Name: In vitro test de Méthylation à étudier des protéines méthylation de larginine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Découvrez le test de méthylation in vitro pour étudier la méthylation de l'arginine par les PRMTs. Cette méthode sensible utilise des PRMTs marqués et l'autoradiographie pour déterminer le statut de méthylation des substrats.

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Cette étude a été soutenue par un prix d&#39;excellence du ministère américain des Anciens Combattants, et une subvention du NIH R01CA138528 à RW.

1 Préparation de constructions d&#39;expression <ol><li> Avant de commencer le protocole, PRMT clones dans des vecteurs d&#39;expression de mammifère avec une étiquette d&#39;épitope N-terminal (Myc ou HA), et le substrat dans le cadre avec la glutathion-S-transférase (GST) pour l&#39;expression de protéine à haut niveau et la purification à partir de cellules bactériennes lysats, en utilisant des techniques classiques de biologie moléculaire. </li></ol> 2 Purification de PRMT <ol><li> Utilisez des boîtes de 100 mm de culture pour maintenir les cellules épithéliales bronchiques humaines (Beas2B). Passage des cellules tous les 3 jours et ne les laissez pas se développer jusqu&#39;à confluence. </li><li> Le jour avant la transfection, semences 7,5 x 10 5 cellules dans 10 ml de milieu de culture dans une boîte de culture de 100 mm. Agiter pour disperser uniformément les cellules et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO2 humidifié à 5%. </li><li> Le lendemain, aspirer les médias et ajouter 5 ml de milieu de culture sans sérum et antibiotiques. Agiter et aspirer le support. Répétez cette étape unplus de temps, et, enfin, ajouter 5 ml d&#39;/ milieu sans antibiotique de sérum et de procéder à la transfection. </li><li> Diluer 6 pg d&#39;ADN de plasmide dans 750 ul de milieu sans sérum dans un tube en plastique de 1,5 ml de centrifugation stérile. </li><li> Dans un autre tube à centrifuger en plastique de 1,5 ml, diluer 30 pi de réactif de transfection dans 750 ul de milieu sans sérum. </li><li> Transférer la solution de réactif de transfection dilué (étape 2.5) dans le tube contenant l&#39;ADN dilué (étape 2.4). Mélanger doucement par aspiration et à plusieurs reprises. </li><li> Incuber le mélange de transfection à la température ambiante pendant 15 min. </li><li> Après 15 min, la pipette le mélange de transfection doucement sur ​​les cellules, agiter pour mélanger uniformément, et incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié CO 2 de 5%. </li><li> Après 3 heures, aspirer le milieu contenant les mélanges de transfection des cellules. Ajouter du milieu frais de culture de cellules additionné de sérum et d&#39;antibiotiques. </li><li> Incuber à 37 ° C dans un CO humidifié à 5% 2incubateur pendant 48 heures. </li><li> Après 48 h, de lyser les cellules dans 1 ml de tampon de lyse (1x solution saline tamponnée phosphate, 1% Nonidet P-40, le désoxycholate de sodium à 0,5%, 0,1% de dodécylsulfate de sodium, et 1 ug / ml phenlymethyl sulfonyl fluorure). Recueillir les lysats dans un tube de centrifugeuse en matière plastique avec un dispositif de levage de pile et incuber les lysats sur de la glace pendant 30 min. </li><li> Centrifuger les lysats à 15 000 xg pendant 10 min sur une centrifugeuse de paillasse pour éliminer les lysats à partir des débris cellulaires. [* Il est fortement recommandé de confirmer l&#39;expression de HA-PRMT1 par immunoblot d&#39;une aliquote de lysats avec des anticorps anti-HA, avant de procéder à la purification des enzymes pour le dosage de la méthylation.] </li><li> Pour la purification de PRMT, incuber 3 mg de lysats de cellules avec 30 pl de suspension de 50:50 anti-HA matrice d&#39;affinité dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), et faire tourner pendant la nuit à 4 ° C dans un agitateur de tubes. </li><li> Le jour suivant, tourner les tubes à 14000 xg dans une centrifugeuse de paillasse pendant 2 min à collecterles billes. Jeter le surnageant et laver les billes 3 fois avec 1 ml de tampon RIPA [20 mM Tris (pH 8,0), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM et 1% de Triton-X-100] à chaque lavage suivie d&#39;une centrifugation à 14 000 xg pendant 2 min. Après le troisième lavage, laver les billes une fois avec 100 pl de tampon de méthylation (50 mM Tris pH 8,5, 20 mM KCl, 10 mM de MgCl2, 1 mM β-mercaptoéthanol, 100 mM de saccharose). Après la centrifugation, éliminer le surnageant. Les perles contenant des PRMT immobilisées sont prêts à être utilisée dans le dosage de la méthylation. [* Il est fortement recommandé d&#39;utiliser immédiatement les PRMT immobilisés dans le test de méthylation.] </li></ol> 3 Purification de substrat <ol><li> Inoculer une colonie unique de GST-G3BP1 BL21 transformé dans 5 ml de milieu Luria-Bertani (LB) contenant 100 ug / ml d&#39;ampicilline. Cultiver les cultures pendant une nuit à 37 ° C sous agitation à 250 tours par minute. </li><li> Le lendemain, transférer la culture de la nuit à 50 ml de milieu LB frais et suiteinue de croître à une DO600 de 0,5-0,7 (Il faut environ 2 heures). </li><li> Lorsque la DO600 atteigne 0,5 à 0,7, ajouter isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) à une concentration finale de 1 mM et de continuer la culture pendant encore 4 heures à 37 ° C sous agitation à 250 tours par minute. </li><li> Récolter les cellules par centrifugation à 1 500 g pendant 10 min, et traiter le culot pour la purification de la TPS ou conserver à -80 ° C. </li><li> Re-suspendre le culot bactérien dans 5 ml de tampon de lyse (PBS 1x avec des inhibiteurs de la protéase, de 100 pg / ml de lysozyme et 0,1% de Triton-X-100) et on incube les lysats à 37 ° C pendant 30 min. A cette époque, les lysats apparaîtront trouble et visqueuse due à la libération de l&#39;ADN génomique bactérienne. </li><li> Cisailler l&#39;ADN génomique par traitement aux ultrasons (10 impulsions d&#39;une seconde chacune avec une amplitude de 30%). </li><li> Effacer les lysats par centrifugation à 15 000 g pendant 10 min et transférer le surnageant clair à un tube de 15 ml. Si le surnageant n&#39;est pas clair répéter la centrifuprocessus gation un plus de temps. </li><li> Pendant ce temps, laver les billes de TPS-sépharose deux fois avec du PBS froid et faire une suspension à 50:50 de GST-sépharose dans du PBS. Ajouter 200 ul de la suspension de GST-sépharose au lysat de cellules bactériennes dégagée et tourner à 4 ° C pendant 1 heure. </li><li> Après 1 heure, centrifuger les tubes à 500 g pendant 3 min pour recueillir les perles. Lavez les perles 3x avec le froid de la glace PBS. </li><li> Après le lavage final, remettre en suspension les billes dans 100 pl de tampon d&#39;élution (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM de NaCl, 30 mM de glutathion) et tourner à 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Centrifuger les tubes à 15 000 x g pendant 2 min et transférer le surnageant contenant la protéine purifiée dans un autre tube à centrifuger en plastique. Effectuer gel de polyacrylamide SDS (SDS-PAGE) d&#39;analyse de 5 pi de la protéine purifiée avec des quantités connues d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) afin d&#39;estimer la concentration de la protéine purifiée. </li></ol> 4. test de Méthylation REMARQUE: Effectuez les étapes suivantes dans une zone séparée désigné pour le travail de radio-isotopes et en conformité avec les protocoles de l&#39;établissement sur la réalisation d&#39;expériences avec des isotopes radioactifs. <ol><li> Ajouter 2 ug de GST-substrat purifiée et un mélange maître contenant un tampon de méthylation 1x (50 mM Tris pH 8,5, 20 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, 1 mM β-mercaptoéthanol, saccharose 100 mM), 1 uCi de S-adenosyl- L-[méthyl-3H] methionine, et de l&#39;eau jusqu&#39;à un volume final de 10 ul aux PRMT immobilisées de l&#39;étape (2.13) et incuber la réaction à 30 ° C pendant 1 heure. </li><li> Après 1 h, stopper la réaction par addition de 10 pi de tampon d&#39;échantillon SDS 2x. Après dénaturation des échantillons à 95 ° C pendant 10 minutes, séparer les échantillons sur un gel SDS-PAGE. </li><li> Par la suite, le transfert des protéines séparées dans le gel SDS sur une membrane de nitrocellulose en utilisant un transfert électrophorétique semi-sec. </li><li> Après le transfert, couvrir la membrane avec unutofluor (une image de intensificateur autoradiographique), et bercer doucement pendant 2 h à température ambiante. Après 2 h, verser le autofluor et le conserver pour un usage ultérieur. [* Etiqueter le tube de matière radioactive] </li><li> Air rapidement sécher la membrane sur un papier filtre, l&#39;enfermer dans un sac en plastique et d&#39;exposer la membrane à un film X-ray à -20 ° C. Durée d&#39;exposition suffisante varie entre 5-30 jours. </li></ol> 5 Confirmation d&#39;expression et de l&#39;égalité de PRMT Chargement de substrat <ol><li> Après la réalisation de l&#39;exposition suffisantes, transférer la membrane à une boîte en plastique contenant un tampon de blocage [solution saline tamponnée au Tris avec du Tween-20 (TBST + 3% de lait écrémé)] et balancer doucement pendant 1 heure. </li><li> Jetez le tampon de blocage en tant que déchets radioactifs. Incuber la membrane avec l&#39;anticorps anti-HA (1: 1000 dilution) dans du TBST pendant une nuit à 4 ° C, avec des doux balancement. </li><li> Laver la membrane avec du TBST 3x et incuber la membrane avec un anticorps secondaire anti-souris marqué à la HRP(1: 5000 dilution) dans du TBST à température ambiante pendant 1 h avec doux balancement. </li><li> Après 1 heure, laver la membrane avec du TBST 3x, et effectuer la détection de chimiluminescence de protéines avec un substrat HRP. </li><li> Après détection des PRMT HA-tags, incuber la membrane avec une solution de coloration Ponseau-S pendant 5 min à température ambiante. Laver rapidement les 3x membrane avec de l&#39;eau pour détecter les substrats de la TPS-étiqueté. Numériser l&#39;image. </li></ol>

<ol><li>Paik, W. K., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+methylase+I.+Purification+and+properties+of+the+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme.</a> J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).</li>
<li>Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+immediate-early+TIS21+protein+and+the+leukemia-associated+BTG1+protein+interact+with+a+protein-arginine+N-methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase.</a> J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).</li>
<li>Boffa, L. C., Karn, J., Vidali, G., Allfrey, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+NG%2C+NG%2C-dimethylarginine+in+nuclear+protein+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Distribution of NG, NG,-dimethylarginine in nuclear protein fractions.</a> Biochem Biophys Res Commun. 74, 969-976 (1977).</li>
<li>Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation at a glance.</a> J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).</li>
<li>Lee, Y. H., Stallcup, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+protein+arginine+methylation+of+nonhistone+proteins+in+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation.</a> Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).</li>
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<li>Bikkavilli, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dishevelled3+is+a+novel+arginine+methyl+transferase+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate.</a> Scientific reports. 2, 805(2012).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+of+G3BP1+in+response+to+Wnt3a+regulates+%7Bbeta%7D-catenin+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA.</a> J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt3a-stimulated+LRP6+phosphorylation+is+dependent+upon+arginine+methylation+of+G3BP2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2.</a> J Cell Sci. , (2012).</li>
<li>Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+arginine+methylation+in+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of arginine methylation in transcription.</a> Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).</li>
<li>Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Techniques in protein methylation.</a> Methods Mol Biol. 284, 195-208 (2004).</li>
<li>Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+applied+to+the+study+of+protein+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods applied to the study of protein arginine methylation.</a> Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).</li>
<li>Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+protein+arginine+methyltransferase+7+%28PRMT7%29+is+a+type+III+enzyme+forming+omega-NG-monomethylated+arginine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues.</a> J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

Le protocole décrit ici est couramment utilisée pour établir le statut de méthylation des substrats de PRMT identifiés. Ce test robuste et cohérente sera également apporter la preuve définitive de la spécificité de PRMT pour leurs substrats. Les éléments clés pour la réussite de ce test sont les suivants: 1 Expression de PRMT dans les cellules de mammifères, 2 Activité de PRMT purifiées, 3 Expression et purification de substrat, et 4 transfert occidentale complète des protéines de la membrane de nitrocellulose. <p c...

Méthylation des protéines a été décrite pour la première en 1968 1. Ce n&#39;est que le premier clonage d&#39;PRMT1 en 1996, que les chercheurs ont commencé à comprendre l&#39;importance de cette modification post-traductionnelle 2. Fait intéressant, environ 2% des résidus arginine dans les protéines d&#39;extraits nucléaires sont méthylés 3, ce qui indique l&#39;abondance de cette modification. L&#39;arginine est un acide aminé chargé positivement avec une chaîne latérale de base et la teneur en azote / s dans les chaînes latérales de l&#39;arginine peut être modifié après la traduction par l&#39;intermédiaire de l&#39;addition d&#39;un groupe méthyle, un processus connu comme l&#39;arginine méthylation 6.4. Arginine méthylation est catalysée par une classe d&#39;enzymes à savoir. Protéine transférases, méthyle arginine (PRMT). Arginines peuvent être soit monométhylées ou diméthylées et celui-ci peut être soit symétrique ou asymétrique selon le type de PRMT catalysant le procédé 4-6. Les protéines qui présentent arginineriches motifs de e-glycine sont des cibles potentielles pour la catalyse de PRMT médiation. méthylation de PRMT médiée par des substrats a été montré pour moduler l&#39;interaction protéine-protéine, une interaction protéine-acide nucléique, la fonction des protéines, l&#39;expression des gènes, et / ou de signalisation cellulaire, qui sont critiques pour l&#39;homéostasie cellulaire normale 7-9. Afin de comprendre le rôle biologique de la protéine méthylation de l&#39;arginine, les dosages précis, efficaces et reproductibles sont nécessaires pour établir le statut de méthylation des substrats de PRMT identifiés. En test de méthylation in vitro, qui évalue les capacités de PRMT purifiées à catalyser la méthylation de leurs substrats, est un test bien accepté pour étudier la méthylation de l&#39;arginine 10-12. Le succès global de ce dosage dépend largement de l&#39;activité des PRMT purifiés. PRMT peuvent être exprimées et purifiées à partir de bactéries ou de cellules de mammifères, 10,11. Ce dosage in vitro de la méthylation, comme detailed dans la partie protocole, est basée sur un procédé décrit à l&#39;origine par Tini et collègues 10. Dans ce protocole, on montre en détail les étapes intervenant dans l&#39;expression et la purification de PRMT1 dans des cellules de mammifères. La capacité de la PRMT1 purifiée pour catalyser la méthylation de Ras-GTPase activating protein protéine de liaison 1 (G3BP1), un substrat connu PRMT 8, a ensuite été évaluée en présence de S-adénosyl-L-[méthyl-3H] methionine en tant que donneur de méthyle. En utilisant ce dosage, on peut définir de manière fiable les capacités des PRMT à nouveau le méthylate ou substrats connus, ce qui est une étape primordiale dans l&#39;étude de la protéine méthylation de l&#39;arginine.

<table><tbody><tr><td>S-adénosyl-L-[méthyl-3H] méthionine</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint ultra&nbsp ;</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-270</td><td></td></tr><tr><td>Distributeur de flacons</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-900</td><td></td></tr><tr><td>AutoFluor</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-315</td><td></td></tr> 6 <tr><td>ml Flacons à scintillation National</td><td>Diagnostics</td><td>SKU :SVC-06</td><td></td></tr><tr><td>GST-sepharose</td><td>GE Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutathion Reduced</td><td>Sigma</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Réactif de transfection</td></tr><tr><td>Beas2B</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>US-Biologicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Désoxycholate de sodium</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>matrice affinitaire anti-HA</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad gel doc</td><td>Bio Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-HA</td><td>roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponseau S</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro test de méthylation à étudier des protéines méthylation de l&#39;arginine

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protéine méthylation de l&#39;arginine est l&#39;une des modifications post-traductionnelles les plus abondants dans le noyau. Protéine méthylation de l&#39;arginine peut être identifié et / ou déterminé par l&#39;intermédiaire d&#39;approches de protéomique, et / ou immunotransfert avec des anticorps spécifiques méthyl-arginine. Cependant, ces techniques peuvent parfois être trompeuses et fournissent souvent des résultats faussement positifs. Plus important encore, ces techniques ne peuvent pas fournir une preuve directe à l&#39;appui de la spécificité de substrat de PRMT. Des essais in vitro de méthylation, d&#39;autre part, sont des dosages biochimiques utiles, qui sont sensibles, et révèlent systématiquement si les protéines identifiées sont en effet des substrats PRMT. Un dosage typique de méthylation in vitro, comprenant PRMT actives purifiées substrat purifié, et un radio-isotope marqué donneur de méthyle (S-adénosyl-L-[méthyl-3H] methionine). Nous décrivons ici un protocole étape par étape pour isoler PRMT1 activité catalytique, un membre de la famille de PRMT exprimé de façon ubiquitaire. Le moiThyl activités de transferase de la PRMT1 purifiés ont ensuite été testés sur Ras-GTPase activant la protéine de liaison 1 (G3BP1) protéine, un substrat de PRMT connu, en présence de S-adénosyl-L-[méthyl-3H] methionine en tant que donneur de méthyle. Ce protocole peut être utilisé non seulement pour l&#39;établissement de l&#39;état de méthylation de nouveaux substrats de PRMT1 physiologiques, mais également pour la compréhension du mécanisme de base de la méthylation de l&#39;arginine protéine.

<html> Les capacités de HA-PRMT1 de méthylate TPS-G3BP1 ont été déterminées par un test in vitro de méthylation. PRMT1 étiquetée HA-purifié à partir de lysats de cellules Beas2B a été utilisé dans une réaction de méthylation contenant GST-G3BP1 et 1 uCi de S-adénosyl-L-[méthyl-3H] methionine, comme donneur de méthyle. PRMT1 pourrait efficacement catalyser la méthylation de TPS-G3BP1 (figure 1, partie supérieure). réactions de méthylation à l&#39;aide de listes déroulantes réalisées su...

Protéine méthylation de l&#39;arginine, catalysée par une classe d&#39;enzymes à savoir. Protéine arginine méthyl transférases (en PRMT), est le processus d&#39;addition enzymatique de groupe (s) méthyle arginines à l&#39;intérieur des protéines. Le test de méthylation in vitro est l&#39;outil le plus fiable pour évaluer l&#39;état de méthylation de substrats connus ou nouveaux PRMT.

In vitro test de Méthylation à étudier des protéines méthylation de l&#39;arginine

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

L’objectif global de cette procédure est d’établir l’état de méthylation des substrats de la protéine arginine méthyl transférase ou PRMT. Ceci est accompli en exprimant d’abord des PRT marqués à épitope dans des cellules de mammifères. Les RMT P sont ensuite immunoprécipités à partir des lysats cellulaires à l’aide de vitesses SRO enrobées d’anti-hémagglutinine ou d’anti-HA, suivies d’un lavage approfondi pour éliminer les protéines non spécifiquement liées.Ensuite, les billes lavées sont incubées avec la protéine de substrat purifiée à partir de bactéries et de tritium marqué par l’escargot L méthionine, ou sam. Enfin, la réaction est arrêtée et l’état de méthylation du substrat est déterminé par électrophorèse sur gel de sylsulfate de sodium, électrophorèse sur gel de polyacrylamide ou analyse de la page SDS suivie d’une autoradiographie. En fin de compte, la capacité des RMT p à méthyler le substrat est déterminée en comparant les réactions de méthylation par immunoprécipitation effectuées sur les lysats de cellules transfectées par vecteur vide et BRMT.Les approches protéomiques ou l’immuno-transfert avec des anticorps spécifiques de la méthylarginine peuvent parfois être trompeuses, fournissant souvent de faux résultats postaux. Plus important encore, ils ne peuvent pas fournir de preuves directes à l’appui de la spécificité du substrat PRMT. Le principal avantage de l’essai de méthylation in vitro que je vais démontrer dans cette vidéo est qu’il est sensible et révèle constamment si les protéines identifiées où se trouvent les substrats PRMT La veille de la transfection, grainez 750 000 cellules épithéliales bronchiques humaines dans 10 millilitres de milieu de culture.Dans une boîte de culture de 100 millimètres, faites tourner la boîte pour disperser uniformément les cellules et incubez à 37 degrés Celsius dans un incubateur de CO2 humidifié à 5 %. Le lendemain, aspirez le milieu et ajoutez cinq millilitres de milieu de culture sans sérum ni antibiotiques, faites tourbillonner et aspirez le milieu. Répétez cette étape une fois de plus et ajoutez enfin cinq millilitres de milieu sérique sans antibiotique, puis procédez à la transfection.Pour effectuer la transfection, diluez d’abord six microgrammes d’ADN plasmidique PRMT dans 750 microlitres de milieu sans sérum dans un tube à centrifuger en plastique stérile de 1,5 millilitre dans un autre tube à centrifuger en plastique de 1,5 millilitre. Diluez 30 microlitres de réactif de transfection dans 750 microlitres de milieu sans sérum. Transférez ensuite la solution de réactif de transfection diluée dans le tube contenant l’ADN dilué mélangé doucement en pipetant de haut en bas plusieurs fois.Incuber le mélange de transfection à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, pipetez doucement le mélange de transfection sur les cellules et remuez pour mélanger uniformément. Après une incubation de trois heures à 37 degrés Celsius, aspirer le milieu contenant les mélanges de transfection des cellules.Ajoutez ensuite un milieu de culture cellulaire frais complété par du sérum et des antibiotiques. Après une incubation de 48 heures à 37 degrés Celsius, les cellules dans un millilitre de tampon de lyse. Collectez les lysats sur un tube à centrifuger en plastique à l’aide d’un élévateur de cellules.Ensuite, incubez les lysats sur de la glace pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez. Les lysats à 15 000 GS pendant 10 minutes sur une centrifugeuse de paillasse.Incuber trois milligrammes de lysats cellulaires avec 30 microlitres d’une suspension de 50 à 50 d’une matrice d’affinité anti-HA dans une solution saline tamponnée au phosphate. Ou PBS tourne pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans un rotateur de tube.Le lendemain, faites tourner les tubes à 14 000 GS sur une centrifugeuse de paillasse pendant deux minutes pour recueillir les billes. Après avoir jeté le snat, lavez les billes avec un millilitre de tampon RIPA suivi d’une centrifugation comme précédemment. Après avoir lavé les billes trois fois avec le tampon RIPA, lavez les billes une fois avec 100 microlitres de tampon de méthylation.Après la centrifugation, retirez le surnageant. Les billes contenant les mRMT p immobilisés sont prêtes à être utilisées dans le test de méthylation. Effectuez le test de méthylation dans une zone distincte désignée pour les radio-isotopes.Travailler dans le respect des protocoles de l’établissement pour le travail avec les isotopes radioactifs. Préparez le glutathion purifié, la s transférase ou le substrat GST comme décrit dans le protocole de texte. Combinez deux microgrammes avec un mélange principal contenant un tampon de méthylation x et une micro-curie de méthionine d’escargot L marqué au tridium.Ajouter le mélange aux massothérapeutes autorisés et incuber à 30 degrés Celsius pendant une heure. Au bout d’une heure, arrêtez la réaction en ajoutant 10 microlitres de deux XSDS. Tampon d’échantillon après dénaturation des échantillons à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes.Séparez les échantillons par la page FDS plus tard. Transférez les protéines séparées du gel SDS sur une membrane de nitrocellulose en utilisant un transfert électrophorétique semi-sec. Après le transfert, recouvrez la membrane d’une image auto-radiographique.Intensifier et balancer doucement pendant deux heures à température ambiante Après deux heures, versez l’intensificateur et conservez-le pour une utilisation ultérieure. Faites sécher rapidement la membrane à l’air libre sur un papier filtre, scellez-la dans un sac en plastique et exposez la membrane à un film radiographique à moins 20 degrés Celsius. Les temps d’exposition suffisants varient entre cinq et 30 jours.Après avoir obtenu des expositions suffisantes, transférez la membrane dans une boîte en plastique contenant un tampon de blocage et balancez-la doucement pendant une heure. Jetez le tampon de blocage en tant que déchet radioactif. Ensuite, incubez la membrane avec un anticorps anti-HA dans du T tris, une solution saline tamponnée avec du tween 20, abrégée TBST pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec un léger balancement le lendemain.Lavez la membrane avec du TBST trois fois. Ensuite, incubez la membrane avec de l’anticorps secondaire anti souris de raifort marqué peroxydase dans TBST à température ambiante pendant une heure avec un léger balancement. Après avoir lavé la membrane avec du TBST trois fois, effectuez la détection par chimiluminescence des protéines avec un substrat de peroxydase de raifort après la détection des RMT P de l’étiquette HA.Incuber la membrane avec la solution de coloration poncho S pendant cinq minutes. À température ambiante, lavez rapidement la membrane trois fois à l’eau avant de scanner l’image. Pour détecter les substrats marqués GST, les capacités de l’étiquette HA PMT one à méthyler l’étiquette GST G trois PP one ont été déterminées par un essai de méthylation in vitro.HA TAG prm T un purifié à partir de cellule B2B. Les lysats ont été utilisés dans une réaction de méthylation contenant GSTG trois, BP un et un micro-curry d’escargot L méthionine marqué au tritium. En tant que donneur de méthyle, p MT un pourrait catalyser efficacement la méthylation de GS TG trois BP un réactions de méthylation en utilisant des pull-downs effectués sur des lysats de vecteur vide.Les cellules B2B transfectées ont servi de contrôle négatif. L’immuno-transfert avec des anticorps anti-HA a confirmé l’expression de p rmt. Une coloration de ponchos a ensuite été utilisée pour démontrer une charge égale de GSTG trois BP un dans les deux réactions.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un test de méthylation in vitro.

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