Name: Isolement et culture de dissocié neurones sensoriels De embryons de poulet (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Apprenez à isoler et cultiver des neurones sensoriels dissociés d'embryons de poulet. Cette méthode rapide et fiable permet d'étudier la biologie cellulaire neuronale et la dynamique des cônes de croissance en environnement contrôlé.

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Nous tenons à remercier Alison Philbrook, Belinda Barbagallo et Michael Francis des commentaires perspicaces sur ce document. Recherche présentée dans cette publication a été soutenue par une bourse ZONE R15 1R15NS070172-01A1 attribué à MLL.

1 lamelle Préparation: Laver acide et Cuire <ol><li> Au moins 2 jours avant la dissection (étape 2), commencer les étapes suivantes pour préparer lamelles. Effectuer l&#39;étape de lavage à l&#39;acide pour éliminer les huiles et les lamelles de nettoyer à fond. </li><li> lamelles de charge en support de porcelaine qui positionne verticalement lamelles et les empêche de toucher l&#39;autre. Immerger support et des lamelles dans un récipient d&#39;histologie de verre rempli d&#39;acide chlorhydrique 2 M (HCl). Alternativement, si titulaire de porcelaine n&#39;est pas disponible, répartis ~ 20 lamelles horizontalement pour couvrir le fond de 100 mm verre boîte de Petri et plonger des lamelles dans du HCl 2 M. </li><li> Placez récipient en verre (avec des lamelles immergées dans de l&#39;acide) sur la table à bascule dans une hotte et permettre doux balancement pendant au moins 5 heures à température ambiante. Sinon, lavage à l&#39;acide lamelles de nuit dans les mêmes conditions. </li><li> Laver les lamelles couvre-objet avec H 2 O distillée (dH 2 O) par le transfert de porte-charge porcelaineavec des lamelles de HCl 2 M dans un récipient en verre propre de l&#39;histologie rempli avec dH 2 O. Sinon, décanter HCl 2 M de verre boîte de Pétri avec des lamelles et remplir avec dH 2 O. </li><li> Laver par décantation dH2Û nouveau et le remplissage récipient en verre avec dH frais 2 O. Répétez l&#39;opération pour un total de 3 lavages rapides. </li><li> Commencer plus laver régime en retournant récipient en verre (avec des lamelles et dH 2 O) sur la bascule. Permettre agitation douce pendant 10-30 min à température ambiante. Ensuite, décanter dH2Û et ajouter dH frais 2 O. Répétez l&#39;opération pour un total d&#39;au moins dix lavages. Sinon, continuer le lavage pendant la nuit. </li><li> Placez les lamelles dans le four préchauffé lavés à 350 ° C. Si vous utilisez titulaire de porcelaine, retirer le support de dH 2 récipient en verre O-rempli et puis placez support avec des lamelles directement dans le four. Si vous utilisez une boîte de Pétri en verre, décanter dH2Û et placer le plat en verre avec des lamelles dans le furnace. </li><li> Cuire les lamelles pendant au moins cinq heures ou toute la nuit à 350 ° C. </li><li> Après la cuisson est terminée, retirez les lamelles de porte en porcelaine avec des pinces fines et placez-le dans le verre 100 mm boîte de Petri stérile. Laissez lamelles qui n&#39;avaient pas été placés dans le support de porcelaine dans le verre boîte de Pétri. </li></ol> 2. Chick Dissection et isolement des DRG <ol><li> Retirer fertile, mise en scène White Leghorn poussin oeuf de l&#39;incubateur (tenue à 37 à 38,5 ° C avec doux balancement). REMARQUE: Des études antérieures ont utilisé jour embryonnaire 7-10 pour l&#39;isolement des DRG 2,8,11-13,16. </li><li> Placez l&#39;oeuf sélectionné dans une hotte à flux laminaire. Effectuer toutes les procédures indiquées ci-dessous dans des conditions aseptiques dans la hotte à flux laminaire avec des solutions et des instruments stériles. Préchauffer toutes les solutions dans un bain-marie à 37 °. </li><li> Crack œufs et placez le contenu dans une boîte de 100 mm de Petri en plastique. Utilisez une pince standard pour transférer l&#39;embryon à un autre de 100 mm boîte de Petri. </li><li&gt; aide d&#39;une pipette Pasteur, ajouter réchauffé PBS 1x boite de Pétri pour maintenir le tissu humide. Décapiter l&#39;embryon en pinçant le cou avec une pince fine. Transfert à un autre corps de 100 mm boîte de Petri propre. </li><li> Ajouter F12HS10 chaud (F12 de Ham, 10 mM d&#39;HEPES, 100 unités / ml de pénicilline, 0,1 mg ml de streptomycine, de sérum / 10% de veau foetal) à plat avec pipette Pasteur à garder tissu humide. Utiliser des pinces pour positionner embryon sur sa face dorsale (Figure 1A). </li><li> Placez 100 mm en plastique boîte de Pétri contenant du tissu embryonnaire sur un microscope binoculaire stéréoscopique de dissection dans une hotte à flux laminaire. Utilisez une pince fine à faire une incision verticale médiane de la queue à col en pinçant le derme de développement à exposer le coeur, les poumons et d&#39;autres organes. Sinon, faire une série de petites larmes pour exposer les organes internes. </li><li> Utilisent doucement 2 jeux de pinces fines stériles à: a) saisir le cou et b) saisir l&#39;aorte ou d&#39;autres tissus immédiatement supérieure à cœur et tirez vers la queue,éviscération de l&#39;animal. </li><li> Appliquer F12HS10 chaud avec pipette Pasteur pour les tissus. Utilisez une pince pour enlever les cardiovasculaires, les organes respiratoires ou digestifs restant à exposer les côtes en développement, la colonne vertébrale et les DRG (figures 1B-1D). </li><li> Sous le microscope de dissection, utiliser une pince fine pour éliminer davantage les organes et recueillir des DRG long des deux côtés de la colonne vertébrale lombaire, inférieur aux côtes. Recueillir DRG en pinçant DRG intactes de l&#39;embryon. Pincez et couper les racines qui s&#39;étendent du DRG vers la moelle épinière et le nerf de préhension en développement qui s&#39;étend de la DRG vers la périphérie ou vice versa. </li><li> Placez DRG intactes dans une boîte de culture de 35 mm rempli de F12HS10 chaud. Retirez tout excès de tissu, comme la dorsale ou ventrale racines qui peuvent avoir adhéré à DRG, des DRG intactes en boîte de 35 mm en pinçant avec une pince fine. </li><li> Pour obtenir des DRG supérieures à la région lombaire, retirez la moitié ventrale du thorax et cervical colonne vertébrale. Ceci est réalisé en effectuant une coupe dans la colonne vertébrale développement perpendiculaire à l&#39;axe de la colonne vertébrale dans la région cervicale supérieure et une autre coupe dans la région lombaire supérieure. Ensuite, faire des coupes parallèles à l&#39;axe de la moelle épinière le long de la côté gauche de la colonne vertébrale et de droite. Soulevez la moitié ventrale de la colonne vertébrale de l&#39;embryon, ce qui expose les expose la moelle épinière (figures 1E-1F). </li><li> Pour permettre un accès facile à DRG, retirer la moelle épinière thoracique et cervicale en saisissant la moelle épinière avec des pinces fines. Utilisez la pince pour soulever la moelle épinière de la colonne vertébrale. En première approximation, la moelle épinière thoracique se situe au niveau des nervures et de la zone du col est supérieure à celle des nervures. </li><li> Recueillir thoracique intact et DRG col de l&#39;utérus avec une pince fine et les placer dans F12HS10 chaud avec d&#39;autres DRG. Retirer l&#39;excès de tissu qui peuvent adhérer à DRG. </li><li> Rincer l&#39;intérieur d&#39;une nouvelle pipette Pasteur en verre avec F12HS10 pour aiderempêcher GHM de coller aux parois de la pipette. Utilisez pipette rincée à transférer tous les DRG et F12HS10 de petite boîte de Petri à un tube de 15 ml conique stérile et procéder immédiatement à l&#39;étape 3. NOTE: Plus d&#39;embryons peuvent être disséquées pour augmenter le nombre de DRG. DRG doivent être conservés dans F12HS10 à 37 ° C avant d&#39;être prêt pour l&#39;étape 3. </li></ol> 3. dissociation, enrichissante, et culture des neurones DRG - Partie 1 <ol><li> Placer le tube conique avec GHM intactes dans la centrifugeuse et doucement tourner (200 xg) pendant 2-3 min. Vérifiez que les DRG ont coulé au fond du tube. Sinon, tourner à nouveau. </li><li> Avec une pipette, enlever délicatement F12HS10, laissant DRG pastille intacte. Ajouter 2 ml de 1x calcium et de magnésium libre (CMF) PBS, déloger le culot de DRG. Spin et la retirer CMF PBS tout en laissant le culot de DRG intact. Répétez cette étape de lavage pour un total de trois lavages pour éliminer le sérum de veau fœtal dans F12HS10, qui pourrait interférer avec digestion par la trypsine à l&#39;étape suivante. </li><li> Ajouter 2 ml de trypsine réchauffé à tube de 15 ml contenant 2 ml de PBS et CMF DRG. Placer le tube dans 37 ° C bain d&#39;eau pendant 10-15 min à digérer DRG dans les cellules dissociées. </li><li> Pendant l&#39;incubation, faire F12H + supplément contenant médias (F12 de Ham, 10 mM HEPES 100 unités / ml de pénicilline, 0,1 mg / ml de streptomycine, 10 ng / ml NT3, 10 ng / ml de NGF, 200 mM de L-glutamine et N2) et chaud 37 ° C dans un bain d&#39;eau. Typiquement, 10 ml de milieu totale est suffisante pour 4-5 plats de 35 mm de neurones sensoriels primaires. Aussi commencer la décongélation de la laminine-1 pour les lamelles de revêtement (étape 4). </li><li> DRG doucement triturer dans une solution de trypsine avec p1000 pipette et inspecter visuellement de l&#39;absence de DRG intactes. Continuer jusqu&#39;à ce que la trituration DRG intactes ne sont plus considérés par les yeux et / ou permettre plus trypsine incubation dans 37 ° C bain d&#39;eau jusqu&#39;à ce que DRG intactes sont dissociés. Pour protéger les neurones de DRG de dommages, éviter les bulles d&#39;air lors de trituration et de limiter digestion par la trypsine à &lt;30 min. </li><li> CentrifugTube électronique contenant DRG dissociés et de la trypsine à 200 xg pendant 3 à 5 min pour former des pellets. Spin plus si nécessaire jusqu&#39;à ce culot est formé. </li><li> Aspirer soigneusement la trypsine sans perturber culot. Ajouter 2 ml de F12HS10 à sédimenter. Triturer doucement DRG avec une pointe de pipette P1000. </li><li> Transférer tous les contenus du tube de 15 ml conique dans 100 boîte de culture mm. Rincer le tube avec 8 ml F12HS10 et le transférer à la boîte de culture, de 2 ml à la fois pour un total de 10 ml. Cette étape de rinçage permet de recueillir les cellules qui auraient pu rester adhéré aux parois du tube. </li><li> Passer boîte de culture de 100 mm (10 ml F12HS10 et les cellules dissociées dans un DRG) humidifié à 37 ° C pendant 3 heures incubateur. REMARQUE: CO 2 n&#39;est pas nécessaire dans l&#39;incubateur parce HEPES tampons pH du substrat en l&#39;absence de CO 2. Pendant l&#39;incubation, les cellules gliales se lient à la surface du tissu plastique de la culture et les neurones ont tendance à adhérer de façon lâche au lit gliales. </li></ol> 4. Acid Washed revêtementLamelles et au four avec la laminine-1 <ol><li> Décongeler aliquotes stériles de la laminine-1 congelés sur glace. </li><li> Dans des conditions stériles, ajouter 1 ml de PBS stérile 1x 50 aliquote ul de la laminine-1. </li><li> Utilisation d&#39;un spectrophotomètre pour obtenir une valeur d&#39;absorbance de la laminine-1 à 280 nm. Utiliser cette valeur dans l&#39;équation suivante pour déterminer la concentration de la laminine-1. </li></ol> ABS = 280 (concentration mg / ml) * (coefficient d&#39;extinction de la protéine) Le coefficient d&#39;extinction pour la laminine-1 est de 0,86. <ol start="4"><li> Dans des conditions stériles, la laminine-1 dilué avec du PBS 1X à obtenir des concentrations de 1 mg / ml et 20 mg / ml. Utiliser ces deux concentrations appliquées de la laminine-1 pour obtenir une différence de dix fois de la laminine-1 lié à la lamelle couvre-objet (30 ng / cm 2 et 300 ng / cm 2, respectivement) après incubation 7,8,10. </li><li> Dans une hotte à flux laminaire, utilisez une pince fine à placer un lavé à l&#39;acide et au four coverslip dans le fond d&#39;une boîte de culture de 35 mm. Répéter au besoin pour obtenir le nombre de plats nécessaires. </li><li> Soumettre les lamelles couvre-objet à la lumière UV pendant 20 à 30 min de plus à assurer la stérilisation. Gardez le couvercle plat hors tension pendant cette étape. </li><li> Ajouter 400 ul de prêt laminine-1 à chaque lamelle de verre. Utilisez pointe de la pipette pour répandre la laminine-1 afin d&#39;assurer une couverture complète de la lamelle. La tension de surface permettra laminine-1 de rester sur la lamelle et ne se propage pas sur le fond du plat de la culture, qui est nécessaire. </li><li> Placer le couvercle sur plat et laissez la laminine-1 à incuber pendant 2-3 heures à température ambiante (3 heures est optimal). </li><li> Après la laminine-1 incubation, rincer les lamelles à l&#39;aide de la technique aseptique avec du PBS stérile en hotte à flux laminaire. Retirer solution sur lamelle et ajouter 400 ul de PBS. Attendez 5-10 min. Répétez l&#39;opération pour un total de 3 rinçages. </li><li> Laissez PBS sur lamelle après le dernier rinçage. Ne pas briser la tension de surface pendant le rinçage et ne permettent pas de lamelles de sécher. Lecouvercle ave jusqu&#39;à prêt à plaque neurones dissociés sur le coverlip. </li></ol> 5. dissociation, enrichissante, et culture des neurones DRG - Partie 2 <ol><li> Après incubation, utiliser une pipette stérile de 10 ml à rincer doucement le fond du plat de 100 mm contenant des cellules DRG dissociés. Tenez plat à ~ 45 °, tirez ~ 7 ml de F12HS10 avec l&#39;aide de la pipette, puis expulser doucement 7 ml sur environ 1/3 de plat. Répéter 5x, délogeant délicatement neurones. </li><li> Tournez plat et répéter le rinçage procédure, pour six rinçages, sur un autre tiers de l&#39;assiette. Répéter l&#39;opération à nouveau pour rester tiers de plat. De cette façon, les rincer doucement tout le fond du plat avec F12HS10 pour enlever les neurones. </li><li> Utilisant même pipette, transférer neurones F12HS10 contenant de 100 mm plat à 15 tube conique. Centrifuger pendant 5-10 min à 200 g pour sédimenter les cellules. </li><li> Retirer F12HS10, laissant pastille intacte. Remettre le culot avec 2 ml de F12H réchauffé + suppléments. </li><li&gt; Utilisez un hématimètre pour déterminer la densité cellulaire. </li><li> Diluer les cellules que nécessaire avec F12H + suppléments pour obtenir la concentration de placage souhaitée (120 000 cellules / ml pour des lamelles revêtues d&#39;/ ml de cellules 1 ug de la laminine-1 et 40 000 / ml pour des lamelles revêtues avec 20 ug / ml de laminine-1 8,16). </li><li> Retirer PBS à partir des lamelles de laminine-enduit et placer immédiatement 400 pi de cellules sur des lamelles. Soigneusement transférer à un plat humidifié, 37 ° C culture cellulaire incubateur. Laisser incuber pendant au moins une heure et jusqu&#39;à 3 heures pour permettre à des neurones à adhérer à la laminine-1. </li><li> Dans des conditions stériles, inonder doucement 35 mm plats neurones contenant 1,6 ml de F12H + suppléments. NOTE: A ce moment, la tension de surface sur la lamelle peut être rompu. Les neurones ont bien adhéré à la laminine-1 sur la lamelle. </li><li> Retour cellules dans l&#39;incubateur et incuber pendant la nuit. Réaliser des expériences telles que immunocytochimie le lendemain. </li></ol> 6. jemmunocytochemistry <ol><li> Avant l&#39;immunocytochimie, solution de fixation à chaud (4% de paraformaldéhyde, 30% de saccharose 2X PBS) à 37 ° C bain d&#39;eau. REMARQUE: Avant de cellules de fixation, traiter avec divers réactifs, tels que la nétrine-1, Mn 2 +, sonic hedgehog, sémaphorine, et ephrin 16,29-31. </li><li> Retirer lentement 1 ml de 2 ml de F12H + suppléments de boîte de culture. Incorporer délicatement 1 ml de solution de fixation réchauffé. Laisser incuber à température ambiante pendant 10 à 15 min. </li><li> Retirez délicatement solution de fixation et ajouter 2 ml de PBS. Appliquer la solution vers le bord du plat, en évitant possible délogement des cellules fixes en raison de l&#39;application de PBS. Incuber à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Répétez PBS lavage pour un total de 5 lavages. Ne laissez pas les cellules à sécher pendant une étape de immunocytochimie. </li><li> Retirer du PBS. Appliquer 1 ml de solution de blocage (0,1% de Triton-X, 1X PBS, 5% de sérum de chèvre normal). Incuber pendant 1 heure à température ambiante. Sinon, pour tacher molécules de surface, Ne pas utiliser de Triton-X dans une solution de blocage 8. </li><li> Diluer anticorps primaires dans une solution de blocage par la recommandation de la fabrication. Utilisez 1: 500 pour les anticorps contre NCAM et activé β1 intégrines 16. Retirer la solution de blocage, ajouter 1 ml de solution d&#39;anticorps primaire et incuber pendant 1 heure à température ambiante ou une nuit à 4 ° C. </li><li> Retirer solution d&#39;anticorps primaire et ajouter 2 ml de PBS 1X. Incuber pendant 5 à 10 min à température ambiante. Répétez l&#39;opération pour un total de 4 lavages PBS. Lavages peuvent être prolongés, si nécessaire. </li><li> Diluer l&#39;anticorps secondaire 1: 1000 dans une solution de blocage. Retirer PBS, ajouter 1 ml de solution d&#39;anticorps secondaire et incuber pendant 1 heure à température ambiante. REMARQUE: Les anticorps secondaires sont sensibles à la lumière. Conserver les solutions et les cellules dans l&#39;obscurité autant que possible de ce point en avant. </li><li> Retirer la solution d&#39;anticorps secondaire et rincer 5x avec PBS 1x, comme précédemment. </li><li> Appliquer ~ 60-80 ul de FluoromountG sur une lame de microscope. En utilisant des pinces fines, soulevez doucement la lamelle sur plat et lamelle inférieure dans Fluoromount G sur lame de microscope. Éviter les bulles d&#39;air. </li><li> Magasin glisse horizontalement à 4 ° C dans l&#39;obscurité. Après 12-24 heures, Fluormount G va polymériser et lamelle sera fermement attaché à lame de microscope. des cellules de l&#39;image issue de cette étape de polymérisation est terminée. </li></ol>

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<li>Condic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neuronal+regeneration+induced+by+transgenic+integrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression.</a> Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).</li>
<li>Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin+3+supports+the+survival+of+developing+muscle+sensory+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).</li>
<li>Toyofuku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FARP2+triggers+signals+for+Sema3A-mediated+axonal+repulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion.</a> Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).</li>
<li>Steinmetz, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+enhancement+of+the+intrinsic+growth+capacity+of+sensory+neurons+combined+with+the+degradation+of+inhibitory+proteoglycans+allows+functional+regeneration+of+sensory+axons+through+the+dorsal+root+entry+zone+in+the+mammalian+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

Nous présentons ici des protocoles détaillés pour l&#39;isolement et la culture dissociés neurones sensoriels d&#39;un embryon de poulet. Cette procédure génère une population enrichie de neurones croissance robuste in vitro 7,8,10,16. De nombreuses techniques moléculaires et cellulaires peuvent être appliqués à ces neurones en culture, y compris l&#39;immunocytochimie, qui est décrit ici. Ce protocole a été récemment utilisée pour évaluer quantitativement l&#39;intensité des intégrines activées immu...

Les neurones sont des cellules complexes qui transportent l&#39;information essentielle pour une variété de fonctions, y compris la sensation, la vision, le mouvement du moteur, l&#39;apprentissage et la mémoire. Unique à partir d&#39;autres types cellulaires, les neurones de bras s&#39;étendent processus analogue, appelés axones, pour former des autoroutes neuronaux essentiels pour la communication. Au cours de compartiments de développement spécialisée situés à l&#39;extrémité des axones en croissance, appelé les cônes de croissance, naviguer à travers un concert de signaux extracellulaires de mener l&#39;axone à sa destination appropriée. Les mécanismes moléculaires complexes qui sous-tendent cône navigation de croissance ne sont pas pleinement compris. Pour mieux comprendre ces mécanismes, les chercheurs ont utilisé des modèles de culture cellulaire pour étudier les neurones dans un environnement défini vitro et simplifiée. Etudier les neurones en culture 1 a permis des avancées significatives dans notre compréhension de la biologie des cellules neuronales, y compris: la différenciation neuronale 2, la dynamique du cytosquelette, l&#39;endocytose et le trafic, dendritesla réglementation 3,4, la régénération axonale 5, et les conditions cliniques telles que les neuropathies 6. En outre, des neurones en culture sont prêtent très bien à une large gamme de techniques de recherche, y compris immunocytochimie, la surface des cellules co-immunoprécipitation, Western blot, la transfection, l&#39;ARNi et imagerie en temps réel telles que l&#39;analyse de timelapse de la motilité du cône de croissance. Ainsi, la culture de neurones primaires est une approche puissante pour élucider de nombreux aspects de la biologie cellulaire des neurones. Le modèle de culture cellulaire fournit aux enquêteurs avec un contrôle détaillé sur les conditions environnementales et les variables. Par exemple, le substrat sur lequel les neurones sont étalées (et poussent sur) peut être facilement manipulé. Ici, nous fournissons des instructions détaillées pour produire deux substrats distincts, l&#39;un avec une faible concentration de la laminine-1 et l&#39;autre avec des concentrations saturantes de la laminine-1. De façon surprenante, des concentrations différentes de la même molécule peuvent avoir des effets dramatiquessur l&#39;état interne de neurones ainsi que leur composition de la surface cellulaire. Par exemple, les taux intracellulaires d&#39;AMPc et de surface niveaux de intégrines sont significativement différents dans les neurones étalées sur ces deux substrats 7,8. D&#39;autres études ont montré que d&#39;autres molécules, y compris la fibronectine et des protéoglycanes chondroïtine sulfate, l&#39;impact de l&#39;expression de molécules de surface cellulaire et la motilité des neurones 7-11. En outre, les molécules solubles tels que les neurotrophines et aussi l&#39;impact neurotropins composition de la membrane cellulaire et la motilité des neurones et de 12 à 16 peuvent être manipulés facilement et avec précision dans un modèle de culture cellulaire. Ici, nous décrivons les méthodes pour isoler et culture dissociés neurones sensoriels à partir d&#39;embryons de poulet. Cette procédure a été utilisée pour faire des percées significatives dans la neurobiologie, y compris la croissance axonale 5,7,8,10,11,16-21 et a été modifié à partir d&#39;une procédure visant à isoler les cellules ganglionnaires de la 22. Il y aplusieurs avantages à cette approche. Tout d&#39;abord, de nombreuses fonctionnalités de poussin ganglion de la racine dorsale (DRG) le développement sont bien caractérisés, y compris le délai de naissance, l&#39;extension de l&#39;axone, et les profils d&#39;expression de la protéine 2,23-28, fournissant ainsi une base instructive sur laquelle construire informative des expériences in vitro. Ensuite, les cultures neuronales dissociées permettent le chercheur d&#39;étudier plus directement les neurones par rapport à d&#39;autres approches utilisant des explants de DRG intacts (qui contiennent des neurones et des cellules non-neuronales) et / ou des cultures mixtes contenant à la fois des neurones dissociés et les cellules non-neuronales. Troisièmement, la procédure décrite ici est simple, peu coûteux et se prêtent à de premier cycle. Par conséquent, cette technique peut être utilisée pour la recherche ainsi qu&#39;à des fins d&#39;enseignement. En outre, des variations mineures de ce protocole devraient permettre rapide, à haut rendement purification des neurones à partir de sources autres que les DRG. Par exemple, cette procédure peut être modifiée pour fournir neuronale enriched cultures provenant d&#39;autres tissus tels que le cerveau antérieur ou de la moelle épinière embryonnaire. protocoles de immunocytochimie ont été optimisés pour ces cultures neuronales dissociées et sont décrits en détail ici. La procédure de double-immunocytochimie contre neural molécule d&#39;adhésion cellulaire (NCAM) et β1 des intégrines est fourni. Les données produites par ces méthodes immunocytochimiques ont été utilisées pour examiner la structuration spatiale et d&#39;intensité de plusieurs molécules dans des neurones en culture 8,16.

<table><tbody><tr><td>Petites boîtes de culture stériles (35 mm)</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Grandes boîtes de culture stériles (100 mm)</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Grandes boîtes de Pétri stériles (100 mm)</td><td>VWR</td><td>89000-302</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri en verre (100 mm)</td><td>VWR</td><td>D108962</td><td></td></tr><tr><td>Pince fine</td><td>Outils de science fine</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Pince standard</td><td>Outils de science fine</td><td>1100-12</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles (22 x 22 mm)</td><td>Fisher</td><td>12 518 105K</td><td>0,13-0,17 mm L’épaisseur est optimale pour la microscopie</td></tr><tr><td>Porte-lamelles Porcelin</td><td>Thomas scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>utiliser 50 ml d’aliquotes pour 500 ml de milieu F12</td></tr><tr><td>de Ham HCl VWR</td><td></td><td>VWR VW3204-1</td><td>utiliser à 2 M, peut être utilisé deux fois avant de jeter</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>utiliser 5 M de solution NaCl pour la solution mère de laminine-1</td></tr><tr><td>Laminin-1</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>Ajouter 72 &micro ; l de NaCl 5 M stérile et aliquote en 50 & micro ; l</td></tr><tr><td>15 ml Traitement à cellules tubulaires coniques</td><td></td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>PBS CMF 10x</td><td>Gibco</td><td>14200</td><td>utilisé à 1x, diluer avec de l’eau filtrée stérile Millipore</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Gibco</td><td>14080</td><td>utilisé à 1x, diluer avec de l’eau filtrée stérile Millipore</td></tr><tr><td>Ham’s F12</td><td>Lonza</td><td>12-615F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum Albumin (BSA)</td><td>Gibco</td><td>10438</td><td>utilisation en F12HS20 à 10</td></tr> %<tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>faire stérile 1 M solution dans de l’eau distillée, diluer dans un milieu F12 pour obtenir une concentration finale de 10 mM</td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomyocine</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>utiliser 5 ml dans 500 ml de milieu F12</td></tr><tr><td>NT3</td><td>Millipore</td><td>GF031</td><td>Ajouter 1 ml d’eau Millipore stérile, aliquote dans des conditions stériles, conserver à -20 &deg ; C, utiliser à la concentration finale de 10 ng/ml dans un milieu F12H, maintenir à -20 &deg ; C congélateur non dégivrant</td></tr><tr><td>NGF</td><td>RnD</td><td>systems 256-GF</td><td>Ajouter 1 ml de 1x PBS stérile avec 0,1 % BSA, aliquote dans des conditions stériles, conserver à -20 &deg ; C, utilisé à une concentration finale de 10 ng/ml dans le milieu F12H</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>aliquote dans des conditions stériles, conserver à -20 &deg ; C, utiliser à une concentration finale de 200 mM dans un milieu F12H</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>aliquote dans des conditions stériles, conserver à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Gibco</td><td>15260</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Autres articles nécessaires : instruments de dissection générale, y compris pipettes Pasteur en verre, œufs de poule Leghorn blancs fertiles, incubateur d’œufs (humidifié, 37 &deg ; C), chambre d’incubation cellulaire (humidifiée, 37 &deg ; C), hotte à flux laminaire, lunette de dissection par stéréovision binoculaire</td></tr><td colspan="4">Immunocytochemistry Reagents TableSucrose Sigma S9378 utilisé en solution fixatrice (4 % de paraformaldéhye, 30 % de saccharose, 2x PBS)Triton-X 100 Sigma T-8787 Paraformaldéhyde Sigma P6148 utilisé en solution fixatrice (4 % de paraformaldéhye, 30 %<tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> saccharose, 2x PBS)</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Life technologies</td><td>PCN500</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>VWR</td><td>16004-430<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Primary Antibody Table</td></tr><tr><td>Antibody against NCAM</td><td>Millipore</td><td>AB5032</td><td></td></tr><tr><td>polyclonal Anticorps contre activé &bêta ; 1 ingégrin</td><td>Millipore</td><td>MAB19294</td><td>monoclonal</td></tr><tr><td colspan="4">Secondary Antibody Table</td></tr><tr><td>Goat anti-souris IgG Alexa 488</td><td>Life technologies</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-lapin Capri Alexa 548</td><td>Life technologies</td><td>A11036</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et culture de dissocié neurones sensoriels de embryons de poulet

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Les neurones sont des cellules multiples qui transportent l&#39;information essentielle pour une variété de fonctions, y compris la sensation, le mouvement du moteur, l&#39;apprentissage et la mémoire. Etudier les neurones in vivo peut être difficile en raison de leur complexité, leurs environnements variés et dynamiques, et des limitations techniques. Pour ces raisons, l&#39;étude de neurones in vitro peut s&#39;avérer bénéfique pour percer les mystères complexes de neurones. La nature bien définie de modèles de culture cellulaire un contrôle détaillé des conditions environnementales et des variables. Nous décrivons ici comment isoler, dissocier, et les neurones culture primaires d&#39;embryons de poulet. Cette technique est rapide, peu coûteux, robuste et génère croissance des neurones sensoriels. La procédure produit des cultures qui sont systématiquement hautement enrichies en neurones et a très peu de cellules non-neuronales (moins de 5%). Neurones primaires n&#39;adhèrent pas bien à verre non traité ou la culture de tissus en plastique, donc des procédures détaillées pour créer deux Distinct, bien définie substrats contenant de la laminine-pour le placage neuronale sont décrits. Des neurones en culture sont prête très bien à des techniques moléculaires et cellulaires multiples, y compris la co-immunoprécipitation, imaginer des cellules vivantes, ARNi, et immunocytochimie. Procédures pour le double immunocytochimie sur ces neurones en culture ont été optimisés et décrit ici.

Le protocole décrit ici, les enquêteurs de la culture une population enrichie de neurones sensoriels embryonnaires dissociées avec très peu de cellules (par exemple, &lt;5%) non-neuronales 7,8,10,16. De nombreux GHM peuvent être obtenues auprès du lombo-sacrée, thoracique et cervical. Selon les besoins de l'enquêteur, les GHM de ces régions anatomiques distinctes peuvent être facilement isolés. Par exemple, la figure 1 montre des images de l'embryon de poulet à travers différentes ét...

modèles de culture cellulaire fournissent un contrôle détaillé sur les conditions environnementales et fournissent ainsi une plate-forme puissante pour élucider de nombreux aspects de la biologie des cellules neuronales. Nous décrivons un procédé rapide, peu coûteux et fiable afin d&#39;isoler, de dissocier et de la culture des neurones sensoriels de l&#39;embryon de poulet. Détails de la préparation des substrats et immunocytochimie sont également fournis.

Isolement et culture de dissocié neurones sensoriels De embryons de poulet

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

L’objectif global de cette procédure est de cultiver une population enrichie de neurones sensoriels primaires dissociés à partir d’embryons de poulet. Ceci est accompli en recueillant des ganglions de la racine dorsale intacts du jour embryonnaire, sept à dix embryons de poulet dans un tube conique, puis en les brisant en sa suspension cellulaire dissociée. Dans un deuxième temps, les cellules DRG sont placées sur une boîte de culture pour l’incubation.Ensuite, la boîte de culture est rincée doucement pour déloger préférentiellement les neurones. La dernière étape consiste à plaquer les neurones sensoriels dissociés sur les substrats bien définis, tels que les lamelles lavées à l’acide et cuites précodées avec des concentrations élevées ou faibles de laminine. Une immuno-chimie est utilisée pour montrer la présence de NCA et d’intégrines bêta-1 activées dans les corps cellulaires, les neurites et les cônes de croissance des neurones sensoriels de poussin embryonnaires en culture dissociée.Cette méthode est un outil puissant pour élucider de nombreux aspects de la neurobiologie, y compris les mécanismes de guidage axonal, les cônes de croissance, la dynamique du cytosquelette, ainsi que la composition et la régulation de la surface cellulaire. Cette technique permet aux chercheurs d’obtenir rapidement les cultures fortement enrichies en neurones sensoriels dissociés, qui contiennent très peu de cellules gliales. Ceci est distinct des cultures de ganglions de la racine dorsale intacte qui contiennent à la fois des neurones et des cellules non neuronales.De plus, des variations mineures de ce protocole devraient permettre un rendement élevé de cultures neuronales à partir de sources autres que les ganglions de la racine dorsale, y compris le cerveau antérieur embryonnaire. Dans une hotte à flux laminaire, cassez un œuf de poussin Leghorn blanc fertile et placez son contenu dans une boîte de Pétri de 100 millimètres. Transférez ensuite l’embryon dans une autre boîte de Pétri de 100 millimètres.Ajoutez un XPBS chauffé dans la boîte de Pétri pour garder le tissu humide. L’embryon est décapité et le corps est transféré dans une autre boîte de Pétri propre. Chaud F 12 HS 10 est ajouté au tissu.Placez la boîte de Pétri avec le tissu embryonnaire sous le microscope de dissection dans une hotte à flux laminaire. Après cela, faites une incision médiane verticale de la queue au cou en pinçant le derme en développement pour exposer le cœur, les poumons et d’autres organes. À l’aide de la pince fine, saisissez doucement le cou et l’aorte ou tout autre tissu immédiatement supérieur au cœur et tirez vers la queue afin d’éviscérer l’animal.Ensuite, appliquez du F 12 HS 10 chaud sur le mouchoir pour nettoyer davantage la préparation et garder le mouchoir humide et répétez les applications de F 12 HS 10 tout au long de la dissection si nécessaire. Ensuite, retirez tous les organes cardiovasculaires, respiratoires ou digestifs restants pour exposer les côtes en développement de la colonne vertébrale et des DRG pour collecter les DRG des deux côtés de la colonne vertébrale lombaire, en dessous des côtes, arrachez les DRG de l’embryon. Cela se fait en pinçant et en sectionnant les racines qui s’étendent du Dr.G vers la moelle épinière et en saisissant le nerf en développement du DRG vers la périphérie ou vice versa.Ensuite, placez les DRG intacts dans un plat de culture de 35 millimètres rempli de F 12 HS 10 chaud. Retirez tout excès de tissu tel que les racines dorsales ou ventrales qui pourraient adhérer aux DRG. Pour obtenir des DRG supérieurs à la région lombaire, retirez la moitié ventrale de la colonne vertébrale thoracique et cervicale.Cela se fait en faisant une coupe dans la colonne vertébrale en développement perpendiculaire à l’axe de la moelle épinière dans la région lombaire supérieure, et une autre coupe dans la région cervicale supérieure. Faites ensuite des coupes le long des côtés droit et gauche de la colonne vertébrale. Collectivement, ces coupes détacheront la moitié ventrale de la colonne vertébrale de l’embryon, et la colonne est ensuite retirée de l’embryon pour permettre un accès facile aux DRG.Retirez la moelle épinière thoracique et cervicale en saisissant la moelle épinière à l’aide d’une pince fine. Ensuite, prélevez les DRG thoraciques et cervicales intacts comme fait précédemment, et placez-les dans F 12 HS 10 chaud avec d’autres DRGRincez ensuite l’intérieur d’une nouvelle pipette à pâte en verre avec F 12 HS 10 pour éviter que les DRG ne collent à la paroi de la pipette. Utilisez la pipette rincée pour transférer tous les DRG et F 12 HS 10 de la petite boîte de Pétri dans un tube conique stérile de 15 millilitres, des embryons supplémentaires peuvent être disséqués pour augmenter le nombre de DRG dans cette procédure. Placez le tube conique avec les DRG intacts dans la centrifugeuse et tournez doucement à 200 fois G pendant deux à trois minutes.Vérifiez que les DRG ont coulé au fond du tube. Retirez ensuite délicatement F 12 HS 10 en laissant la pastille DRG intacte. Ensuite, ajoutez deux millilitres d’un X-C-M-F-P-B-S pour déloger la pastille de DRG.Essorez à nouveau et retirez le C-M-F-P-B-S tout en conservant les DRG. Répétez cette étape de lavage pour un total de trois lavages. Une fois les lavages terminés et le C-M-F-P-B-S retiré, ajoutez deux millilitres de trypsine réchauffée dans le tube de 15 millilitres et délogez doucement les DRG.Ensuite, placez le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes pour digérer les DRG en cellules dissociées. Appliquez doucement les DRG dans une solution de trypsine et vérifiez visuellement l’absence de DRG intacts. Continuez la tation jusqu’à ce que les DRG intacts ne soient plus visibles à l’œil nu et/ou permettez des voyages plus longs en incubation dans le bain-marie à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les DRG intacts soient dissociés.Ensuite, centrifugez les DRG dissociés et la trypsine à 200 fois G pendant trois à cinq minutes afin de former une pastille. Tournez plus longtemps si nécessaire jusqu’à ce que la pastille se forme. Ensuite, aspirez soigneusement la trypsine sans perturber la pastille.Ajoutez deux millilitres de F 12 hs 10 à la pastille et tripotez doucement les DRG. Transférez ensuite tout le contenu du tube conique dans une boîte de culture de 100 millimètres. Rincez le tube avec huit millilitres de F 12 HS 10 et transférez-le dans la boîte de culture deux millilitres à la fois pour un total de 10 millilitres.Après cela, placez la boîte de culture dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Ajoutez maintenant 400 microlitres de laminine préparée, un à chaque lamelle en verre lavé à l’acide et cuit et étalez-le avec une pointe de pipette pour assurer une couverture complète. La tension superficielle permettra à la laminine 1 de rester sur la lamelle et de ne pas se répandre au fond de la boîte de culture.Placez un couvercle sur le plat et laissez Lamin one incuber pendant deux à trois heures à température ambiante. Ensuite, rincez trois fois les lamelles recouvertes de laminine avec du PBS stérile dans une hotte à flux laminaire. Laissez le PBS sur les lamelles après le dernier rinçage.Ne perdez pas de tension superficielle pendant les étapes de rinçage. Après l’incubation, utilisez une pipette stérile de 10 millilitres pour rincer doucement le fond de la boîte contenant les cellules DRG dissociées. Tenez le plat à un angle de 45 degrés.Prélever environ sept millilitres de F 12 HS 10. Ensuite, expulsez-le doucement sur un tiers de la parabole pour déloger les neurones. Répétez cette opération cinq fois de plus.Ensuite, faites pivoter le plat d’environ 120 degrés et répétez la procédure de rinçage pendant six autres rinçages. Répétez ensuite la procédure pour le tiers restant du plat. Maintenant, à l’aide de la même pipette, transférez F 12 HS 10 contenant des neurones de la boîte dans un tube conique.Centrifugez-le pendant cinq à 10 minutes à 200 G à granuler. Les cellules éliminent ensuite le F 12 HS 10, laissant le plomb intact. Ensuite, remettez la pastille en suspension avec deux millilitres de F 12 H chauffé plus des suppléments.Ensuite, déterminez la densité cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre, diluez les cellules si nécessaire avec F 12 H plus des suppléments pour obtenir la concentration de placage souhaitée. Retirez ensuite le PBS du couvercle recouvert de laminine Glisse immédiatement. Placez-y 400 microlitres de cellules.Transférez délicatement la boîte dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et laissez-la incuber pendant deux à trois heures dans des conditions stériles. Inondez doucement les paraboles de 35 millimètres contenant des neurones avec 1,6 millilitres de F 12 H plus des suppléments. Ensuite, retournez les cellules dans l’incubateur et incubez-les pendant la nuit.Cette figure montre des neurones sensoriels primaires dissociés en culture immunomarqués pour le NCA et les intégrines bêta un activées. Les neurones embryonnaires du poulet se développent vigoureusement sur de fortes concentrations de corps cellulaires neuronaux de laminine one. Les neurites et les cônes de croissance sont immunopositifs pour le NCA et ont activé la bêta-intégrine un.L’image fusionnée des deux colorants révèle que la plupart des cellules sont positives à la fois pour N cam et pour l’intégrine bêta activée. Comme prévu pour les neurones sensoriels embryonnaires de poussin, moins de 5 % des cellules récoltées par cette technique sont non neuronales. Sur cette image, il y a une cellule avec une morphologie gliale qui est NCA M négative et bêta une intégrine positive.Cohérent avec une cellule non neuronale. Un grossissement plus élevé d’un neurone sensoriel en culture montre clairement les neurites s’étendant à partir du corps cellulaire, et cet encart montre un grossissement plus élevé du cône de croissance à l’extrémité d’un neurite. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de dissocier soigneusement et complètement les ganglions de la racine dorsale intacts et de plaquer les neurones et la densité appropriée sur les substrats définis, tels que les feuillets recouverts lavés à l’acide et cuits codés avec des concentrations connues de stratifié un Après la procédure de culture.Des méthodes d’imagerie en direct telles que la microscopie time-lapse peuvent être effectuées pour évaluer le cône de croissance, l’embranchement de motilité, la dynamique POAL et d’autres comportements des cônes de croissance sur des substrats définis et en réponse aux molécules appliquées au milieu de culture. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une solide compréhension de la façon de produire une culture à croissance robuste qui est fortement enrichie pour les neurones dissociés primaires des ganglions de la racine dorsale embryonnaire de poulet.

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