Un procédé de criblage et de validation des mutations de résistance aux inhibiteurs de kinase

L’objectif global de cette procédure est d’identifier et de valider les mutations résistantes aux médicaments. Pour ce faire, il faut d’abord créer une bibliothèque de mutations aléatoires de l’oncogène ciblé. La deuxième étape consiste à réaliser un criblage in vitro pour l’émergence de clones résistants.

La troisième étape de la procédure consiste à séquencer les clones résistants pour identifier les mutations résistantes. La dernière étape consiste à valider les mutations résistantes en recréant les mutations à l’aide de la mutagenèse dirigée, suivie d’essais in vitro et in vivo. En fin de compte, des mutations cliniquement pertinentes de résistance aux médicaments peuvent être identifiées contre une paire de cibles médicamenteuses donnée.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’ENU ou les méthodes basées sur la PCR est qu’elle est impartiale et, contrairement à METAGENE ssis basée sur la PCR, celle-ci n’est pas limitée à la taille de l’oncogène ou au contenu en GC d’un gène. En général, ceux qui débutent dans cette technique auront du mal en raison d’un manque de connaissances en biologie moléculaire et cellulaire. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle.

Comme les étapes de néogenèse et de dépistage sont difficiles à apprendre. C’est parce que beaucoup de gens manquent d’expérience dans la production virale, dans la culture cellulaire et les milieux semi-cellulaires. Cette procédure commence par la transformation de cellules XL one red e coli avec un plasmide portant JAK two V 617 f une isoforme oncogénique de JAK two XL one red e coli les cellules sont défectueuses dans les mécanismes de réparation de l’ADN, leur permettant ainsi d’incorporer des mutations aléatoires lors de la réplication.

Mélangez 50 à 100 nanogrammes d’ADN plasmidique avec 100 microlitres de cellules compétentes dans un tube en polypropylène pré-refroidi. N’utilisez pas plus de 100 nanogrammes d’ADN car cela diminue l’efficacité de la transformation. Incuber sur de la glace pendant 30 minutes, en remuant doucement toutes les cinq minutes pour une bonne couverture de la bibliothèque.

Utilisez quatre à six tubes de cellules compétentes. Plongez les tubes en polypropylène dans un bain-marie à 42 degrés Celsius pendant un choc thermique de 45 secondes, puis incubez sur de la glace pendant deux minutes. Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu SOC dans chaque tube.

Incuber les tubes à 37 degrés Celsius tout en les secouant à 225 à 250 tr/min pendant 90 minutes. Cellules de plaque sur quatre plaques de vis sans fin de 10 centimètres LB contenant 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 16 à 24 heures.

Une fois que les colonies sont visibles, collectez-les en raclant les plaques avec un grattoir à plaques stérile. Regroupez les cellules de chaque plaque. Par la suite, l’ADN plasmidique est isolé à l’aide d’un kit d’extraction de plasmide commercial et l’hétérogénéité des mutations dans la banque est évaluée par séquençage un jour avant la plaque de transfection, quatre fois 10 jusqu’au sixième lymphocytes T HEK 2 93, sur des boîtes de 100 millimètres dans du DM EM contenant 10 % de FCS, de la pénicilline, de la streptomycine et deux millimolaires de L-glutamine.

Le lendemain, préparez les réactifs de transfection pour chaque plat de 100 millimètres. Mélangez cinq microgrammes de la bibliothèque de plasmides, cinq microgrammes d’un plasmide d’emballage rétroviral et 40 microlitres du gène FU pour obtenir un volume total de 400 microlitres en utilisant un milieu DM E EM sans sérum. Incuber le mélange d’ADN et de lipides pendant 20 minutes à température ambiante.

Ensuite, remplacez le milieu des cellules T HEK 2 93 par un milieu frais et ajoutez le complexe lipidique d’ADN goutte à goutte sur les cellules. Incuber à 37 degrés Celsius pendant six heures. Après six heures, remplacez le milieu de transfection par un milieu frais et incubez les plaques pendant 48 heures à 37 degrés Celsius par production de virus.

Après 48 heures d’incubation, prélever des surnageants viraux filtrés à travers un filtre à disque acro de 0,45 micromètre pour commencer la procédure de dépistage et d’identification des mutants JAK deux V 607 F résistants aux médicaments transduisent trois cellules BAF avec les surnageants rétroviraux. Mélangez 100 millions de BAF trois cellules avec 100 millilitres de surnageant viral pour un volume total de 300 millilitres en utilisant un milieu RPMI contenant 10 % de sérum et de poly cerveau. Répartissez ce mélange de cellules et de virus supernat dans plusieurs plaques de six puits en remplissant chaque puits de quatre à cinq millilitres.

Centrifugez les plaques à 1 250 GS pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius. Après la centrifugation, incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant 24 heures le lendemain, regroupez les cellules transduites pour chaque concentration de médicament. Mélangez 10 millilitres de cellules avec du ruxolitinib dans un tube de 50 millilitres.

Les concentrations de ruxolitinib testées dans cet exemple sont de 1, 5, 2, 0,5 et 10 micromolaires. Augmentez le volume à 40 millilitres en utilisant du RPMI contenant 20 % de sérum. Ajoutez 10 millilitres de vis sans fin à 1,2 % dans les cellules et mélangez soigneusement la plaque dans six plaques à puits.

Distribution de quatre millilitres par puits. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant deux semaines. Une fois que les colonies résistantes sont visibles, utilisez des pointes de pipette de 0,2 millilitre pour choisir les colonies et les sous-cultiver individuellement.

Dans des plaques de 24 puits pendant trois à quatre jours, récoltez les trois cellules BAF résistantes par centrifugation à 450 GS pendant cinq minutes à température ambiante. Après avoir isolé l’ADN génomique à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN génomique commercial, amplifiez l’ADNC JAK two pleine longueur à partir de l’ADN génomique par PCR. Les produits PCR sont ensuite séparés par l’électrophorèse sur gel d’Agar Rose et la bande d’ADN 3,4 KILOBASE.

Le cadre à deux revêtements est isolé à l’aide d’un kit d’extraction de gel commercial. Enfin, séquencez l’ARNC complet à l’aide de huit amorces internes couvrant la séquence codante et analysez les séquences à l’aide d’un logiciel commercial pour valider les mutations résistantes aux médicaments. Des variants sélectionnés in vitro sont générés par mutagenèse dirigée de la séquence JAK deux V 617 F et réintroduits dans les cellules BAF trois.

Ajouter 50 microlitres de milieu contenant diverses concentrations de ruxolitinib dans les puits à travers la plaque séparément, la plaque 10 à la quatrième des trois cellules JAK deux cellules V 617 F dans chaque puits d’une plaque à 96 puits Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 60 heures Pour évaluer la viabilité cellulaire, ajoutez 10 microlitres de WST un réactif dans chaque puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant deux à quatre heures. Enregistrez l’absorbance à 450 à l’aide d’un lecteur de plaques. Effectuer tous les tests en trois exemplaires et tracer l’absorbance moyenne en fonction des concentrations de ruxolitinib.

Effectuez une courbe sigmoïdale du meilleur ajustement à l’aide d’un score d’algorithme d’ajustement de courbe non linéaire. La concentration du médicament entraînant une viabilité cellulaire de 50 % en tant que CI 50 cellulaire puis la validation in vivo des mutations résistantes sont effectuées comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Étant donné que les clones cellulaires résistants générés par mutagenèse aléatoire peuvent porter plus d’une mutation, ces mutations doivent être validées de manière isolée par des essais in vitro et in vivo.

Dans l’essai in vitro, des variants sélectionnés ont été générés par mutagenèse dirigée de la séquence JAK deux V 607 F et réintroduits dans trois cellules BAF, qui ont ensuite été mesurées pour la capacité de prolifération cellulaire à différentes doses de ruxolitinib afin d’évaluer les valeurs IC 50. De plus, l’immunotransfert pour la phosphotyrosine ou le phospho STAT cinq a été effectué sur des lysats protéiques de cellules BF trois qui ont été incubées avec des doses croissantes de ruxolitinib afin d’exclure toute résistance médiée hors cible. Les mutants présentant des valeurs IC 50 améliorées et une autophosphorylation persistante à des concentrations plus élevées de ruxolitinib sont donc confirmés comme étant des variants résistants aux médicaments pour valider la résistance in vivo.

Des cellules BF trois conçues pour exprimer JAK, deux variants V, six variants 17 F et la cerise luciférase ont été injectées à des souris, qui ont ensuite reçu une injection de ruxolitinib pendant deux semaines. Après deux semaines. Les souris ont été imagées pour la bioluminescence catalysée par la luciférase, le chimérisme BAF trois dans la moelle osseuse et le flux sanguin périphérique a été évalué en mesurant la fluorescence des cellules positives à la cerise.

Les résultats montrent que les souris exprimant JAK deux V 607 F sont au ruxolitinib tandis que les variants résistants présentent des augmentations progressives de la bioluminescence au cours de la période de traitement. Une fois maîtrisée, la néogenèse aléatoire peut être réalisée en quatre à cinq jours si elle est effectuée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de développer un plasmide randomisé, une banque d’ADN pour le criblage in vitro contre n’importe quelle paire de cibles de médicaments.

N’oubliez pas que travailler avec des rétrovirus peut être extrêmement dangereux. Des précautions doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.