Simple Plan Illumination module et l'approche micro-capillaire pour un microscope à grand champ

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer une microscopie à éclairage monoplan à l’aide d’un module d’excitation de feuillet de lumière pour microscopes inversés et de l’appliquer à des sphéroïdes cellulaires tridimensionnels. Pour ce faire, on utilise d’abord une pipette pour transférer un sphéroïde cellulaire du puits d’une plaque de microtitration à un second puits pour l’incuber après le lavage. Le sphéroïde S est ensuite introduit dans un capillaire rectangulaire.

La deuxième étape consiste à monter le module d’éclairage de la feuille de lumière sur la plaque de base de la table de positionnement du microscope inversé. Ensuite, le capillaire contenant le stéroïde est placé dans un porte-échantillon spécial pour la microscopie. La dernière étape consiste à définir la correspondance entre la feuille de lumière et le plan focal de la lentille de l’objectif du microscope dans la trajectoire de détection.

En fin de compte, des mesures de fluorescence tridimensionnelles peuvent être effectuées en faisant varier le plan focal à l’intérieur du sphéroïde cellulaire pour obtenir des informations à partir d’images uniques ou de Zacks concernant l’absorption de médicaments ou la structure du sphéroïde S. Le principal avantage de cette technique par rapport aux microscopes à feuillet de lumière existants est qu’elle est rentable et très polyvalente car elle se compose d’un module qui peut être adapté à un microscope existant et offre une grande liberté pour la recherche. Les implications de cette technique s’étendent à la recherche de médicaments et d’agents utilisés pour la thérapie et le diagnostic, en particulier, puisque l’adaptation du système microfluidique permet d’étudier des processus rapides dans des conditions d’écoulement.

Maintenant, cette méthode d’excitation, en combinaison avec n’importe quelle technique de détection, peut fournir un aperçu des stéroïdes à cellules vivantes à de faibles doses de lumière. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes vivants tels que les poissons cipro, les embryons d’artils, ainsi que les échantillons de tissus CLE optiques. Pour commencer, ajoutez 50 microlitres d’aéros 1,5 chauffé dans un milieu de culture dans chaque puits d’une plaque de 96 puits et laissez-le se solidifier pendant une à deux heures.

Ensuite, ensemencez environ 150 MCF de sept cellules cancéreuses du sein dans chaque puits de la plaque de 96 puits préparée pour S brut pendant cinq à sept jours, jusqu’à un diamètre d’environ 200 à 300 micromètres dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius. Ensuite, incubez les stéroïdes cellulaires avec l’antibiotique anthracycline chlorhydrate de doxorubicine pendant six heures à une concentration variant entre deux micromolaires et huit micromolaires en culture. Après l’incubation, laver les cellules OID avec une culture, un milieu ou une solution saline d’Earl’s avant la microscopie.

À l’aide d’un microscope inversé, montez le module de microscopie à éclairage monoplan ou le module d’excitation SPM sur la plaque de base de la table de positionnement. Équipez le microscope d’une lentille d’objectif de microscope grossissante 10 fois ou 20 fois et d’un filtre passe-long approprié dans le chemin de détection du microscope. Montez ensuite une caméra d’intégration sur le port de détection du microscope.

Utilisez un faisceau assemblé parallèle d’un laser ou d’une diode laser avec une longueur d’onde d’excitation de préférence 470 nanomètres et appliquez-le au module de spin. Ensuite, faites pivoter la lentille cylindrique de 90 degrés, ce qui transfère la feuille de lumière en position verticale pour un réglage axial de la taille du faisceau de la feuille de lumière. Placez un capillaire contenant un liquide avec un colorant fluorescent dans le porte-échantillon.

Fixez le porte-échantillon avec le capillaire à la table de positionnement du microscope. Alignez la position du capillaire de manière à ce qu’il soit centré et que la taille du faisceau de la feuille de lumière soit nette. Ajustez la taille du faisceau en faisant varier la position axiale de la lentille cylindrique elle-même.

Retournez l’objectif après le réglage. Placez le stéroïde cellulaire séparément ou en groupes dans des capillaires rectangulaires en verre de bo silicate d’une section transversale intérieure de 600 par 600 micromètres et d’une épaisseur de paroi de 120 micromètres. Pour ce faire, prenez le montant capillaire vide avec le pouce et le majeur et scellez l’ouverture supérieure avec l’index.

Amenez l’ouverture inférieure près du sphéroïde cellulaire dans son liquide environnant, libérez l’index du liquide de l’ouverture supérieure avec le stéroïde à l’intérieur. Il sera immédiatement absorbé par les forces capillaires. Ajustez la position du sphéroïde S dans le capillaire rempli par gravitation.

Vous pouvez également appliquer le stéroïde sur le capillaire par pipetage. Veillez à ce que l’ouverture de l’extrémité de la pipette soit d’une part suffisamment grande pour la taille du sphéroïde S et d’autre part, inférieure ou égale en taille au diamètre intérieur du capillaire. Placez ensuite le capillaire contenant le sphéroïde S dans un porte-échantillon spécial de microscopie.

Fixez le porte-échantillon avec le capillaire à la table de positionnement du microscope et alignez la position du stéroïde cellulaire de manière à ce qu’il soit centré et focalisé. Réglez l’alignement entre la feuille lumineuse et le plan focal de la lentille de l’objectif du microscope dans la trajectoire de détection en ajustant la position du miroir réfléchissant et de la lentille cylindrique. Remplissez le capillaire avec du sérum de veau fœtal ou FCS pendant 30 minutes pour favoriser l’adhésion cellulaire ultérieure d’un stéroïde cellulaire à la surface intérieure du verre.

Laissez le revêtement FCS restant dans le capillaire appauvri sécher pendant au moins 12 heures après l’introduction du stéroïde cellulaire dans le capillaire recouvert de FCS. Comme précédemment, laissez le capillaire dans l’incubateur pendant deux à quatre heures supplémentaires pour provoquer l’adhésion cellulaire du stéroïde. Ensuite, installez la partie flx du système microfluidique, y compris un piège à bulles.

Utilisez une pompe péristaltique pour remplir le flx de la tubulure avec un milieu de culture contenant le colorant fluorescent ou l’agent. Fixez d’abord le capillaire sans bulles sur le tube d’efflux, puis fixez l’autre côté du capillaire sur le tube de vidange. Réglez la température du liquide du bain-marie à la valeur souhaitée.

Ajustez ensuite la pompe péristaltique à la vitesse de pompe souhaitée. Collectez le liquide pompé dans un récipient avec une configuration en boucle ouverte pour l’acquisition et l’analyse des données. Réglez la puissance laser et le temps d’intégration pour l’acquisition de l’image.

Réglez l’incrément de la pile ZS sur une valeur comprise entre cinq et 10 micromètres, ce qui est préférable pour l’analyse de données tridimensionnelles. Comme l’épaisseur de la feuille de lumière est d’environ 10 micromètres, procédez à la réalisation de mesures d’images uniques ou de Zacks par variation du plan focal à l’intérieur du stéroïde cellulaire. Un scan Zack d’un stéroïde à sept cellules mc précédemment incubé avec huit micromolaires doxorubicine pendant six heures est montré.

Les images fournissent des informations détaillées sur l’absorption et la distribution cellulaires de la doxorubicine et sa dégradation. Le produit à l’intérieur de la couche cellulaire externe de la doxorubicine fluorescente rouge stéroïde est principalement localisé dans le noyau, tandis que dans les zones sphériques internes, la fluorescence verte soumise par un produit de dégradation devient dominante dans la membrane cellulaire. L’absorption du médicament chimiothérapeutique doxorubicine dans la cellule native du cancer du sein humain mc sept S est représentée pour une seule couche cellulaire sélectionnée par spm.

Lors de l’application de deux micromolaires et d’un milieu de culture dans le système d’écoulement, la fluorescence rouge et verte de la doxorubicine et de son produit de dégradation a augmenté de façon continue Lors de l’application de deux micromolaires de doxorubicine dans le milieu de culture à l’intérieur du système d’écoulement, la fluorescence rouge et verte de la doxorubicine et de son produit de dégradation a augmenté continuellement. Une fois masterisé, il ne faut que quelques minutes entre le montage du module d’élimination de la feuille de lumière et l’enregistrement des images fluorescentes d’échantillons 3D. Lors de la mesure et de l’état d’écoulement, il est très important de s’assurer que l’échantillon adhère à la surface interne du capillaire et d’éviter que des bulles d’air n’atteignent l’échantillon qui pourraient le détacher du capillaire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la microscopie à éclairage de feuille de lumière avec le module polyvalent adaptable à divers microscopes.