Name: Stratégies pour le suivi Anastasis, une cellule de survie Phénomène qui renverse apoptose (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Découvrez comment détecter et suivre l'anastasis, le phénomène de survie cellulaire qui inverse l'apoptose, par microscopie à cellules vivantes. Cette méthode permet d'observer la récupération morphologique et moléculaire des cellules.

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Nous remercions le Révérend Dr. Ralph Bohlmann et le révérend Dr James Voelz pour suggérer le mot &quot;Anastasis&quot; pour décrire l&#39;inversion de l&#39;apoptose; Douglas R. Green pour les cellules HeLa exprimant de façon stable cytochrome c GFP; Charles M. Rudin et Eric E. Gardner pour H446 cellules; Heather Lamb d&#39;assistance en dessin animé à la vidéo; Yee Hui Yeo de discussion précieuse de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par un Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), la bourse Dr Walter Szeto Memorial (HLT), bourse Fulbright 007-2009 (HLT), Fondation Life Science Research Fellowship (HLT), NIH accorde NS037402 (JMH) et NS083373 (JMH), et le Comité de la Hong Kong University Grants AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang est une Fondation Shurl et Kay Curci Fellow de la Fondation de recherche en sciences de la vie.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Anastasis désigne le phénomène où les cellules qui ont activés voie de mort cellulaire inverse par la suite le processus de la mort et de survivre. Ici, nous avons démontré que l&#39;imagerie des cellules vivantes peut être utilisée pour confirmer que les mêmes cellules individuelles en fait peuvent inverser apoptotique processus de mort cellulaire à un stade tardif, et puis continuer survivant et la reproduction. Nos protocoles décrivent différentes conditions de traitement spécifiques d&#39;un type cellulaire optimisé...

Apoptose (grec pour «tomber à la mort&quot;) est généralement supposé être un processus à sens unique se terminant par suicide cellulaire 1-7. La perturbation génétique de gènes pro-mort conduit à la survie des cellules supplémentaires qui seraient autrement mourir dans des animaux entiers, y compris des cellules qui ont déjà ouvert la voie de 8,9 apoptose. De même, les manipulations génétiques permettent aux cellules de mammifères en bonne santé qui affichent artificiellement &quot;Eat Me&quot; signaux ou qui perdent leur adhérence à la matrice extracellulaire pour échapper à la mort par phagocytose de cellules entières ou entose respectivement 10,11. Cependant, nous et d&#39;autres avons montré que, sans manipulation génétique des cellules de mammifères sains et de lignées cellulaires peuvent également récupérer dès les premiers stades de l&#39;apoptose 12-15. Utilisation d&#39;outils pour suivre des cellules individuelles, nous avons encore démontré la récupération de stades tardifs de l&#39;apoptose 12,13, après que les cellules ont passé les postes de contrôle important que typiqueLy marquer le «point de non-retour&quot; 2-6. Ces points de contrôle de l&#39;apoptose au stade avancé comprennent la libération du cytochrome c mitochondrial, l&#39;activation des caspases, la fragmentation nucléaire, et la formation de corps apoptotiques. Nous avons adopté un mot composé grec &quot;Anastasis&quot;, qui signifie &quot;la hausse à la vie&quot;, pour décrire ce renversement de l&#39;apoptose au bord de la mort cellulaire 2-6. Sauf tout le processus de recouvrement des mourants est observé par imagerie des cellules vivantes, il est difficile de distinguer les cellules qui ont subi Anastasis partir de cellules qui ne ont jamais connu les événements apoptotiques. Des décennies de travail ont révélé que les caractéristiques morphologiques de suicide cellulaire par apoptose sont entraînés par des événements biochimiques et moléculaires évolutives conservées 16-19. Ces événements favorisent l&#39;auto-destruction des cellules pour réguler les processus de développement et homéostatiques dans les organismes unicellulaires et multicellulaires en éliminant endommagé ou dcellules angerous 16-19. Alors que les cellules apoptotiques peuvent être facilement distingués par des manifestations morphologiques, biochimiques et moléculaires de l&#39;apoptose 1,5,6,16,20 standardisés, il ne existe actuellement aucun marqueur spécifique connue Anastasis 12,13. Fait important, les cellules qui ont subi anastasis semblent être les cellules saines normales et des cellules qui commencent juste inverser l&#39;apoptose des cellules mourantes apparaître comme apoptotiques 12,13. Ainsi, de nouveaux outils sont nécessaires pour conclure avec certitude qu&#39;une cellule donnée survivant avait déjà connu des processus apoptotiques actifs. L&#39;apoptose est généralement admis comme une cascade irréversible parce que ce est un processus de destruction rapide et massive. Bien qu&#39;il pourrait prendre quelques minutes à quelques jours pour certaines cellules pour initier l&#39;apoptose, une fois mitochondries ont publié facteurs tels que apoptogènes cytochrome c dans le cytosol 21,22, caspases peuvent être activées dans les 5 minutes 23,24, suivis par cytoplasmique etcondensation nucléaire dans les 10 minutes de 25 à 27, et la mort cellulaire peu après 25-27. Les caspases activées orchestrent l&#39;apoptose par clivage et en inactivant des composants structuraux et fonctionnels clés dans le but de démolition 2,28 cellulaire, tel que l&#39;inhibiteur d&#39;endonucléase DFF45 / CISD 29,30. Caspases activent également des facteurs pro-apoptotiques, comme famille Bcl-2 BID membre, qui translocation vers les mitochondries pour favoriser la libération du cytochrome c mitochondrial 31,32. l&#39;activité de la caspase résulte également dans la cellule exposition de la surface de la phosphatidylsérine comme un signal &quot;me manger&quot; pour la promotion de l&#39;engloutissement de mourir cellules par les macrophages ou les cellules voisines par phagocytose 33. En outre, les événements apoptotiques rendent la dysfonction mitochondriale, perturbant bioénergétique cellulaire et métabolisme 34,35,36. Ainsi, la récupération de cette destruction semble intuitivement peu probable. Contrairement à l&#39;original se attendretions, les cellules peuvent inverser le processus de mort cellulaire par apoptose, même à un stade tardif. En surveillant en permanence le sort de mourir des cellules en culture, nous avons observé la réversibilité de l&#39;apoptose de stade tardif dans une plage de cellules primaires et des lignées cellulaires 12,13. L&#39;élimination du stimulus de mort a permis la récupération des éléments visibles de l&#39;apoptose, telles que fragmentation mitochondriale, de la condensation de la chromatine, des dommages de l&#39;ADN, le plasma membrane bourgeonnement, l&#39;exposition de la surface cellulaire de la phosphatidylsérine, la libération du cytochrome c mitochondrial, l&#39;activation des caspases, la fragmentation nucléaire, rétrécissement des cellules, et la formation de corps apoptotiques. Ces observations soulèvent des questions sans réponses concernant les fonctions, les conséquences et les mécanismes de Anastasis. Pour répondre à ces questions, une condition préalable est d&#39;identifier de manière fiable des cellules qui ont subi Anastasis. Ici, nous décrivons des méthodes de microscopie vivants et un biocapteur de caspase pour détecter des cellules qui ont déjà inversé apoptose et e de stade tardifen survécu.

<table><tbody><tr><td>LSM780 Microscopie confocale</td><td>Carl Zeiss Plat de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>culture à fond de verre</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Transparent CultFoi</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1116-084</td><td></td></tr><tr><td>CO2 indépendant</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos</td><td>Life Technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Annexine V Biovision</td><td></td><td>K201</td><td></td></tr></tbody></table>

stratégies pour le suivi anastasis, une cellule de survie phénomène qui renverse apoptose

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (grec pour «la hausse à la vie») fait référence à la récupération des cellules mourantes. Avant que ces cellules se rétablissent, ils sont passés par des points de contrôle importants de l&#39;apoptose, y compris la fragmentation mitochondriale, la libération du cytochrome c mitochondrial dans le cytosol, l&#39;activation des caspases, la condensation de la chromatine, des dommages de l&#39;ADN, la fragmentation nucléaire, bourgeonnement de la membrane plasmique, le rétrécissement des cellules, l&#39;exposition de la surface cellulaire de phosphatidylsérine, et la formation de corps apoptotiques. Anastasis peut se produire lorsque les stimuli apoptotiques sont retirés avant la mort, permettant ainsi cellules mourantes pour inverser l&#39;apoptose et potentiellement d&#39;autres mécanismes de mort. Par conséquent, Anastasis semble impliquer des processus physiologiques de guérison qui pourrait également soutenir les cellules endommagées de façon inappropriée. Les fonctions et les mécanismes de Anastasis sont pas encore claires, entravée en partie par les outils limités pour détecter les événements passés après la récupération des cellules apparemment en bonne santé. Stratégies pour détecter AnastaSIS permettra des études sur les mécanismes physiologiques, les dangers de cellules morts-vivants dans la pathologie de la maladie, et des thérapies potentielles pour moduler Anastasis. Ici, nous décrivons des stratégies efficaces en utilisant la microscopie de cellules vivantes et un biocapteur de caspase mammifère pour l&#39;identification et le suivi Anastasis dans des cellules mammifères.

Pour étudier l'inversion de l'apoptose, des cellules de culture tissulaire sont d'abord exposés à un stimulus de mort pour déclencher l'apoptose. Lorsque les cellules affichent caractéristiques de l'apoptose, milieu de culture frais est ensuite appliqué à laver le stimulus et ensuite incuber les cellules mourantes pour permettre la récupération (figure 1A). Ici, la question clé étant adressée est de savoir jusqu'où cellules cultivées meurent individuels peuvent progresser vers l'apoptose et encore subir...

Le terme anastase fait référence au phénomène dans lequel les cellules mourantes inversent un processus de suicide cellulaire à un stade avancé, se réparent elles-mêmes et finissent par survivre. Nous démontrons ici des protocoles de détection et de suivi des cellules qui subissent une anastase.

Stratégies pour le suivi Anastasis, une cellule de survie Phénomène qui renverse apoptose

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

L’objectif global de cette procédure est de détecter et de suivre l’inversion du processus de mort cellulaire apoptotique et des cellules cultivées par microscopie à cellules vivantes. Les cellules saines se propagent sur le substrat et contiennent des mitochondries filamenteuses tubulaires autour du noyau. Cependant, lorsque les cellules se suicident par apoptose, les cellules mourantes présentent des caractéristiques morphologiques uniques pour détecter et suivre l’inversion de l’apoptose.Les cellules sont plaquées dans des boîtes de culture cellulaire à fond de verre. L’étape suivante consiste à effectuer une coloration de cellules vivantes pour marquer les mitochondries et les noyaux. Cela permet de détecter les caractéristiques morphologiques des cellules saines et apoptotiques.Par microscopie à cellules vivantes, les cellules saines marquées sont ensuite exposées à un stimulus de mort pour induire l’apoptose. Lorsque l’apoptose est détectée, les cellules mourantes sont lavées puis incubées avec un milieu de culture cellulaire frais pour permettre la récupération cellulaire, l’imagerie des cellules vivantes est utilisée pour détecter et suivre l’inversion de l’apoptose et ses conséquences telles que la réparation cellulaire et la survie, comme le montrent respectivement la récupération morphologique et la migration cellulaires. L’apoptose est un type de mort cellulaire programmée qui joue un rôle essentiel dans l’élimination des cellules indésirables ou dangereuses de notre corps.Ces processus de synthèse cellulaire sont généralement considérés comme irréversibles car une fois qu’ils ont commencé, la cellule meurt certainement par la suite, cependant, nous avons découvert qu’en fait, la cellule mourante peut inverser le processus de mort cellulaire, puis survivre et dériver même. Ils ont peut-être des étapes critiques qui ont été forcées d’être le point de faible rendement, telles que la cyto C, la libération, l’activation basée sur le cas, la fragmentation nucléaire et la formation de corps apoptotiques. Après avoir consulté des experts grecs, nous adoptons un terme, une stase, qui signifie s’élever à la vie.Pour décrire le phénomène d’inversion de l’apoptose et d’autres processus de mort cellulaire, l’anthèse est difficile à détecter car les cellules qui inversent l’apoptose ressemblent à des cellules lourdes normales. Cependant, par microscopie continue sur cellules vivantes, nous pouvons détecter une anastase dans une grande partie des cellules. La maîtrise de cette technique est importante car elle nous permet d’étudier la recréation de l’anthèse.Nous avons proposé que cette anthèse pourrait guérir les dommages aux tissus, mais elle pourrait également permettre aux cellules endommagées de survivre et de former des cancers. Par conséquent, l’identification des mécanismes qui contrôlent les anesthésies pourrait nous fournir de nouvelles approches pour traiter les maladies injectables telles que le cancer, l’insuffisance cardiaque et la dégénérescence en médiant la mort et la survie cellulaires pour détecter et suivre l’anastasis. Après les événements apoptotiques, une microscopie à cellules vivantes en accéléré est effectuée pour suivre quelles cellules peuvent inverser l’apoptose après l’induction transitoire de la mort cellulaire.Pour commencer, ajoutez un millilitre de solution de poly de lycine dans une boîte de culture cellulaire de 35 millimètres avec un fond en verre plus fin. Après une incubation d’une minute pour recouvrir la surface du verre, aspirez la solution et lavez le verre avec deux millilitres de solution saline tamponnée au phosphate Pour préparer les cellules d’abord trypsine yeux, heela cellules à 80 à 90 % de confluence Une fois les cellules détachées, ajoutez 10 millilitres de milieu à 37 degrés Celsius pour suspendre les cellules. Transférez ensuite la solution de suspension cellulaire dans un tube stérile de 10 millilitres à centrifuger à 160 fois G pendant une à deux minutes.Après l’essorage, aspirez soigneusement le fluide. Ne dérangez pas la pastille de cellule au fond du tube. Procéder à la remise en suspension des cellules avec 10 millilitres de milieu de culture cellulaire par pipetage doux.Voyez ensuite deux millilitres de cellules suspendues sur du verre pré-enduit de 35 millimètres. Boîtes de culture cellulaire inférieures. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant une journée.Il peut être nécessaire d’ajuster le nombre de cellules pour que les cellules puissent atteindre une fluidité de 80 % au moment de l’imagerie. La fragmentation mitochondriale et nucléaire sont les caractéristiques morphologiques de l’apoptose. Pour visualiser les mitochondries et les noyaux, effectuez une coloration peu de temps avant l’imagerie de cellules vivantes.Commencez le protocole de coloration en ajoutant d’abord deux microlitres de coloration mitochondriale. MIT tracker red 50 micromolaire et deux microlitres de colorant d’ADN accrochés 3 3 3 4 2 10 milligrammes par millilitre de solution mère dans un microtube de centrifugation stérile, ajoutez un millilitre de milieu de culture conditionné de la boîte de culture cellulaire dans le tube de micro-centrifugeuse et mélangez bien avec les colorants par pipetage. Ensuite, rajoutez le mélange dans le plat de culture.Après avoir incubé la boîte à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 20 minutes, aspirez le milieu et lavez les cellules colorées trois fois avec un millilitre de sérum de culture cellulaire chaude, de milieu ou de solution saline tamponnée au phosphate. Ensuite, incubez les cellules avec un milieu de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq minutes supplémentaires. Évitez de prolonger le temps de coloration, car le signal de fond non spécifique des cellules de coloration pourrait augmenter en raison d’une coloration excessive.Après l’incubation, aspirez le milieu, lavez à nouveau les cellules, puis continuez à incuber les cellules avec deux millilitres de milieu de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Les composants du microscope doivent atteindre l’équilibre thermique pour éviter la dérive de mise au point et le décalage du plan XY dus à la dilatation et à la contraction thermiques des composants. Pour vous assurer que l’équilibre thermique est atteint, allumez la chambre de contrôle environnemental et l’incubateur de la platine pour préchauffer le microscope à 37 degrés Celsius au moins deux heures avant le début de l’imagerie.Allumez ensuite le régulateur de dioxyde de carbone pour fournir 5 % de dioxyde de carbone à la chambre de contrôle de l’environnement. Lorsque l’approvisionnement en dioxyde de carbone n’est pas disponible, un milieu indépendant du dioxyde de carbone peut être utilisé pour soutenir la croissance cellulaire. Avant l’imagerie, placez une goutte d’huile d’immersion directement sur un objectif 40x avec une ouverture numérique de 1,4.Positionnez ensuite délicatement la boîte de culture avec les cellules colorées sur l’incubateur à 37 degrés Celsius. Couvrir la boîte d’une feuille froide transparente pour éviter la perte d’eau par évaporation et la contamination de l’échantillon afin d’effectuer une microscopie à contraste interférentiel différentiel. N’utilisez pas le couvercle de la parabole de culture en plastique car le plastique peut perturber la polarité de la lumière.Ensuite, localisez et concentrez-vous sur un groupe de cellules saines qui se propagent sur la surface du verre avec des mitochondries tubulaires et des noyaux ronds. Choisissez les cellules au centre ou près du centre de la boîte de culture pour vous assurer que les cellules sont au même plan focal une fois en place, prenez une exposition rapide par microscopie confocale pour déterminer l’intensité laser minimale et le temps d’exposition pour obtenir des images claires des cellules et de leurs organites. Cette étape est cruciale.Comme la lumière laser est phototoxique pour les cellules, une optimisation et un réglage sont nécessaires Pour éliminer la dérive de mise au point, utilisez un dispositif de compensation automatique continue de la dérive de mise au point qui utilise une diode électroluminescente infrarouge. Alternativement, le plan de mise au point peut être corrigé manuellement. Lorsque les cellules et le plan focal sont identifiés, optimisez tous les paramètres et prenez une image de test avant de commencer l’imagerie des cellules vivantes.Ensuite, commencez l’imagerie en direct pour imager les cellules saines avec des intervalles d’une minute pendant 10 cycles pour induire l’apoptose. Retirez le milieu cellulaire à l’aide d’une pipette transparente. Appliquez un stimulus de mort cellulaire prémélangé à un milieu de culture cellulaire à 37 degrés Celsius dans la boîte.Continuez à couvrir le plat d’une feuille culte transparente. Lors de l’imagerie en accéléré après l’application du stimulus de mort cellulaire, ajustez l’intervalle de temps pour imager les cellules traitées afin de détecter l’apoptose en capturant les caractéristiques morphologiques de l’apoptose telles que la tache de la membrane plasmique, la fragmentation mitochondriale, la condensation et la fragmentation nucléaires, la condensation cytoplasmique, le rétrécissement cellulaire et la formation du corps apoptotique. Lorsque l’apoptose est observée, prélever le milieu avec le stimulus de mort cellulaire et appliquer deux millilitres de milieu de culture cellulaire frais pour incuber les cellules.Poursuivre l’imagerie time-lapse pour observer la récupération morphologique des cellules et la conséquence de l’anastasis. Après l’élimination d’un stimulus de mort cellulaire mourant le cancer du poumon humain, les cellules H 4 46 peuvent inverser l’apoptose. Bien que les cellules présentent des caractéristiques de l’apoptose telles que le rétrécissement cellulaire, le flottement membranaire, la fragmentation mitochondriale, la condensation nucléaire et la fragmentation et l’apoptose, la formation du corps après l’anastase la division cellulaire peut être anormale.Dans cet exemple, au lieu de deux noyaux de dotter, trois noyaux principaux se forment après la division cellulaire avec formation de micro-noyaux indiquant des altérations génétiques dans les cellules de dotter. Cela suggère que l’anastase pourrait être mutagène après l’exposition d’une cellule à un stimulus de mort cellulaire. Les facteurs pro-apoptotiques se déplacent vers les mitochondries pour déclencher la libération du cytochrome C, ce qui conduit à l’assemblage d’un protosome et à l’activation basée sur le moulage pour la démolition cellulaire puis la mort cellulaire.Voici des cellules HELOC exprimant le cytochrome C marqué GFP, qui se localise dans les mitochondries après induction de l’apoptose. Le cytochrome C est libéré dans le cytosol. Cependant, après que les cellules ont été lavées puis incubées avec du cytosol frais, le cytochrome C ex est réduit à des niveaux normaux, ce qui indique qu’une anastase peut se produire après la libération du cytochrome C.On voit ici les cellules hela exprimant le biocapteur basé sur CA N-E-S-D-E-V-D-Y-F-P-N-L-S, qui se localise d’abord dans le cytosol après l’induction de l’apoptose comme prévu. Y-F-P-N-L-S se déplace vers le noyau en raison du clivage de DEVD par des bases coulées activées. Cependant, une fois que le stimulus de mort est éliminé et que les cellules sont incubées avec un milieu frais, Y-F-P-N-L-S reste dans le noyau tandis que les cellules retrouvent une morphologie normale, ce qui indique que la ptose VA inversée peut se produire après l’activation de la base de coulée.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser l’imagerie de cellules vivantes pour détecter l’anthèse et ses conséquences. Dans cette démonstration, nous utilisons l’éthanol comme inducteur d’ATO. Dans le même temps, la cellule peut inverser le processus de mort cellulaire induit par d’autres stimuli de mort tels que le teso DMSO et la sporine La lumière fluorescente est photosensible aux cellules, de sorte qu’il est essentiel de minimiser les nuits qui chauffent un échantillon pendant l’imagerie des cellules vivantes.Le processus d’apoptose et d’anastase nocturne dépend des activités sensibles à la température et sématiques. Par conséquent, il est important de maintenir les cellules à la même température pendant l’expérience pour garantir des résultats reproductibles.

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