La formation de dosage souple Agar Colony

L’objectif global de cette procédure est de quantifier la croissance indépendante de l’ancrage cellulaire. Pour ce faire, il suffit d’abord de déposer une couche de gélose sur la plaque de culture cellulaire et de la laisser durcir. La deuxième étape consiste à plaquer un mélange de cellules dans de la gélose sur le dessus de la couche de gélose précédente.

Ensuite, les cellules sont autorisées à former des colonies sur une période de quelques semaines. La dernière étape consiste à colorer les colonies pour la visualisation et la quantification. En fin de compte, le test de formation de colonie de gélose molle est utilisé pour montrer la croissance indépendante d’Anchorage comme indication de la transformation cellulaire.

Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes, telles que le test de Clon genig, est que le test de formation de colonies de gélose molle nécessite que les cellules forment des colonies de manière indépendante d’Anchorage. Commencez la procédure en étiquetant chaque puits d’une culture tissulaire traitée. Plaque à six puits appropriée pour chaque lignée cellulaire ou condition étudiée.

Ensuite, préparez deux milieux de culture Xcel en dissolvant un gramme de milieu en poudre et 0,2 gramme de bicarbonate de sodium dans l’eau déminéralisée jusqu’à un volume final de 50 millilitres. Passez ce fluide à travers un filtre de 0,2 micron. Ajouter des composants supplémentaires nécessaires à la culture normale de la lignée cellulaire d’intérêt.

Par exemple, cultivez la lignée cellulaire CMT 1 67 dans un milieu RPMI 1640 complété par une solution de streptomycine à 10 % de FBS et à 1 % de pénicilline. Réchauffer à 37 degrés Celsius dans un bain d’eau chaude avant utilisation. Préparez maintenant un milieu de culture Xcel.

Préparez ensuite 1 % de gélose noble en ajoutant un gramme de gélose noble à 100 millilitres d’eau déminéralisée. Après cela, préparez 0,6 % de gélose noble en ajoutant 0,6 gramme de gélose noble à 100 millilitres d’eau déminéralisée. Ensuite, autoclavez les mélanges de gélose noble.

Par la suite, préparez une solution mère de chlorure de nitro blue tetra oleum d’un milligramme par millilitre dans un XPBS dans le but de colorer les colonies. Dans cette procédure, passez au micro-ondes la bouteille de gélose noble à 1 % pendant environ une à deux minutes tout en chauffant au micro-ondes. Surveillez attentivement la solution pour éviter qu’elle ne déborde.

Continuez ensuite à chauffer et à mélanger par intermittence jusqu’à ce que la gélose soit complètement dissoute et que la solution soit claire. Après cela, placez la solution de gélose fondue et le milieu de culture Prewarm two x dans un seau à glace rempli de 42 degrés Celsius. Eau du robinet.

De plus, placez un tube conique de 50 millilitres dans un porte-tube dans le seau à glace avec de l’eau chaude. Ensuite, transférez le seau dans le capot de culture cellulaire. Ajoutez ensuite six millilitres de milieu de culture et six millilitres de la solution de gélose noble à 1 % dans le tube conique de 50 millilitres.

Pipette de haut en bas plusieurs fois pour mélanger. Travailler à un rythme soutenu empêchera le durcissement prématuré de l’agar-agar. Ensuite, prélevez environ 5,5 millilitres de mélange à l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres.

Laissez les bulles d’air remonter vers le haut de la colonne de pipette. Déposez ensuite 1,5 millilitre du mélange dans chaque puits et évitez le dépôt de bulles d’air. Couvrez la plaque et laissez le mélange de gélose se solidifier dans la hotte de culture cellulaire à température ambiante pendant 30 minutes.

Tout d’abord, récoltez les cellules à l’aide de trypsine et diluez-les d’un à cinq en culture, dans un tube conique de 15 millilitres. Comptez les cellules et calculez le nombre de cellules nécessaires par puits pour préparer une suspension cellulaire finale à ce moment-là. Ensuite, faites fondre une solution de gélose à 0,6 % au micro-ondes.

Placez-le dans un seau à glace contenant de l’eau chaude avec un tube conique de 50 millilitres dans un support de tube et la suspension finale de la cellule. Transférez ensuite le seau à glace avec de la gélose fondue à 0,6 % dans le capot de culture cellulaire pour les étapes suivantes. Pour préparer un volume total de 12 millilitres de suspension cellulaire pour une plaque à six puits, il faut d’abord pipeter six millilitres de suspension cellulaire dans le tube conique de 50 millilitres.

Ajoutez ensuite six millilitres de gélose à 0,6 % dans le tube. Maintenez le mélange à 42 degrés Celsius pour éviter un durcissement prématuré et pour maximiser la survie cellulaire. Ensuite, pipetez le mélange rapidement, deux à trois fois pour répartir les cellules.

Prélevez 5,5 millilitres de mélange à l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres et laissez les bulles d’air remonter vers le haut de la colonne de pipette. Déposez ensuite 1,5 millilitres du mélange dans chacun. Laissez le mélange de gélose cellulaire se solidifier à température ambiante dans la hotte de culture cellulaire pendant 30 minutes avant de le placer dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 degrés Celsius.

Ajoutez 100 microlitres de milieu de croissance sur la couche supérieure de gélose deux fois par semaine pour éviter la dessiccation et prévoyez environ 21 jours pour une formation adéquate des colonies. Pour colorer les cellules, ajoutez 200 microlitres de solution de chlorure de nitro blue tetra oleum dans chaque puits et incubez la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Une fois les colonies colorées, prenez des photos des puits à l’aide de l’imageur et comptez les colonies à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.

Voici le test de formation d’une colonie de gélose molle d’un vecteur exprimant les cellules CMT 1 67 LNCX LPC X et CMT 1 67 LL a dépassé de sept un neuf frisé sur les cellules exprimées. Le vecteur exprimant les cellules CMT 1 67 L et CXL PC X et CMT 1 67 LL a été sept a f frisotté. Neuf cellules surexprimant ont été plaquées dans un essai de formation de colonie de gélose molle CMT 1 67 LL est allé sept frisés neuf cellules ont montré une diminution marquée de la formation de colonie Après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur le cancer pour explorer la transformation cellulaire in vitro. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer les cellules pour une croissance indépendante d’Anchorage.