Mesure spatiale et temporelle Ca ^{2 +} Signaux de plantes d'Arabidopsis

L’objectif général de cette procédure est de démontrer une méthode de surveillance des signaux calciques à la fois au niveau cellulaire et au niveau de la plante entière. Pour ce faire, les semis doivent d’abord être cultivés sur la plaque de gélose MS ou directement dans la chambre d’imagerie. La deuxième étape consiste à transférer les plantules sur un film adhésif ou à les conserver dans la chambre d’imagerie.

Stimuli suivants appliqués aux plantules pour induire des signaux calciques. En fin de compte, l’imagerie par luminescence ou par fluorescence est utilisée pour montrer la réponse calcique nucléaire cytosolique de la plantule entière ou à différents stimuli. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la plante unique, par exemple, est que le test des semis adhésifs est simple, sensible et robuste.

Par conséquent, cette technique peut être adaptée au criblage à haut débit de mutants dont les réponses au signal calcique sont modifiées. De plus, par rapport à l’imagerie calcique à plat, l’utilisation d’un indicateur de calcium génétiquement codé basé sur la GFP évite les réglages et les calculs microscopiques compliqués. Cette méthode donne un aperçu de la signalisation calcique pendant la réponse au stress chez Arabidopsis, mais elle peut également être utilisée dans d’autres contextes tels que le développement ou la défense dans d’autres modèles de plantes.

La démonstration de cette méthode sera brillante. Un étudiant de notre laboratoire Pour commencer cette procédure, stérilisez les graines d’un lapin opsis en exprimant un quain avec une solution d’eau de Javel à 10 % contenant 0,01 % de Triton 100, semez les graines sur une plaque carrée contenant du MS à pleine concentration, 1 % de saccharose et 1,2 % de gélose. Ensuite, placez les plaques verticalement dans une chambre de croissance après une stratification de quatre degrés Celsius pendant deux jours.

Ensuite, transférez les plants sur un film. Placez un film adhésif sur les semis de sept à 10 jours qui poussent sur la plaque. Poussez doucement le film à la main pour vous assurer que les plants adhèrent au film.

Ensuite, pelez doucement le film pour que les plants restent adhérents au film. Ensuite, incubez les plantules avec le cofacteur en plaçant les plantules A adhèrent sur une plaque carrée contenant 15 millilitres de deux microgrammes par millilitre de HCTZ dans de l’eau. Incuber les plants à température ambiante pendant quatre heures à toute la nuit.

Pour préparer l’imagerie par luminescence, retirez le film de la solution HCTZ et coupez-le au milieu pour former deux morceaux. Placez les deux morceaux de film avec les plants vers le haut dans deux plaques différentes. Laissez ensuite les plaques dans l’obscurité pendant cinq minutes pour acquérir des images de luminescence dans l’obscurité.

Placez deux plaques l’une à côté de l’autre sur la platine du système d’imagerie par luminescence. Acquérez des images immédiatement après avoir ajouté simultanément 20 millilitres de solution de stimuli aux plaques. Pour analyser les images de luminescence, choisissez la même plage d’affichage pour toutes les images de luminescence, recadrez le retour d’intérêt et générez les images sous forme de fichiers jpeg.

Vous pouvez également exporter les images sous forme de fichiers au format SPE et les importer dans le logiciel d’analyse d’images image J. Définissez les mesures pour calculer la valeur de gris moyenne de la zone d’intérêt, sélectionnez la même taille de zone d’intérêt. Mesurez ensuite la valeur de gris moyenne et présentez les données sous forme de graphiques à barres.

Pour préparer les semis à l’imagerie confocale. Stérilisez les graines des plantes d’opsis exprimant le cas 12 avec une solution d’eau de Javel à 10 % contenant 0,01 % de Triton. Donc, les graines stériles sur une assiette contenant des sels MS à pleine concentration, 1 % de saccharose et 1,2 % d’agar.

Placez ensuite les plaques verticalement dans une chambre de croissance après stratification à quatre degrés Celsius pendant deux jours. Pendant ce temps, assemblez une chambre d’imagerie avec une lame et une lamelle. Placez un morceau de coton imbibé d’eau sur le dessus de la lame.

Transférez ensuite un ou deux plants de cinq jours de la plaque au milieu de la lame. Collez ensuite de petits morceaux d’argile à chaque coin de la lamelle et placez la lamelle sur les semis pour créer un espace entre la lamelle et la glissière. Après cela, connectez une extrémité du tube en polyéthylène à une seringue d’un millilitre et placez l’autre extrémité du tube immédiatement adjacente à la chambre.

Maintenez le tube en place avec du ruban adhésif pour assembler une chambre d’imagerie avec une chambre en plexiglas. Étalez une fine couche de graisse de silicone autour de deux tubes en polyéthylène et pressez les tubes revêtus dans les canaux de chaque côté de la chambre en plexiglas. Étalez ensuite une fine couche de graisse de silicone sur la surface de la chambre qui contient les rainures du tube et placez une lamelle sur la graisse pour sceller un côté de l’ouverture de la chambre.

Ensuite, transférez un plant de cinq jours de l’assiette dans la chambre et placez un morceau de coton imbibé d’eau sur le semis. Étalez la graisse silicone sur l’autre surface de la chambre et appuyez sur une autre lamelle de recouvrement sur le dessus pour sceller. Ensuite, connectez l’extrémité de l’un des tubes à une seringue d’un millilitre et laissez l’extrémité de l’autre tube ouverte.

Pour préparer une chambre d’imagerie avec un verre de protection à chambre, stérilisez d’abord le verre de couverture à chambre avec de l’éthanol à 70 % et laissez-le dans la hotte jusqu’à ce qu’il soit sec à 0,6 millilitre ou 0,2 millilitre de MS à pleine puissance. Milieu contenant 1 % de saccharose et 0,5 % de gel de combat dans chaque puits d’une chambre à deux puits ou d’une chambre à huit puits respectivement. Ensuite, stérilisez les graines et semez-les directement sur un verre de couverture chambré contenant une fine couche de gel transparent et laissez-les pousser verticalement pendant cinq jours. Pour l’acquisition d’images.

À l’aide d’un microscope confocal, on applique des stimuli de stress en injectant lentement 200 microlitres de chlorure de sodium de 150 millimolaires, d’eau glacée ou d’une solution de peroxyde d’hydrogène millimolaire dans la chambre juste avant d’acquérir des images. Capturez les images immédiatement après l’application de la solution de stimulus. À l’aide d’un microscope à balayage laser confocal inversé avec une lentille d’immersion dans l’eau 20x.

Collectez une série chronologique d’images à quatre secondes d’intervalle avec des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 4 à 88 nanomètres et de 500 à 550 nanomètres respectivement, et une résolution AIX de cinq 12 par cinq 12 ou une analyse d’image à l’aide d’éléments Nikon. Les retours sur investissement sont dessinés autour de chaque cellule d’intérêt. L’intensité totale de chaque retour sur investissement est mesurée au fil du temps à l’aide de la boîte de dialogue de mesure du temps.

Ensuite, les mesures d’intensité totale sont exportées et traitées dans le graphique de données affiché. Voici la comparaison de la réponse spatio-temporelle du calcium de semis de 10 jours. Les différents stimuli de stress ici sont les séries chronologiques de luminescence, les images de plantules soumises à 400 millimolaires de mannitol et 400 millimolaires de chlorure de cuivre, 75 millimolaires de chlorure de sodium et 75 millimolaires de chlorure de sodium plus un chlorure de cuivre millimolaire et un peroxyde d’hydrogène millimolaire ou un peroxyde d’hydrogène millimolaire plus un chlorure de cuivre millimolaire.

Les panneaux supérieur et inférieur sont les images de luminescence acquises pendant les 40 premières secondes et les 40 secondes secondes respectivement. Et voici le graphique à barres de l’intensité moyenne de la luminescence des plantules en réponse aux stimuli de stress indiqués indiqués ici comme l’oscillation cytosolique et nucléaire calcique. En réponse au stress salin, les images confocales montrent que le cas 12 est exprimé dans le cytoplasme et les noyaux des cellules racinaires et les cellules foliaires des plantes transgéniques exprimant le cas 12.

Cette image émerge, image du rouge, de l’autofluorescence des chloroplastes et de la fluorescence verte du cas 12. Ces deux graphiques montrent l’oscillation calcique induite par le stress salin dans le cytosol, un noyau des cellules racinaires. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’utiliser des semis bien cultivés.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de surveiller les dynes au niveau cellulaire et au niveau de la plante entière.