Name: Un procédé de criblage et de validation des mutations de résistance aux inhibiteurs de kinase (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Découvrez un protocole de criblage et validation des mutations de résistance aux inhibiteurs de kinase en cancérologie. Cette méthode utilise une bibliothèque de mutations aléatoires et des tests in vitro pour identifier les mécanismes de résistance génétique.

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Cette étude a été financée par des subventions à M.A. du NCI (1RO1CA155091), du NHLBI (1R21HL114074) et de la Fondation de recherche sur la leucémie. M.A. est récipiendaire du prix V-Scholar de la Fondation V. Les auteurs sont reconnaissants à la Dre Sara Rohrabaugh pour l’édition.

NOTE: Toutes les procédures dans ce protocole ont été menées selon l&#39;Institut national de lignes directrices de la santé pour le traitement et le soin éthiques des animaux, et selon un IACUC protocole d&#39;utilisation d&#39;animaux approuvé. Ligne 1. maintenance des cellules <ol><li> Culture des cellules BAF3 dans du milieu RPMI-1640 complété avec 10% de sérum bovin fœtal et de la pénicilline / streptomycine (100 unités / ml et 100 pg / ml) et le milieu de culture usé de cellules WEHI. Cultiver les cellules HEK293T dans du DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et de la pénicilline / streptomycine (100 unités / ml et 100 pg / ml). Maintenir les cellules à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2. </li></ol> 2. Construction du plasmide <ol><li> Cloner la souris JAK2 et son oncogénique isoforme JAK2 V617F dans-pMSCV-puro-GW par LR clonase en utilisant la procédure de clonage recombinaison standard. </li><li> Pour la construction du vecteur d&#39;expression de la luciférase (Luc-pMSCV-Cherry-GW) utilisé dans l&#39;en-viimagerie de vo, amplifier la luciférase de pLVX-Tet-ON vecteur par PCR utilisant des amorces (LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG et LUC-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC) suivi avec le clonage dans pENTR-SD-TOPO pour générer pENTR-Luc, qui est utilisé pour transférer le gène de la luciférase dans le vecteur rétroviral, pMSCV-Cherry-GW clonage par recombinaison médiée utilisant LR clonase. </li></ol> 3. Préparation de Random Mutation Bibliothèque, le dépistage et l&#39;identification des mutations 3.1) mutagenèse aléatoire <ol><li> Pleine longueur clone de JAK2 sauvage et la mutation V617F dans vecteur rétroviral pMSCV-puro-GW en utilisant une technologie de recombinaison de clonage commercial. </li><li> Utiliser 1 ug d&#39;ADN de plasmide JAK2 V617F-à transformer ou XL-1 Rouge, E. cellules de E. coli, qui est défectueux dans les mécanismes de réparation de l&#39;ADN leur permettant ainsi d&#39;intégrer des mutations aléatoires lors de la réplication. Plus précisément, mélanger de 50 à 100 ng d&#39;ADN (plus de 100 ng d&#39;ADN diminue l&#39;efficacité de transformation) avec 100 pi de cellules compétentes dans un tube en polypropylène pré-réfrigérés et incubé sur de la glace pendant 30 minutes, remuant doucement toutes les 5 min. Pour une bonne couverture de la bibliothèque, utilisez quatre à six tubes de cellules compétentes. NOTE: Plus de 100 ng d&#39;ADN diminue l&#39;efficacité de la transformation </li><li> Plonger le tube dans un bain d&#39;eau à 42 ° C pour un choc thermique de 45 secondes et incuber sur de la glace pendant 2 min. Ensuite, ajouter 1 ml de milieu SOC (2,0% de tryptone, 0,5% d&#39;extrait de levure, 0,05% de NaCl, 10 mM de MgCl2, 10 mM MgSO4 et 0,4% de D-glucose). Incuber le tube à 37 ° C tout en agitant à 225 à 250 tours par minute pendant 90 min. </li><li> cellules de la plaque de chaque tube sur quatre 10 cm plaques d&#39;agar-LB contenant 100 ug / ml d&#39;ampicilline. Incuber les plaques pour 16 à 24 heures à 37 ° C. </li><li> Après colonies visibles, les recueillir en grattant les plaques avec une plaque racleur stérile. Piscine cellules de chaque ADN plasmidique isolat plaque et en utilisant un kit d&#39;extraction de plasmide commercial. NOTE: Habituellement colonies sont plus petits et prennent 18 à 24 h pour êtrevisible parce que ce sont des souches bactériennes à croissance lente. A ce stade, d&#39;évaluer l&#39;hétérogénéité des mutations dans la bibliothèque par digestion de restriction avec un réducteur classique tel que Sau 3A1 ou Taq1 ou séquençage. </li></ol> 3.2) Production de surnageants rétroviraux et la transduction <ol><li> Un jour avant la transfection, la plaque 4 x 10 6 cellules HEK 293T dans 100 cm plats dans du DMEM contenant 10% de FCS, de la pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine. </li><li> Le lendemain, remplacer le milieu et la transfection des cellules avec une mutagenèse bibliothèque pMSCV-JAK2 V617F-. Pour chaque plaque de 10 cm, mélange 10 pg de l&#39;ADN (5 ug de la banque de plasmides et de 5 ug de plasmide retroviral emballage, pCLEco) avec 40 ul de FuGENE à un volume total de 400 ul en utilisant du sérum de milieu DMEM libre. Incuber le mélange d&#39;ADN et de lipide pendant 20 min à température ambiante. Après 20 minutes ajouter la baisse complexe ADN-lipides sage au-dessus des cellules HEK293T. </li><li> Après six heures, changer le milieu de transfection wie milieu frais et incuber les plaques pendant 48 heures à 37 ° C pour la production de virus. Après 48 h d&#39;incubation, on collecte les surnageants viraux filtrés à travers un filtre Acrodisc de 0,45 pm. </li></ol> 3.3) Sélection des clones résistants in vitro <ol><li> Pour les mutants JAK2 V617F-résistantes médicaments, la transduction de cellules BAF3 100 000 000 avec 100 ml de surnageants de virus ayant un titre viral de 0,5 à 1 x 10 6. Plus précisément, mélanger 10 8 cellules avec 100 ml de surnageant de virus à un volume total de 300 ml en utilisant du milieu RPMI contenant 10% de sérum et 24 ug / ml de concentration finale (polyberene de ployberene est 8 ug / ml). Distribuer ces mélangeurs de cellules dans de multiples plaques six puits (4-5 ml par puits). </li><li> Centrifuger les plaques à 1250 g pendant 90 min à 25 ° C. Après centrifugation, les plaques incuber à 37 ° C pendant 24 heures. </li><li> Le lendemain, en commun les cellules ensemble et mélanger avec ruxolitinib et milieu contenant de l&#39;agar mou et étalées dans SIx plaques à puits. Pour chaque concentration de médicament, mélanger 10 ml de cellules BAF3 transduites (10-20 millions de cellules) avec la quantité appropriée de ruxolitinib dans un tube de 50 ml. Compléter le volume à 40 ml en utilisant RPMI contenant 20% de sérum. Ajouter 10 ml de gélose à 1,2% des cellules, et la plaque mixcarefully dans six plaques à puits. </li><li> Incuber les plaques à 37 ° C pendant deux semaines. Choisissez les colonies résistantes à l&#39;aide de 0,2 ml embouts de pipette et sous-culture individuellement dans 24 plaques à puits pour 3-4 jours. </li><li> Récolter les cellules BAF3 résistantes par centrifugation à 450 g pendant cinq minutes à la température ambiante. Isoler l&#39;ADN génomique en utilisant un kit d&#39;isolement d&#39;ADN génomique commercial. Amplifier par PCR pleine longueur JAK2 ADNc à partir de 100 ng d&#39;ADN génomique en utilisant des amorces (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG et mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) et à long-template élargir les systèmes de PCR haute fidélité. </li><li> Séparer les produits de PCR par électrophorèse sur gel d&#39;agarose. Exciser les 3,4 kb de bande d&#39;ADN représentant JAK2 trame de codage et d&#39;isoler l&#39;ADNen utilisant un kit d&#39;extraction de gel commercial. Séquence toute la longueur de l&#39;ADNc en utilisant des amorces internes 8 (P1 - P8) couvrant la séquence codante et analyser des séquences en utilisant un logiciel commercial. </li></ol> 4. Validation in vitro de mutations résistantes De nombreux clones de cellules portent plus d&#39;une mutation, Pour tester la contribution de chaque mutation dans phénotype de résistance, de générer des variantes sélectionnées par mutagenèse dirigée en utilisant pMSCV-JAK2V-617F plasmide comme matrice. <ol><li> Effectuer mutagenèse dirigée sur pMSCV-JAK2 V617F-plasmide en utilisant un kit et oligonucléotides conçus pour créer des mutations ponctuelles mutagenèse commerciale. Confirmer l&#39;identité des clones mutants par séquençage. </li><li> Transduction de cellules BAF3 avec rétrovirus fait en utilisant des plasmides mutants suivies avec sélection à l&#39;aide puromycine au 1 pg / ml. </li><li> Planche 10 4 cellules BAF3-JAK2 V617F (50-pi de RPMI avec 10% de FCS) dans chaque puits d&#39;une plaque de 96 puits. Séparély ajouter 50 ul du milieu de ruxolitinib contenant les puits à travers la plaque (concentration finale: 0, 1, 3, 5, 10 et 20 uM), et incuber les plaques pendant 60 heures à 37 ° C. </li><li> Évaluer la viabilité des cellules en ajoutant 10 pi de réactif WST-1 à chaque puits, suivi par une incubation à 37 ° C pendant 2-4 h. absorbance A450 record à l&#39;aide d&#39;un lecteur de plaque. Effectuer tous les essais en triple exemplaire et complot en moyenne absorbance contre INCB018424 concentrations. Effectuer une courbe sigmoïde meilleur ajustement en utilisant un algorithme d&#39;ajustement de courbe non linéaire. Note la concentration de médicament entraînant 50% de viabilité cellulaire comme la CI50 cellulaire. </li><li> Ensuite, la plaque BAF3 six millions de cellules exprimant des variantes de JAK2 dans six plaques à puits dans du milieu RPMI contenant 10% de sérum avec des concentrations croissantes de ruxolitinib et incubées pendant 4-6 heures à 37 ° C. </li><li> Recueillir les cellules par centrifugation à 450 g pendant cinq minutes à 4 ° C. Laver les cellules une fois avec du PBS, et lyse dans 20 mM de Tris-Cl (pH 7,5), 50mM de NaCl, 1% de NP-40, 0,1% de SDS, EDTA 5 mM, EGTA 1 mM, 1 mM de fluorure de sodium, le vanadate de sodium 2 mM, glycerol à 5% et complétée par des inhibiteurs de l&#39;inhibiteur de protease et de phosphatase de cocktail. Soniquer la suspension de cellules pendant 1 min suivie de l&#39;addition de 5x tampon de chargement de gel (350 mM Tris-HCl [pH 6,8], mM de DTT 500, 15% de SDS, mM benzamidine 10 mM, EDTA 5 mM, EGTA 5, 5 mM Sodium Vanadate , Protease cocktail, 50% de glycerol et 0,001% Bleu de bromophénol) et dénaturation à 70 ° C pendant 5 à 10 min. </li><li> Résoudre les protéines sur un gel à 8% de SDS-polyacrylamide dans des conditions dénaturantes. Effectuer immunoblot avec un anticorps monoclonal de souris anti-phopsho STAT5. Dépouiller les taches et sondé avec un anticorps anti-SATA5 polyclonaux de lapin. Visualiser les bandes en utilisant des réactifs ECL selon les recommandations du fournisseur. </li></ol> 5. Validation in vivo <ol><li> Transduction de cellules BaF3 exprimant la luciférase et de cerise (transduites avec rétrovirus fabriqués à partir de pMSCV-Luc-cherry GW) avec des virus exprimant JAK2 V617F-et variants résistants. Sélectionner les cellules qui survivent la sélection à la puromycine à l&#39;expression de JAK2 et ses variantes de résistance. </li><li> Injecter de deux millions en croissance active BAF3-Luc cellules / cerises portant JAK2 V617F-et ses variants résistants dans 200 pi de PBS à six souris Balb / C par injection de queue veineuse. </li><li> Après trois jours de la transplantation de cellules, injecter la souris avec ruxolitinib (100 mg / kg) deux fois par jour pendant deux semaines. </li><li> Effectuer bioluminescence imagerie à base de luciférase avec un système d&#39;imagerie. . <ol><li> En bref, préparer une solution de luciférine en dissolvant 300 mg à 25 ml d&#39;eau déminéralisée stérile, aliquote en plus petits volumes et magasin. REMARQUE: luciférine Conserver à -80 ° C et protéger de la lumière jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Injecter 250 ul à chaque souris par IP pour atteindre 125 mg / kg dans chaque souris. Anesthésier les souris de même groupe ensemble en utilisant l&#39;isoflurane inhalation (1,5% -2,0%) dans une boîte scellée. Appliquer vétérinaire onguent sur ee oeil à prévenir la sécheresse. NOTE: Le temps pris pour dormir souris (10-15 min) a permis activité luciférine à crête. Gardez le temps cohérente entre les groupes pour éviter variation. </li></ol></li><li> Transférer la souris immédiatement à l&#39;étape de la chambre de l&#39;imagerie et maintenir une anesthésie à 1,5-2% isofluorane pendant les procédures d&#39;imagerie. souris d&#39;image avec séquentielle de 0,1, 0,5, 1, 5, 30, 60 et 300 de l&#39;exposition sec. Capturez des images et quantifier l&#39;intensité de la bioluminescence en utilisant acquisition d&#39;image et logiciel d&#39;analyse. Après imagerie revenir les souris à sa cage. </li><li> Pour, in vivo récolte de chimérisme cellules bonemarrow totales. Euthanasier les souris avec du CO 2 pendant 5 min, puis à la dislocation cervicale. Récolter les os et écraser dans 4 ml de PBS froid pour recueillir la moelle osseuse. Analyser les cellules positives pour cent cerise microscope à fluorescence et de quantifier en utilisant FACS. Recueillir vingt mille événements de chaque échantillon. </li></ol>

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Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Le succès clinique de l&#39;imatinib dans le traitement de la LMC a démontré non seulement le potentiel de cibler les kinases de rouge par les inhibiteurs de petites molécules, mais également les limites à découvert de thérapie ciblée: rechute clinique et l&#39;émergence de mutations de résistance aux médicaments dans le gène cible. Identification de mutations de résistance contribue à une meilleure prise en charge clinique et le développement d&#39;inhibiteurs de la prochaine génération. Ce protocole décrit une méthodo...

Les protéines kinases sont des enzymes intracellulaires réglementaires clés de voies de transduction du signal qui modulent apparemment tous la fonction cellulaire. Un contrôle approprié de médiation par la kinase de signalisation est essentielle à l&#39;homéostasie et le développement, qui repose essentiellement sur une bonne régulation des kinases, des phosphatases et sa dégradation par UPS (système de protéasome ubiquitine). Kinases régulées sont au centre de la scène de nombreux cancers et l&#39;hôte impliqués dans des maladies humaines 1. Génome humain code pour plus de 500 protéines kinases qui ont été liés, directement ou indirectement, à ~ 400 maladies humaines 2. Ces observations ont appuyé le concept de ciblage thérapeutique de kinases par les inhibiteurs à petites molécules 5.3. La démonstration d&#39;inhibiteurs de la kinase ABL, tels que l&#39;imatinib dans le traitement de la leucémie myéloïde chronique (LMC) à condition que la preuve de concept de cette approche 6,7. Cette observation a non seulement révolutionné la fourmii-kinase thérapie mais aussi forcées l&#39;idée d&#39;identifier les lésions génétiques dans d&#39;autres maladies néoplasiques pour ciblage thérapeutique, qui conduisent à la découverte de mutations oncogéniques dans le JAK2 de polyglobulie de Vaquez (PV) et les patients avec des syndromes myéloprolifératifs (NPP). Cette découverte a suscité un grand intérêt dans le traitement MPN en ciblant JAK2 avec de petites molécules inhibiteurs de kinases. Maintenant, près d&#39;une douzaine d&#39;inhibiteurs de JAK2 sont dans les essais cliniques et l&#39;un d&#39;eux a été récemment approuvé pour le traitement de la myélofibrose. Bien que le ciblage spécifique de kinases oncogènes par des inhibiteurs à petites molécules dans les cancers apporter résultat prometteur, il souffre également de développer une résistance au traitement. En fait, jusqu&#39;à présent, les patients traités avec des inhibiteurs de kinase, tels que l&#39;imatinib, gefitinib, erlotinib et le dasatinib développées mutations de résistance principalement en acquérant des mutations dans le domaine kinase de médicament qui cible 10/8. Résistance à la suite de la mutation génique met en évidence les limitations of monothérapie contre les kinases oncogènes ciblé, et représente le prochain défi dans le développement de la chimiothérapie du cancer de plus en plus de succès. Conséquences mécanistiques et fonctionnelles de la résistance aux médicaments devraient fournir une justification pour la sélection et la conception de composés gratuits pour le développement de médicaments. Mutations identifiées via des écrans in vitro, ont montré un haut degré de corrélation avec celles trouvées chez les patients. Par conséquent, dépistage in vitro de mutations qui confèrent la résistance aux médicaments pendant donnés paires de cibles de médicaments dans passes de développement clinique ou préclinique à identifier les profils de résistance qui sont susceptibles de provoquer une rechute clinique. L&#39;identification de ces formes mutantes ne est pas seulement utile dans la surveillance des patients pour la réponse aux médicaments et à la rechute mais également essentiel pour la conception d&#39;inhibiteurs plus robustes de la prochaine génération. Par exemple, le développement de la prochaine génération des inhibiteurs BCR / ABL, nilotinib et Ponatinib, ont été rendus possibles en raison d&#39;une plus grande meccompréhensions hanistic gagné de mutagenèse, de structure, et des études fonctionnelles. Plus tôt, nous avons présenté les résultats de notre écran à l&#39;aide mutagenèse aléatoire de la BCR / ABL pour révéler le spectre des mutations conférant une résistance aux inhibiteurs comme l&#39;imatinib 11,12, 12 PD 166326 et AP24163 13. Les résultats non seulement identifié les mutations conférant une résistance et la maladie rechute clinique, mais aussi à condition que la compréhension des mécanismes de résistance et de principes régissant la fonction kinase 11,14 drogue. Ici, nous donnons des détails méthodologiques supplémentaires, en utilisant ruxolitinib et JAK2 comme une paire de cibles pharmaceutiques, afin de permettre une application plus large de cette stratégie de dépistage.

<table><tbody><tr><td>Culture cellulaire et tissulaire&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellules BaF3</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cellules</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW</td><td>Un don de Ross Levine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/Y931C. GW</td><td>Fabriqué en interne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F / L983F. GW</td><td>Fabriqué en interne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/P58A. GW</td><td>Fabriqué sur place</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-V617F-Cherry.GW</td><td>Fait maison</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW</td><td>Fabriqué sur place</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW</td><td>Fabriqué sur place</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-Luciferase-puro.GW</td><td>Fait maison</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Cellgro (corning)</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta biologique</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine EDTA 1X</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Cellgro (corning)</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco (technologies du vivant)</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de protamine</td><td>Sigma</td><td>P3369</td><td>5 mg/ml stock dans l’eau</td></tr><tr><td>Solution de bleu de trypan (0,4 %)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>INCB018424 (Ruxolitinib)</td><td>ChemieTeK</td><td>941678-49-5</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Roche</td><td>11644807001</td><td></td></tr><tr><td>0,45 micron filtre à disque</td><td>PALL</td><td>2016-10</td><td></td></tr><tr><td>70 microns filtre à cellules en nylon</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XL-1 E. coli cellules</td><td>Agilent Tech</td><td>200129</td><td></td></tr><tr><td>SOC</td><td>New England Biolabs</td><td>B90920s</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>100 mg/ml solution mère&nbsp ;</td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>Difco</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>Terrific broth</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Genemate</td><td>E-3119-500</td><td></td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Blood& tissue kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Expand long template PCR system</td><td>Roche</td><td>1168134001</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Système de nettoyage Sv gel et PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Système de mini-préparation de plasmide Pure Yield</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>Système de clonage PCR avec technologie Gateway avec pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells</td><td>Invitrogen</td><td>12535029</td><td></td></tr><tr><td>Gateway&nbsp ; Mélange d’enzymes clonases LR&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>11791019</td><td></td></tr><tr><td>Réactifs</td><td></td><td></td><td></td>pour souris</tr><tr><td>Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade</td><td>Promega</td><td>P1043</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc Lo-Dose u-100 seringue à insuline 28 G1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Mortor pestle</td><td>Coor tek&nbsp ;</td><td>60316 et 60317</td><td></td></tr><tr><td>Isoflorane (Isothesia TM)</td><td>Butler Schien</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NAPCO series 8000 WJ Incubateur CO2</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse à rotor à godets oscillants 5810R</td> Compteur de cellules <td>automatisé Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-10</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td>Ce n’est pas nécessaire, on peut utiliser l’hémocytomètre standard pour le comptage des cellules</td></tr></tbody></table>

un procédé de criblage et de validation des mutations de résistance aux inhibiteurs de kinase

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

La découverte de BCR / ABL comme un oncogène du pilote dans la leucémie myéloïde chronique (LMC) ont abouti à l&#39;élaboration d&#39;Imatinib, ce qui, en fait, a démontré le potentiel de cibler la kinase dans les cancers en traitant efficacement les patients atteints de LMC. Cette observation a révolutionné le développement de médicaments afin de cibler les kinases oncogènes impliqués dans diverses autres tumeurs malignes, telles que, EGFR, B-RAF, KIT et PDGFR. Cependant, un inconvénient majeur des thérapies anti-kinase est l&#39;émergence de mutations de résistance aux médicaments rendant la cible pour avoir réduit ou perdu affinité pour le médicament. Comprendre les mécanismes employés par variants résistants non seulement aide à développer les inhibiteurs de la prochaine génération, mais donne aussi une impulsion à la gestion clinique utilisant la médecine personnalisée. Nous avons signalé une stratégie rétroviral de vecteur à base de dépistage pour identifier le spectre de résistance conférant mutations dans BCR / ABL, qui a aidé à développer la prochaine génération BCR / ABL inhibiteurs. Utilisation Ruxolitinib et JAK2 comme une paire de cibles pharmaceutiques, ici nous décrivent des méthodes de dépistage in vitro qui utilise les cellules BaF3 de la souris exprimant la bibliothèque de mutation aléatoire de kinase JAK2.

Émergence de mutations génétiques pose grand défi pour la thérapie de kinase lutte ciblée. Des études mutationnelles, en plus de fournir un aperçu mécanistes et fonctionnelles qui jouent un rôle dans la sélection et la conception de développement de médicaments de nouvelle génération, permet également une meilleure prise en charge clinique et peuvent à l'avenir être plus utile pour le traitement personnalisé. Dans cette expérience, nous montrons le dépistage de mutations de résistance à ruxolitinib JAK2 V617F-kinase <st...

Emergence de la résistance génétique contre la thérapie d&#39;inhibiteur de kinase pose défi important pour la thérapie efficace contre le cancer. Identification et caractérisation des mutations de résistance contre un médicament nouvellement développé contribue à une meilleure gestion clinique et la conception de médicaments de la prochaine génération. Ici, nous décrivons notre protocole pour le dépistage in vitro et la validation de mutations résistantes.

Un procédé de criblage et de validation des mutations de résistance aux inhibiteurs de kinase

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

L’objectif global de cette procédure est d’identifier et de valider les mutations résistantes aux médicaments. Pour ce faire, il faut d’abord créer une bibliothèque de mutations aléatoires de l’oncogène ciblé. La deuxième étape consiste à réaliser un criblage in vitro pour l’émergence de clones résistants.La troisième étape de la procédure consiste à séquencer les clones résistants pour identifier les mutations résistantes. La dernière étape consiste à valider les mutations résistantes en recréant les mutations à l’aide de la mutagenèse dirigée, suivie d’essais in vitro et in vivo. En fin de compte, des mutations cliniquement pertinentes de résistance aux médicaments peuvent être identifiées contre une paire de cibles médicamenteuses donnée.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’ENU ou les méthodes basées sur la PCR est qu’elle est impartiale et, contrairement à METAGENE ssis basée sur la PCR, celle-ci n’est pas limitée à la taille de l’oncogène ou au contenu en GC d’un gène. En général, ceux qui débutent dans cette technique auront du mal en raison d’un manque de connaissances en biologie moléculaire et cellulaire. La démonstratio

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Kinase Leucine Rich Repeat 2 est une kinase multidomaine grandes, les mutations dans lesquelles sont la cause génétique la plus courante de la maladie de Parkinson. Analyse de l'activité kinase de cette protéine s'est révélée être un outil crucial dans la compréhension de la biologie et le dysfonctionnement de cette protéine. Dans ce...

Dosage de l&#39;activité kinase de LRRK2 In vitro</em

La résistance aux médicaments à thérapies ciblées est très répandue et la nécessité d'identifier les mécanismes de résistance - avant ou après l'apparition des symptômes - est essentiel pour guider les stratégies alternatives de gestion clinique. Ici, nous présentons un protocole de coupler dérivation de lignées résistantes aux médicaments in vitro avec le séquençage d'accélérer la découverte de ces mécanismes.

Implémentation de<em&gt; In Vitro</em&gt; Résistance au médicament Essais: Maximiser le potentiel pour découvrir cliniquement importants mécanismes de résistance

La phosphorylation des protéines est une caractéristique centrale de la façon dont les cellules interprètent et répondent à l’information dans leur milieu extracellulaire. Ici, nous présentons un protocole de criblage à haut débit utilisant des kinases purifiées à partir de cellules de mammifères pour identifier rapidement les kinases qui phosphorylent un ou plusieurs substrats d’intérêt.

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Test de compétition Oligopeptide pour la détermination du site de phosphorylation

Nous présentons ici un protocole pour les alignements d’anticorps identifier les altérations dans les voies de signalisation dans divers modèles cellulaires. Ces changements, causées par les médicaments/hypoxie/ultra-ultra-violet lumière/rayonnement, ou par surexpression/régulation/débouchures, sont importants pour les différents modèles de la maladie et peuvent indiquer si une thérapie sera efficace ou peut identifier des mécanismes de médicaments résistance.

Évaluation de la résistance aux inhibiteurs de Tyrosine Kinase par un interrogatoire des voies de Transduction de Signal par les alignements d’anticorps

Nous décrivons ici les protocoles de validation chimique et génétique de c-Fos et Dusp1 comme cible de drogue dans la leucémie à l’aide de modèles de souris in vitro et in vivo de génétique et humanisé. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quelle cible pour la validation génétique et développement thérapeutique.

Méthodes permettant d’évaluer le rôle de c-Fos et Dusp1 dans la dépendance de l’oncogène

Cet article utilise un écoulement cytometry-test aux bibliothèques d’écran d’inhibiteurs chimiques pour l’identification des inhibiteurs et leurs objectifs qui influent sur la signalisation de récepteur de T-cellule. Les méthodes décrites ici peuvent aussi être étendues pour des projections de haut débit.

Identification des médiateurs du récepteur des cellules T signalisation via la projection des bibliothèques inhibiteur chimique

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Criblages knockout à l’échelle de l’épigénome basés sur CRISPR-Cas9 sur des cellules chimiorésistantes

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