluorescence de la CAS et concentration de Ca2 + intracellulaire de Ca2 + permet dynamique à mesurer quantitativement. La variante cas12 a 12 fois fluorescence accrue dans les Ca2 + formes saturés. N. plantes benthiminana transitoire expresser cas12 ou de plantes d&#39;Arabidopsis exprimant de façon stable Case 12 ont été utilisés pour étudier la signalisation Ca2 + dans la défense et stress abiotique 4,21. Asynchrone spatiale et temporelle Ca2 + oscillations dans les cellules répondant à une attaque pathogène, ou au stress de déshydratation ont été révélés avec la société cas12 Ca2 + imagerie. Ici, nous présentons des instructions détaillées pour Aequorin imagerie de luminescence en fonction de stimuli et tissulaire spécifique Ca2 + dynamique en plants d&#39;Arabidopsis, et pour l&#39;imagerie confocale de cytosolique et nucléaire Ca 2 + dynamique dans les cellules d&#39;Arabidopsis profondes qui expriment Cas 12: Luminescence imagerie du SAF pourrait être adapté pour analyser le stress induit par Ca2 + dynamique dans les plantes ou les tissus ne sont pas décrits ici intacts, ou pour dépister les populations de plantes d&#39;Arabidopsis mutagénisées des mutants avec le stress a induit des troubles de Ca2 + signaux. L&#39;installation d&#39;imagerie Ca 2 + des cellules vivantes pourrait être adapté pour analyser Ca2 + dynamique au sein des différents compartiments de subcelluar ou dans différents types de cellules à l&#39;aide de Ca2 + autres indicateurs.

<table><tbody><tr><td>Boîte de Pétri carrée de 10 cm x 10 cm</td><td>VWR</td><td>60872-310</td><td></td></tr><tr><td>Film adhésif</td><td>VWR</td><td>60941-062</td><td></td></tr><tr><td>Tube en polyéthylène</td><td>PerkinElmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>seringue de 1 ml</td><td>VWR</td><td>53548-000</td><td></td></tr><tr><td>Graisse silicone</td><td>Beckman</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>verre de couverture à 2 chambres</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155379</td><td></td></tr> verre <tr><td>de protection à 8 chambres</td><td>Nalge Nunc international 155409</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie par luminescence</td><td>Princeton Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser inversé</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Nikon A1R&nbsp ;</td></tr><tr><td>Logiciel d’imagerie</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Nikon Elements&nbsp ;</td></tr><tr><td>DataGraph</td><td>Visual Data Tools Inc</td><td>N/A</td><td>DataGraph 3.1.1 est la dernière version</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>NanoLight Technologies</td><td>#301B NF-BCTZ-FB</td><td></td></tr><tr><td>Eau de Javel tout usage</td><td>N/A N’importe quel magasin local</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151500</td><td></td></tr><tr><td>MS sel</td><td>Phytotechnology</td><td>Labs M524-50L</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>VWR</td><td>BDH8029-12KG</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A1296-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure spatiale et temporelle ca 2 + signaux de plantes d'arabidopsis

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Les indices de développement de l&#39;environnement et induisent des fluctuations de Ca2 + dans les cellules végétales. spatio-temporelles de Ca2 + modèles spécifiques de stimulation sont détectées par cellulaires Ca2 + protéines de liaison qui initient Ca2 + cascades de signalisation. Cependant, nous en savons encore peu de choses sur la façon dont les signaux de stimulus Ca spécifique sont générés. La spécificité d&#39;un signal de Ca2 + peut être attribuée à la régulation sophistiquées de l&#39;activité des canaux et / ou des transporteurs de Ca en réponse à un stimulus donné. Pour identifier ces composants cellulaires et comprendre leurs fonctions, il est essentiel d&#39;utiliser des systèmes qui permettent un enregistrement sensible et robuste des signaux de Ca à la fois le tissu et niveaux cellulaires. Codés génétiquement Ca2 + indicateurs qui ciblent différents compartiments cellulaires ont fourni une plate-forme pour des cellules vivantes imagerie confocale de cellulaires Ca2 + signaux. Nous décrivons ici l&#39;instructions pour l&#39;utilisation de deux systèmes de Ca2 + de détection: aequorine base (FAS adhésives Les plants de film luminescence) Ca2 + et d&#39;imagerie des cellules vivantes cas12 fluorescence confocal basé imagerie de Ca2 +. imagerie de luminescence en utilisant le système FAS fournit une détection simple, robuste et sensible spatiales et temporelles des signaux Ca2 + au niveau des tissus, tandis que la cellule en direct imagerie confocale en utilisant cas12 permet la détection simultanée de cytosolique de Ca2 + et signaux nucléaires à haute résolution.

Mannitol, NaCl et H 2 O 2 ont été utilisés comme substituts pour la déshydratation, le sel et le stress oxydatif stimuli, respectivement. Pour vérifier si les ions de métaux lourds Cu 2 + en synergie avec l'une de ces trois stimuli de stress, on a comparé la réponse de Ca2 + à chacune des stimuli de la présence ou de l'absence de Cu 2 +. Comme le montre la Figure 2, le SAF luminescence imagerie a révélé que les plantules Arabidoposis réagissaient di...

Ca la signalisation régule divers processus biologiques dans les plantes. Ici, nous présentons des approches pour le suivi du stress abiotique induit Ca 2 + spatiale et temporelle des signaux dans les cellules et les tissus en utilisant les codés génétiquement Ca2 + indicateurs Aequorin ou cas12 Arabidopsis.

Mesure spatiale et temporelle Ca 2 + Signaux de plantes d'Arabidopsis

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

L’objectif général de cette procédure est de démontrer une méthode de surveillance des signaux calciques à la fois au niveau cellulaire et au niveau de la plante entière. Pour ce faire, les semis doivent d’abord être cultivés sur la plaque de gélose MS ou directement dans la chambre d’imagerie. La deuxième étape consiste à transférer les plantules sur un film adhésif ou à les conserver dans la chambre d’imagerie.Stimuli suivants appliqués aux plantules pour induire des signaux calciques. En fin de compte, l’imagerie par luminescence ou par fluorescence est utilisée pour montrer la réponse calcique nucléaire cytosolique de la plantule entière ou à différents stimuli. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la plante unique, par exemple, est que le test des semis adhésifs est simple, sensible et robuste.Par conséquent, cette technique peut être adaptée au criblage à haut débit de mutants dont les réponses au signal calcique sont modifiées. De plus, par rapport à l’imagerie calcique à plat, l’utilisation d’un indicateur de calcium génétiquement codé basé sur la GFP évite les réglages et les calculs microscopiques compliqués. Cette méthod

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Analyse cellulaire spécifique de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Feuilles en utilisant la fluorescence par tri cellulaire activé

Cet article fournit un protocole pour la culture de jeunes plants d'Arabidopsis dans le RootChip, une plate-forme d'imagerie qui combine microfluidique de contrôle automatisé des conditions de croissance avec un suivi racine microscopique et FRET basée sur la mesure de niveaux intracellulaires de métabolites.

Time-lapse d&#39;imagerie par fluorescence de la croissance racinaire d&#39;Arabidopsis avec la manipulation rapide de l&#39;environnement root en utilisant le RootChip

Ce protocole décrit une méthode pour tester l’hypothèse selon laquelle l’inversion du champ géomagnétique effectif (GMF) induit une expression génique différentielle et modifie la morphologie d’Arabidopsis thaliana. Un système triaxial octogonal de paires de bobines Helmholtz a été utilisé pour générer artificiellement des conditions GMF inversées dans la chambre de croissance des plantes.

Champ géomagnétique (FMV) et Evolution des végétaux: Étude des effets de la GMF Reprise sur<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Développement et Gene Expression

Ce protocole décrit une méthode simple pour analyser les signaux calciques chez les plantes générées en se nourrissant d’insectes hémiptères, comme les pucerons. Arabidopsis thaliana transformée avec le biocapteur de calcium GFP GCaMP3 permettant l’imagerie en temps réel en vivo de dynamique du calcium avec une haute résolution temporelle et spatiale.

Enregistrement en temps réel In Vivo des signaux calciques Arabidopsis pendant la tétée insectes à l’aide d’un biocapteur Fluorescent

Nous présentons ici un protocole pour l’étude de comportement de croissance des végétaux et en particulier des phénotypes de façon reproductible. Nous montrons comment fournir variable et à des conditions d’éclairage temps stable même. Bon analyses dépendent nombre d’échantillon suffisant et évaluations statistiques valides.

Analyse des comportements de croissance Arabidopsis thaliana dans différentes qualités de lumière

Gibbérelline Perception capteur 1 (GPS1) est le premier Förster resonance energy axée sur le transfert biocapteur pour mesurer les niveaux cellulaires de phytohormones gibbérelline avec une haute résolution spatio-temporelle. Ce protocole des rapports sur la méthode de visualiser et de quantifier les niveaux de gibbérelline cellulaires utilisant le biocapteur nlsGPS1 génétiquement encodé dans Arabidopsis hypocotyles et radicelles.

Visualisation niveaux gibbérelline cellulaires à l’aide de la NlsGPS1 Förster Resonance Energy Transfer biocapteur (FRET)

Le but de ce protocole est de montrer comment charger la CFDA dans différents sites des parties inférieures de l' Arabidopsis. Nous présentons ensuite le modèle de distribution de CF dans les pousses.

Mouvement de la fusillade du traceur CFDA chargé dans les tissus de l’évier inférieur de l' Arabidopsis

La signalisation systémique glutamate-déclenchée extracellulaire de calcium est critique pour l’induction des réponses de défense des plantes à la blessure mécanique et à l’attaque herbivore dans les plantes. Cet article décrit une méthode pour visualiser la dynamique spatiale et temporelle de ces deux facteurs utilisant des plantes de thaliana d’Arabidopsis exprimant des biocapteurs fluorescents calcium et glutamate-sensibles.

Imagerie en temps réel à large champ des signaux de plaies locales et systémiques chez Arabidopsis

Nous décrivons ici un outil avancé conçu pour le suivi de la biosynthèse de la chlorophylle au cours des premiers stades de la désétiolement des plantules d’Arabidopsis . La nouvelle méthodologie fournit une imagerie non invasive de fluorescence de la chlorophylle en temps réel à haute résolution spatiale et temporelle.

Test non invasif pour la détermination de la cinétique de biosynthèse de la chlorophylle au cours des premiers stades de la désétiolement d’Arabidopsis

Ceci est une démonstration de la façon dont les membranes biologiques peuvent être compris en utilisant des modèles électriques. Nous démontrons également des procédures pour l'enregistrement de potentiels d'action de la chaîne nerveuse ventrale de l'écrevisse pour les laboratoires des étudiants orientés.

Modélisation des membranes biologiques avec des cartes de circuits et la mesure des signaux électriques dans les axones: Exercices de laboratoire étudiant

Apprenez à mesurer les signaux calciques spatiaux et temporels chez Arabidopsis thaliana. Cette méthode par imagerie luminescente et fluorescente permet d'étudier les réponses cellulaires et à l'échelle de la plante entière face au stress abiotique.

Mesure spatiale et temporelle Ca^{2 +} Signaux de plantes d'Arabidopsis

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