Name: Stratégies pour le suivi Anastasis, une cellule de survie Phénomène qui renverse apoptose (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Découvrez comment détecter et suivre l'anastasis, le phénomène de survie cellulaire qui inverse l'apoptose, par microscopie à cellules vivantes. Cette méthode permet d'observer la récupération morphologique et moléculaire des cellules.

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Nous remercions le Révérend Dr. Ralph Bohlmann et le révérend Dr James Voelz pour suggérer le mot &quot;Anastasis&quot; pour décrire l&#39;inversion de l&#39;apoptose; Douglas R. Green pour les cellules HeLa exprimant de façon stable cytochrome c GFP; Charles M. Rudin et Eric E. Gardner pour H446 cellules; Heather Lamb d&#39;assistance en dessin animé à la vidéo; Yee Hui Yeo de discussion précieuse de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par un Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), la bourse Dr Walter Szeto Memorial (HLT), bourse Fulbright 007-2009 (HLT), Fondation Life Science Research Fellowship (HLT), NIH accorde NS037402 (JMH) et NS083373 (JMH), et le Comité de la Hong Kong University Grants AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang est une Fondation Shurl et Kay Curci Fellow de la Fondation de recherche en sciences de la vie.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Anastasis désigne le phénomène où les cellules qui ont activés voie de mort cellulaire inverse par la suite le processus de la mort et de survivre. Ici, nous avons démontré que l&#39;imagerie des cellules vivantes peut être utilisée pour confirmer que les mêmes cellules individuelles en fait peuvent inverser apoptotique processus de mort cellulaire à un stade tardif, et puis continuer survivant et la reproduction. Nos protocoles décrivent différentes conditions de traitement spécifiques d&#39;un type cellulaire optimisé...

Apoptose (grec pour «tomber à la mort&quot;) est généralement supposé être un processus à sens unique se terminant par suicide cellulaire 1-7. La perturbation génétique de gènes pro-mort conduit à la survie des cellules supplémentaires qui seraient autrement mourir dans des animaux entiers, y compris des cellules qui ont déjà ouvert la voie de 8,9 apoptose. De même, les manipulations génétiques permettent aux cellules de mammifères en bonne santé qui affichent artificiellement &quot;Eat Me&quot; signaux ou qui perdent leur adhérence à la matrice extracellulaire pour échapper à la mort par phagocytose de cellules entières ou entose respectivement 10,11. Cependant, nous et d&#39;autres avons montré que, sans manipulation génétique des cellules de mammifères sains et de lignées cellulaires peuvent également récupérer dès les premiers stades de l&#39;apoptose 12-15. Utilisation d&#39;outils pour suivre des cellules individuelles, nous avons encore démontré la récupération de stades tardifs de l&#39;apoptose 12,13, après que les cellules ont passé les postes de contrôle important que typiqueLy marquer le «point de non-retour&quot; 2-6. Ces points de contrôle de l&#39;apoptose au stade avancé comprennent la libération du cytochrome c mitochondrial, l&#39;activation des caspases, la fragmentation nucléaire, et la formation de corps apoptotiques. Nous avons adopté un mot composé grec &quot;Anastasis&quot;, qui signifie &quot;la hausse à la vie&quot;, pour décrire ce renversement de l&#39;apoptose au bord de la mort cellulaire 2-6. Sauf tout le processus de recouvrement des mourants est observé par imagerie des cellules vivantes, il est difficile de distinguer les cellules qui ont subi Anastasis partir de cellules qui ne ont jamais connu les événements apoptotiques. Des décennies de travail ont révélé que les caractéristiques morphologiques de suicide cellulaire par apoptose sont entraînés par des événements biochimiques et moléculaires évolutives conservées 16-19. Ces événements favorisent l&#39;auto-destruction des cellules pour réguler les processus de développement et homéostatiques dans les organismes unicellulaires et multicellulaires en éliminant endommagé ou dcellules angerous 16-19. Alors que les cellules apoptotiques peuvent être facilement distingués par des manifestations morphologiques, biochimiques et moléculaires de l&#39;apoptose 1,5,6,16,20 standardisés, il ne existe actuellement aucun marqueur spécifique connue Anastasis 12,13. Fait important, les cellules qui ont subi anastasis semblent être les cellules saines normales et des cellules qui commencent juste inverser l&#39;apoptose des cellules mourantes apparaître comme apoptotiques 12,13. Ainsi, de nouveaux outils sont nécessaires pour conclure avec certitude qu&#39;une cellule donnée survivant avait déjà connu des processus apoptotiques actifs. L&#39;apoptose est généralement admis comme une cascade irréversible parce que ce est un processus de destruction rapide et massive. Bien qu&#39;il pourrait prendre quelques minutes à quelques jours pour certaines cellules pour initier l&#39;apoptose, une fois mitochondries ont publié facteurs tels que apoptogènes cytochrome c dans le cytosol 21,22, caspases peuvent être activées dans les 5 minutes 23,24, suivis par cytoplasmique etcondensation nucléaire dans les 10 minutes de 25 à 27, et la mort cellulaire peu après 25-27. Les caspases activées orchestrent l&#39;apoptose par clivage et en inactivant des composants structuraux et fonctionnels clés dans le but de démolition 2,28 cellulaire, tel que l&#39;inhibiteur d&#39;endonucléase DFF45 / CISD 29,30. Caspases activent également des facteurs pro-apoptotiques, comme famille Bcl-2 BID membre, qui translocation vers les mitochondries pour favoriser la libération du cytochrome c mitochondrial 31,32. l&#39;activité de la caspase résulte également dans la cellule exposition de la surface de la phosphatidylsérine comme un signal &quot;me manger&quot; pour la promotion de l&#39;engloutissement de mourir cellules par les macrophages ou les cellules voisines par phagocytose 33. En outre, les événements apoptotiques rendent la dysfonction mitochondriale, perturbant bioénergétique cellulaire et métabolisme 34,35,36. Ainsi, la récupération de cette destruction semble intuitivement peu probable. Contrairement à l&#39;original se attendretions, les cellules peuvent inverser le processus de mort cellulaire par apoptose, même à un stade tardif. En surveillant en permanence le sort de mourir des cellules en culture, nous avons observé la réversibilité de l&#39;apoptose de stade tardif dans une plage de cellules primaires et des lignées cellulaires 12,13. L&#39;élimination du stimulus de mort a permis la récupération des éléments visibles de l&#39;apoptose, telles que fragmentation mitochondriale, de la condensation de la chromatine, des dommages de l&#39;ADN, le plasma membrane bourgeonnement, l&#39;exposition de la surface cellulaire de la phosphatidylsérine, la libération du cytochrome c mitochondrial, l&#39;activation des caspases, la fragmentation nucléaire, rétrécissement des cellules, et la formation de corps apoptotiques. Ces observations soulèvent des questions sans réponses concernant les fonctions, les conséquences et les mécanismes de Anastasis. Pour répondre à ces questions, une condition préalable est d&#39;identifier de manière fiable des cellules qui ont subi Anastasis. Ici, nous décrivons des méthodes de microscopie vivants et un biocapteur de caspase pour détecter des cellules qui ont déjà inversé apoptose et e de stade tardifen survécu.

<table><tbody><tr><td>LSM780 Microscopie confocale</td><td>Carl Zeiss Plat de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>culture à fond de verre</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Transparent CultFoi</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1116-084</td><td></td></tr><tr><td>CO2 indépendant</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos</td><td>Life Technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Annexine V Biovision</td><td></td><td>K201</td><td></td></tr></tbody></table>

stratégies pour le suivi anastasis, une cellule de survie phénomène qui renverse apoptose

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (grec pour «la hausse à la vie») fait référence à la récupération des cellules mourantes. Avant que ces cellules se rétablissent, ils sont passés par des points de contrôle importants de l&#39;apoptose, y compris la fragmentation mitochondriale, la libération du cytochrome c mitochondrial dans le cytosol, l&#39;activation des caspases, la condensation de la chromatine, des dommages de l&#39;ADN, la fragmentation nucléaire, bourgeonnement de la membrane plasmique, le rétrécissement des cellules, l&#39;exposition de la surface cellulaire de phosphatidylsérine, et la formation de corps apoptotiques. Anastasis peut se produire lorsque les stimuli apoptotiques sont retirés avant la mort, permettant ainsi cellules mourantes pour inverser l&#39;apoptose et potentiellement d&#39;autres mécanismes de mort. Par conséquent, Anastasis semble impliquer des processus physiologiques de guérison qui pourrait également soutenir les cellules endommagées de façon inappropriée. Les fonctions et les mécanismes de Anastasis sont pas encore claires, entravée en partie par les outils limités pour détecter les événements passés après la récupération des cellules apparemment en bonne santé. Stratégies pour détecter AnastaSIS permettra des études sur les mécanismes physiologiques, les dangers de cellules morts-vivants dans la pathologie de la maladie, et des thérapies potentielles pour moduler Anastasis. Ici, nous décrivons des stratégies efficaces en utilisant la microscopie de cellules vivantes et un biocapteur de caspase mammifère pour l&#39;identification et le suivi Anastasis dans des cellules mammifères.

Pour étudier l'inversion de l'apoptose, des cellules de culture tissulaire sont d'abord exposés à un stimulus de mort pour déclencher l'apoptose. Lorsque les cellules affichent caractéristiques de l'apoptose, milieu de culture frais est ensuite appliqué à laver le stimulus et ensuite incuber les cellules mourantes pour permettre la récupération (figure 1A). Ici, la question clé étant adressée est de savoir jusqu'où cellules cultivées meurent individuels peuvent progresser vers l'apoptose et encore subir...

Le terme anastase fait référence au phénomène dans lequel les cellules mourantes inversent un processus de suicide cellulaire à un stade avancé, se réparent elles-mêmes et finissent par survivre. Nous démontrons ici des protocoles de détection et de suivi des cellules qui subissent une anastase.

Stratégies pour le suivi Anastasis, une cellule de survie Phénomène qui renverse apoptose

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

L’objectif global de cette procédure est de détecter et de suivre l’inversion du processus de mort cellulaire apoptotique et des cellules cultivées par microscopie à cellules vivantes. Les cellules saines se propagent sur le substrat et contiennent des mitochondries filamenteuses tubulaires autour du noyau. Cependant, lorsque les cellules se suicident par apoptose, les cellules mourantes présentent des caractéristiques morphologiques uniques pour détecter et suivre l’inversion de l’apoptose.Les cellules sont plaquées dans des boîtes de culture cellulaire à fond de verre. L’étape suivante consiste à effectuer une coloration de cellules vivantes pour marquer les mitochondries et les noyaux. Cela permet de détecter les caractéristiques morphologiques des cellules saines et apoptotiques.Par microscopie à cellules vivantes, les cellules saines marquées sont ensuite exposées à un stimulus de mort pour induire l’apoptose. Lorsque l’apoptose est détectée, les cellules mourantes sont lavées puis incubées avec un milieu de culture cellulaire frais pour permettre la récupération cellulaire, l’imagerie des cellules vivantes est utilisée pour détecter et suivre l’inversion de l’apoptose et ses

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Nous présentons un protocole simple de visualiser les régions de la mort cellulaire programmée (PCD) dans des embryons de souris et la différenciation de cellules souches embryonnaires cultures (ES) en utilisant un colorant hautement soluble appelée Lysotracker.

L&#39;utilisation de Lysotracker pour détecter la mort cellulaire programmée dans les embryons et la différenciation des cellules souches embryonnaires

Contribution du facteur de remodelage de la chromatine ACF à la mort cellulaire induite par E4orf4 a été mesurée. Le protocole comprend la sélection de clones cellulaires dans lesquelles le traitement doxycycline induit knockdown conditionnelle de sous-unités ACF du Acf1 et SNF2h, et l'utilisation du test DAPI pour mesurer la mort cellulaire induite par E4orf4 dans les lignées cellulaires inductibles.

Préparation de lignées cellulaires pour Knockdown conditionnelle de l&#39;expression génétique et évaluation des effets sacrifiés sur la mort cellulaire induite par E4orf4

Ce protocole décrit l'utilisation de bromodésoxyuridine (BrdU) absorption pour permettre le suivi temporel des cellules qui étaient en phase S à un moment précis dans le temps. Addition de colorants d'ADN et de l'étiquetage d'anticorps facilite l'analyse détaillée du sort des cellules en phase S au temps plus tard.

Suivi temporel de la progression du cycle cellulaire par cytométrie en flux, sans la nécessité pour la synchronisation

Anastasis est techniquement difficile à détecter en vivo , parce que les cellules qui ont inversé le processus de mort cellulaire peuvent être morphologiquement impossibles à distinguer des cellules saines normales. Nous décrivons ici les protocoles pour détecter et suivre des cellules subissant anastasis animaux vivants à l’aide de notre système de biocapteur nouvellement mis au point en vivo CaspaseTracker.

Détection de Anastasis In Vivo par CaspaseTracker biocapteur

Ici, nous présentons un protocole pour la détermination des événements de signalisation intracellulaire induits dans les cellules viables par l’interaction physique avec des cellules mortes ou mourantes adjacentes. Le protocole se concentre sur les événements de signalisation induits par la reconnaissance des cellules mortes par le biais du récepteur, par opposition à leur absorption phagocytaire ou à la libération de médiateurs solubles.

Identification des événements intracellulaires de signalisation induite dans les cellules viables par interaction avec les cellules voisines Subissant la mort cellulaire apoptotique

Imagerie de cellules vivantes fournit une foule de renseignements sur des cellules individuelles ou des populations entières qui est inaccessible par cellule fixe d’images seul. Ici, les protocoles d’imagerie de cellules vivantes pour évaluer les décisions de sort de cellule après un traitement par le paclitaxel drogue anti mitotique sont décrits.

À long terme vivre-cellule d’imagerie afin d’évaluer le sort de la cellule en réponse au Paclitaxel

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les cellules apoptotiques de cancer du sein par un tri de fluorescence-lancée de cellules et plus détecter le passage de cellules non souches du cancer du sein de cellules de cellules souches-comme pour le cancer du sein après le renversement de l’apoptose par cytométrie en flux.

Débit par cytométrie en flux détection de cellules de cellules souches-comme pour le Cancer du sein nouvellement formé après le renversement de l’apoptose

La méthode présentée combine l'analyse quantitative des ruptures à double brin d'ADN (DSB), de la distribution du cycle cellulaire et de l'apoptose pour permettre l'évaluation par cycle cellulaire de l'induction et de la réparation de l'ASD ainsi que les conséquences d'une défaillance de réparation.

Mesure spécifique au cycle cellulaire de h2AX et d'apoptose après stress génotoxique par cytométrie de flux

Ce protocole décrit une méthode pour mesurer en temps réel des flux de calcium mitochondrial par imagerie de fluorescence. La méthode tire parti d'une circulaire permuté YFP à base de capteurs de calcium à double excitation ratiométrique (ratiométrique pericam-mt) sélectivement exprimé dans les mitochondries.

Surveillance des changements dynamiques dans les niveaux de calcium mitochondrial cours de l&#39;apoptose en utilisant un capteur de calcium codées génétiquement

Une méthode précise pour l'évaluation de la mort cellulaire est décrite. Le protocole améliore conventionnels annexine V / iodure de propidium (PI) des protocoles, qui affichent jusqu'à 40% de faux positifs des événements dans des lignées cellulaires et cellules primaires à partir d'un large éventail de modèles animaux.

Mise à jour annexine V / propidium Assay apoptose iodure permettant une évaluation précise de la mort cellulaire

Découvrez comment détecter et suivre l'anastasis, le phénomène de survie cellulaire qui inverse l'apoptose, par microscopie à cellules vivantes. Cette méthode permet d'observer la récupération morphologique et moléculaire des cellules.

Stratégies pour le suivi Anastasis, une cellule de survie Phénomène qui renverse apoptose

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