Name: La formation de dosage souple Agar Colony (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Apprenez l'essai de formation de colonies en agar mou pour quantifier la croissance indépendante de l'ancrage des cellules transformées. Cette méthode permet d'évaluer le potentiel tumorigène et les effets des protéines suppresseurs de tumeurs.

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Cette étude a été financée par un prix de mérite du ministère américain des Anciens combattants et une subvention du NIH R01CA1385282522717 à RW.

1. Préparation des matériaux et réactifs <ol><li> Étiqueter chaque puits d&#39;une culture de tissu traité plaque de 6 puits appropriée pour chaque ligne ou état cellule objet d&#39;une enquête. </li><li> Préparer 2x milieu de culture cellulaire en dissolvant 1 g de produit de poudre et 0,2 g de bicarbonate de sodium dans de l&#39;eau désionisée à un volume final de 50 ml. </li><li> Passer ce milieu à travers un filtre de 0,2 pm pour stériliser. </li><li> Ajouter des composants supplémentaires nécessaires pour la culture normale de la lignée cellulaire d&#39;intérêt. Par exemple, la ligne 167 CMT croître des cellules dans un milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10% de FBS et de la pénicilline / streptomycine solution à 1%. Milieu chaud à 37 ° C dans un bain d&#39;eau chaude avant de les utiliser. </li><li> Préparer 1x milieu de culture cellulaire séparément comme vous le feriez pour la culture cellulaire normale de la lignée cellulaire d&#39;intérêt. </li><li> Préparer la gélose noble à 1% par addition de 1 g de gélose noble à 100 ml d&#39;eau désionisée. REMARQUE: agar Noble ne se dissout pas complètement avec agitation seul. </li><li> Préparer0,6% d&#39;agar noble en ajoutant 0,6 g de gélose noble à 100 ml d&#39;eau désionisée. Les deux solutions d&#39;agar peuvent être réalisées dans des bouteilles de 100 ml en verre avec des couvercles pouvant être fermés pour le stockage à long terme. </li><li> Autoclave les mélanges agar nobles à stériliser. Ces mélanges peuvent être effectués à l&#39;avance et stockées à 4 ° C, mais doivent être chauffées à nouveau au moment de l&#39;expérience jusqu&#39;à dissolution complète de l&#39;agar. </li><li> Préparer une solution de chlorure de tétrazolium nitrobleu en faisant un / ml de solution mère à 1 mg dans 1 x PBS (8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4 et 0,24 g de KH 2 PO 4 dans H 2 O à un volume final de 1000 ml ). Elle sera utilisée à la fin de l&#39;expérience pour colorer les colonies. </li></ol> 2. Dépôt de couche de fond de Agar <ol><li> Desserrer le bouchon sur la bouteille de 1% d&#39;agar noble et micro-ondes pendant environ 1-2 min. Tout en chauffant dans un four micro-ondes, surveiller étroitement la solution pour éviter de déborder. Continuer à chauffer, tout en mélangeant de façon intermittente,jusqu&#39;à ce que l&#39;agar soit complètement dissous et la solution est claire. REMARQUE: Utiliser des gants résistant à la chaleur pour traiter ballon après le chauffage. Ne pas le faire peut causer des brûlures ou des blessures graves. </li><li> Placez solution d&#39;agar fondu et milieu de culture 2x préchauffé dans un seau à glace rempli avec de l&#39;eau chaude du robinet (42 ° C). Également placer un tube conique de 50 ml dans un support de tube dans le seau à glace avec de l&#39;eau chaude. Transfert seau à la culture cellulaire capot pour les étapes suivantes. </li><li> Pour la couche inférieure de l&#39;agar, vous aurez besoin de 1,5 ml d&#39;un mélange d&#39;agar et milieu par puits d&#39;une plaque à 6 puits. </li><li> Afin d&#39;assurer une quantité suffisante du mélange, préparer un total de 12 ml pour chaque plaque de 6 puits. </li><li> Lancer en ajoutant 6 ml de milieu de culture à 50 ml le tube conique et ensuite 6 ml de la solution de gélose noble à 1%. </li><li> Inverser le tube conique plusieurs fois pour mélanger. Travailler à un rythme soutenu permettra d&#39;éviter un durcissement prématuré de la gélose molle. </li><li> Dresser environ 5,5 ml de mélange dans un 5 ml pi sérologiquepipette. </li><li> Laissez les bulles d&#39;air de remonter en haut de la colonne de la pipette avant de déposer 1,5 ml de ce mélange dans chaque puits. Faites preuve de prudence pour éviter le dépôt de toutes les bulles d&#39;air dans les puits de la plaque. </li><li> Couvrir les plaques et laisser reposer le mélange de la gélose se solidifier à la température ambiante, dans une culture de cellules d&#39;aération, pendant 30 min. </li></ol> 3. Dépôt de la couche supérieure de gélose cellules contenant <ol><li> Une fois que la couche inférieure de la gélose est solidifiée, commencer la préparation de la couche supérieure. </li><li> Tout d&#39;abord, les cellules de récolte par traitement à la trypsine et les diluent 1: 5 dans un milieu de culture (par exemple, pour 1 ml de trypsine, ajouter 4 ml de milieu) dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Compter les cellules et calculer le nombre de cellules par puits nécessaires pour préparer une suspension de cellules finale à ce stade. Ce nombre peut varier en fonction du type de cellule. Utilisez 5.000 cellules / puits comme un point de départ et ajuster si nécessaire. Pour ce numéro de cellule, vous préparer une suspension cellulaire de 6667 cellules / ml (soit chaque well recevra 0,75 ml de cette suspension et 0,75 ml de gélose pour un volume total de 1,5 ml; la concentration de cellules est également dilué à 1: 2 pour un nombre total de cellules finale de 5000). </li><li> Le volume de suspension cellulaire nécessaire par puits d&#39;une plaque à 6 puits sera à nouveau 1,5 ml. Préparer supplémentaire suspension cellulaire total de 12 ml par plaque de 6 puits. </li><li> Faire fondre solution de gélose à 0,6% dans un four micro-ondes comme ci-dessus et le placer dans un seau à glace contenant de l&#39;eau chaude avec un tube conique de 50 ml dans un support de tube et la suspension de cellules finale de l&#39;étape 3.3. </li><li> Transférer le seau à glace avec 0,6% de gélose fondue de hotte de culture cellulaire pour les étapes ultérieures. </li><li> Mélanger 0,6% d&#39;agar et de la suspension cellulaire dans un rapport de 1: 1, la préparation d&#39;un volume total de 12 ml par plaque à 6 puits. 1,5 ml seront nécessaires pour bien mais en plus doivent être faites comme ci-dessus. </li><li> Pipette 6 ml de suspension cellulaire dans le tube conique de 50 ml. </li><li> Ensuite, ajouter 6 ml d&#39;agar à 0,6% dans le tube. REMARQUE: La température de ce mélange doit êtremaintenu autour de 42 ° C pour éviter un durcissement prématuré et à maximiser la survie des cellules. </li><li> En travaillant rapidement, pipette ce mélange 2-3x à distribuer des cellules, puis dessinez une hausse de 5,5 ml de mélange dans une pipette de 5 ml sérologique. </li><li> Autoriser les bulles d&#39;air de remonter en haut de la colonne de la pipette avant de déposer 1,5 ml de ce mélange dans chaque puits. Faites preuve de prudence pour éviter le dépôt de toutes les bulles d&#39;air dans les puits de la plaque. </li><li> Laisser le mélange de cellules / gélose se solidifier à la température ambiante, dans une culture de cellules d&#39;aération, pendant 30 minutes avant de les placer dans un 37 ° C culture cellulaire incubateur humidifié. </li><li> Le temps nécessaire à la formation de colonies adéquate varie pour chaque lignée cellulaire, typiquement environ 21 jours. </li><li> Une couche de milieu de croissance doit être maintenue au-dessus de la couche supérieure de gélose pour éviter la dessiccation. 100 pi de milieu ajoutée deux fois par semaine est suffisant à cet effet. </li></ol> 4. la coloration des plaques et comptage des colonies <ol><li> cellules de tache en ajoutant 200 _6, l d&#39;une solution de chlorure de nitrobleu de tétrazolium par puits et en incubant les plaques pendant une nuit à 37 ° C. </li><li> Une fois que les colonies sont colorées, prendre des photographies des puits à l&#39;aide d&#39;un imageur et compter les colonies en utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;images. </li></ol>

<ol><li>Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+growth+of+mammalian+cells+in+vitro%3B+growth+characteristics+of+colonies+from+single+HeLa+cells+with+and+without+a+feeder+layer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer.</a> J Exp Med. 103, 273-283 (1956).</li>
<li>Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoikis%3A+an+emerging+hallmark+in+health+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Anoikis: an emerging hallmark in health and diseases.</a> The Journal of pathology. 226, 380-393 (2012).</li>
<li>Wend, P., Holland, J. D., Ziebold, U., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+stem+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in stem and cancer stem cells.</a> Semin Cell Dev Biol. 21, 855-863 (2010).</li>
<li>Reya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Wnt+signalling+in+self-renewal+of+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells.</a> Nature. 423, 409-414 (2003).</li>
<li>Klaus, A., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+and+its+impact+on+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling and its impact on development and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling in development and disease.</a> Cell. 127, 469-480 (2006).</li>
<li>Takahashi-Yanaga, F., Kahn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Wnt+signaling%3A+can+we+safely+eradicate+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting Wnt signaling: can we safely eradicate cancer stem cells.</a> Clin Cancer Res. 16, 3153-3162 (2010).</li>
<li>De, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2FCa2%2B+signaling+pathway%3A+a+brief+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Wnt/Ca2+ signaling pathway: a brief overview.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 43, 745-756 (2011).</li>
<li>Tennis, M. A., Vanscoyk, M. M., Wilson, L. A., Kelley, N., Winn, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+Wnt7a+is+modulated+by+DNMT1+and+cigarette+smoke+condensate+in+non-small+cell+lung+cancer%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Methylation of Wnt7a is modulated by DNMT1 and cigarette smoke condensate in non-small cell lung cancer).</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Winn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+Wnt-7a+expression+reverses+non-small+cell+lung+cancer+cellular+transformation+through+frizzled-9-mediated+growth+inhibition+and+promotion+of+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Restoration of Wnt-7a expression reverses non-small cell lung cancer cellular transformation through frizzled-9-mediated growth inhibition and promotion of cell differentiation.</a> J Biol Chem. 280, 19625-19634 (2005).</li>
<li>Winn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumorigenic+effect+of+Wnt+7a+and+Fzd+9+in+non-small+cell+lung+cancer+cells+is+mediated+through+ERK-5-dependent+activation+of+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Antitumorigenic effect of Wnt 7a and Fzd 9 in non-small cell lung cancer cells is mediated through ERK-5-dependent activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma.</a> J Biol Chem. 281, 26943-26950 (2006).</li>
<li>Tennis, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sprouty-4+inhibits+transformed+cell+growth%2C+migration+and+invasion%2C+and+epithelial-mesenchymal+transition%2C+and+is+regulated+by+Wnt7A+through+PPARgamma+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Sprouty-4 inhibits transformed cell growth, migration and invasion, and epithelial-mesenchymal transition, and is regulated by Wnt7A through PPARgamma in non-small cell lung cancer.</a> Mol Cancer Res. 8, 833-843 (2010).</li>
<li>Steele, J. G., Rowlatt, C., Sandall, J. K., Franks, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+properties+of+high-+and+low-metastatic+cell+lines+selected+from+a+spontaneous+mouse+lung+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell surface properties of high- and low-metastatic cell lines selected from a spontaneous mouse lung carcinoma.</a> Int J Cancer. 32, 769-779 (1983).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

En confirmation in vitro de la fonction de suppresseur de tumeur de protéines de signalisation est difficile. L&#39;un des tests les plus rigoureux disponibles pour enquêter sur cette propriété est le dosage de formation de colonies sur gélose molle. Ici, nous avons représenté le dosage de formation de colonies sur gélose molle en utilisant une lignée cellulaire de carcinome du poumon de souris surexprimant de manière stable et Wnt7a Fzd9 par rapport à sa lignée cellulaire parentale CMT167. <p clas...

Le dosage de formation de colonies sur gélose molle est une technique largement utilisée pour évaluer la transformation cellulaire in vitro. Historiquement, un autre test, le test clonogénique, décrit par Puck et al., En 1956, a été utilisé pour évaluer la capacité des cellules à former des colonies 1. Dans cette technique, les cellules ont été dispersées sur une plaque de culture et cultivées en présence de cellules nourricières »ou« milieu conditionné pour fournir des facteurs de croissance nécessaires. La limitation de cette technique est qu&#39;elle ne fourni des informations concernant la formation de colonies. Les cellules normales sont empêchés de croissance indépendante de l&#39;ancrage, en raison d&#39;un type particulier de la mort par apoptose, appelé anoïkis 2. Toutefois, les cellules transformées ont la capacité de croître et de se diviser sans se lier à un substrat. Pour capitaliser sur ce concept, les chercheurs ont développé le test de formation de colonies sur gélose molle. Le test de formation de colonies sur gélose molle a depuis été modifié, au cours des dernières années, pour répondre specific besoins. Une variante consiste incorporation de colorant fluorimétrique pour permettre à haut débit comptage de colonies. Une autre variante consiste à utiliser une solution d&#39;agar spécialisé pour permettre la récupération de cellules viables après la formation de colonies lorsque les échantillons de protéines ou d&#39;ADN sont nécessaires. Dans le dosage souple classique de formation de colonies agar, les cellules sont cultivées dans une couche d&#39;agar mou mélangé avec un milieu de culture cellulaire qui repose sur une couche de gélose molle, également mélangée avec du milieu de culture de cellules, mais contenant une concentration plus élevée de la gélose. Cela empêche les cellules d&#39;adhérer à la plaque de culture, tout en permettant aux cellules transformées de former des colonies visibles. La raison de cette technique est que les cellules normales de la cellule dépendent de la matrice extracellulaire de contact pour être en mesure de croître et de se diviser. A l&#39;inverse, les cellules transformées sont capables de croître et de se diviser sans tenir compte de leur environnement. Par conséquent, des cellules capables de former des colonies d&#39;une manière indépendante de l&#39;ancrage sont considered à transformer et cancérigènes. L&#39;objectif global de cette méthode est de mesurer cette capacité dans les cellules d&#39;une manière semi-quantitative et rigoureuse. La voie de signalisation Wnt est critique dans l&#39;embryogenèse et souvent dérégulé dans la tumorigenèse 6.3. Il existe de multiples voies impliquant la signalisation Wnt. La voie canonique implique la signalisation Wnt et régulation de la transcription du gène en aval par ses effets sur la co-activateur transcriptionnel beta-caténine. Le signal Wnt également à travers plusieurs voies non canoniques, par exemple, la voie plane de la polarité cellulaire, qui régule des éléments participant à la structure du cytosquelette 7, et la voie Wnt-calcium, qui régule la libération de calcium à partir du reticulum endoplasmique 8. Ligands Wnt exercent leur activité grâce à des récepteurs Frizzled contraignant. Bien que plusieurs Wnt ont été montré pour être régulés à la hausse dans le cancer du poumon, Wnt7a a été montré pour être régulé à la baisse en non-Smalle cancer du poumon de cellules L à travers la méthylation du promoteur 9. Wnt7a lie Fzd9 et agit comme un suppresseur de tumeur par l&#39;intermédiaire d&#39;une voie non-canonique. La restauration de Wnt-7a et FZD-9 inhibe la croissance de non-petites cellules du cancer du poumon à grandes cellules 10. Les effets de Wnt7a / Fzd9 sont médiés par l&#39;activation de ERK-5, ce qui, à son tour, active peroxisome γ du récepteur activé par les proliférateurs de (PPARy) 11,12. Ici, nous montrons que la surexpression de Wnt7a Fzd9 et se traduit par la suppression de la croissance indépendante de l&#39;ancrage d&#39;une lignée de cellules de carcinome pulmonaire murin. Cellules CMT167 murins ont été dérivées d&#39;un carcinome du poumon chez les souris C57BL / souris LCRF 13 et ont été transfectées de manière stable avec Wnt7a et Fzd9. La surexpression de Wnt7a Fzd9 et ont été confirmés par PCR quantitative (Q-PCR) et la fonctionnalité de Wnt7a et Fzd9 surexpression a été confirmé par l&#39;activation en aval de PPARy.

<table><tbody><tr><td>Lignée cellulaire cancéreuse d’intérêt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10032302</td><td>CMT-167 Cellules</td></tr> en <tr><td>poudre RPMI 1640 Milieu</td><td>Gibco</td><td>31800-089</td><td>Utilisé pour préparer 2x milieu de culture cellulaire.</td></tr><tr><td>Milieu liquide RPMI 1650 Cellgro</td><td></td><td>10-040-CV</td><td>Appelé milieu de culture cellulaire 1x.</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>HyClone</td><td>SH30910.03</td><td>Utilisé en complément du milieu de culture cellulaire.</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>CellGro</td><td>30-002-Cl</td><td>Utilisé dans le milieu de culture cellulaire.</td></tr><tr><td>Difco Noble Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214230</td><td>Utilisé pour préparer 1,0 % et 0,6 % d’agar.</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Fisher</td><td>BP-328-1</td><td>Utilisé dans 2x milieu de culture cellulaire.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Cellgro</td><td>25-050-CL</td><td></td></tr><tr><td>Filtres stériles</td><td>Fisher</td><td>09-761-126</td><td>Utilisé pour filtrer stérilement 2x milieu.</td></tr><tr><td>Réactif de lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>18324-020</td><td>Utilisé dans le dosage de la luciférase PPAR-RE.</td></tr><tr><td>Plaques à 6 puits traitées</td><td></td><td></td><td></td>par culture tissulaire</tr><tr><td>37 &#176 ; C/5 % CO2 Incubateur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemi-Doc Imager</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Utilisé pour prendre des photos des colonies.</td></tr><tr><td>Quantité Un logiciel</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Utilisé pour compter les colonies de cellules.</td></tr><tr><td>Tubes coniques de 15 ml Tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>coniques de 50 ml Erlenmeyer</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>250 ml Flacons</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micro-ondes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Pipettes <td></td><td></td><td></td><td>sérologiques de 5 ml</td></tr><tr><td>Aide à</td><td></td><td></td><td></td>la pipette</tr><tr><td>Micropipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hémacytomètre avec couvercle slip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pointes</td><td></td><td></td><td></td>de pipette</tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td>à lumière inversée</tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gants</td><td></td><td></td><td></td>résistants à la chaleur</tr><tr><td>Saran Wrap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seau</td><td></td><td></td><td></td> à glace</tr></tbody></table>

la formation de dosage souple agar colony

The Soft Agar Colony Formation Assay

La croissance indépendante de l’ancrage est la capacité des cellules transformées à croître indépendamment d’une surface solide, et est une caractéristique de la cancérogenèse. L’essai de formation de colonies de gélose molle est une méthode bien établie pour caractériser cette capacité in vitro et est considéré comme l’un des tests les plus rigoureux pour la transformation maligne dans les cellules. Ce test permet également une évaluation semi-quantitative de cette capacité en réponse à diverses conditions de traitement. Ici, nous démontrerons le test de formation de colonie de gélose molle à l’aide d’une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire murin, CMT167, pour démontrer les effets suppresseurs de tumeurs de deux membres de la voie de signalisation Wnt, Wnt7A et Frizzled-9 (Fzd-9). La surexpression concomitante de Wnt7a et de Fzd-9 a provoqué une inhibition de la formation de colonies dans les cellules CMT167. Cela montre que l’expression du ligand Wnt7a et de son récepteur Frizzled-9 est suffisante pour supprimer la croissance tumorale dans un modèle de carcinome pulmonaire murin.

L'expression de Wnt7a et Fzd9 dans CMT167 cellules est efficace dans la suppression des tumeurs, comme illustré par notre essai de formation de colonies sur gélose molle. Préalablement, nous avons utilisé Q-PCR pour montrer que WNT7A et Fzd9 ARNm sont exprimés dans de faibles niveaux dans CMT167 cellules. CMT167 cellules ont montré de faibles niveaux de Wnt7a endogène et Fzd9 par rapport aux cellules MLE-12, une lignée de cellules épithéliales pulmonaires murines transformées par SV40 (figure 1). Nous a...

Le test de formation de colonies de gélose molle est une méthode utilisée pour confirmer in vitro la croissance indépendante de l’ancrage cellulaire. L’objectif de ce protocole est d’illustrer une méthode rigoureuse pour la détection du potentiel tumorigène des cellules transformées et des effets suppresseurs de tumeurs des protéines sur les cellules transformées.

La formation de dosage souple Agar Colony

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft ...

L’objectif global de cette procédure est de quantifier la croissance indépendante de l’ancrage cellulaire. Pour ce faire, il suffit d’abord de déposer une couche de gélose sur la plaque de culture cellulaire et de la laisser durcir. La deuxième étape consiste à plaquer un mélange de cellules dans de la gélose sur le dessus de la couche de gélose précédente.Ensuite, les cellules sont autorisées à former des colonies sur une période de quelques semaines. La dernière étape consiste à colorer les colonies pour la visualisation et la quantification. En fin de compte, le test de formation de colonie de gélose molle est utilisé pour montrer la croissance indépendante d’Anchorage comme indication de la transformation cellulaire.Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes, telles que le test de Clon genig, est que le test de formation de colonies de gélose molle nécessite que les cellules forment des colonies de manière indépendante d’Anchorage. Commencez la procédure en étiquetant chaque puits d’une culture tissulaire traitée. Plaque à six puits appropriée pour chaque lignée cellulaire ou condition étudiée.Ensuite, préparez deux milieux de culture Xcel en dissolvant un gramme de milieu en poudre et 0,2 gramme de bicarbonate de sodium dans l’eau déminéralisée jusqu’à un volume final de 50 millilitres. Passez ce fluide à travers un filtre de 0,2 micron. Ajouter des composants supplémentaires nécessaires à la culture normale de la lignée cellulaire d’intérêt.Par exemple, cultivez la lignée cellulaire CMT 1 67 dans un milieu RPMI 1640 complété par une solution de streptomycine à 10 % de FBS et à 1 % de pénicilline. Réchauffer à 37 degrés Celsius dans un bain d’eau chaude avant utilisation. Préparez maintenant un milieu de culture Xcel.Préparez ensuite 1 % de gélose noble en ajoutant un gramme de gélose noble à 100 millilitres d’eau déminéralisée. Après cela, préparez 0,6 % de gélose noble en ajoutant 0,6 gramme de gélose noble à 100 millilitres d’eau déminéralisée. Ensuite, autoclavez les mélanges de gélose noble.Par la suite, préparez une solution mère de chlorure de nitro blue tetra oleum d’un milligramme par millilitre dans un XPBS dans le but de colorer les colonies. Dans cette procédure, passez au micro-ondes la bouteille de gélose noble à 1 % pendant environ une à deux minutes tout en chauffant au micro-ondes. Surveillez attentivement la solution pour éviter qu’elle ne déborde.Continuez ensuite à chauffer et à mélanger par intermittence jusqu’à ce que la gélose soit complètement dissoute et que la solution soit claire. Après cela, placez la solution de gélose fondue et le milieu de culture Prewarm two x dans un seau à glace rempli de 42 degrés Celsius. Eau du robinet.De plus, placez un tube conique de 50 millilitres dans un porte-tube dans le seau à glace avec de l’eau chaude. Ensuite, transférez le seau dans le capot de culture cellulaire. Ajoutez ensuite six millilitres de milieu de culture et six millilitres de la solution de gélose noble à 1 % dans le tube conique de 50 millilitres.Pipette de haut en bas plusieurs fois pour mélanger. Travailler à un rythme soutenu empêchera le durcissement prématuré de l’agar-agar. Ensuite, prélevez environ 5,5 millilitres de mélange à l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres.Laissez les bulles d’air remonter vers le haut de la colonne de pipette. Déposez ensuite 1,5 millilitre du mélange dans chaque puits et évitez le dépôt de bulles d’air. Couvrez la plaque et laissez le mélange de gélose se solidifier dans la hotte de culture cellulaire à température ambiante pendant 30 minutes.Tout d’abord, récoltez les cellules à l’aide de trypsine et diluez-les d’un à cinq en culture, dans un tube conique de 15 millilitres. Comptez les cellules et calculez le nombre de cellules nécessaires par puits pour préparer une suspension cellulaire finale à ce moment-là. Ensuite, faites fondre une solution de gélose à 0,6 % au micro-ondes.Placez-le dans un seau à glace contenant de l’eau chaude avec un tube conique de 50 millilitres dans un support de tube et la suspension finale de la cellule. Transférez ensuite le seau à glace avec de la gélose fondue à 0,6 % dans le capot de culture cellulaire pour les étapes suivantes. Pour préparer un volume total de 12 millilitres de suspension cellulaire pour une plaque à six puits, il faut d’abord pipeter six millilitres de suspension cellulaire dans le tube conique de 50 millilitres.Ajoutez ensuite six millilitres de gélose à 0,6 % dans le tube. Maintenez le mélange à 42 degrés Celsius pour éviter un durcissement prématuré et pour maximiser la survie cellulaire. Ensuite, pipetez le mélange rapidement, deux à trois fois pour répartir les cellules.Prélevez 5,5 millilitres de mélange à l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres et laissez les bulles d’air remonter vers le haut de la colonne de pipette. Déposez ensuite 1,5 millilitres du mélange dans chacun. Laissez le mélange de gélose cellulaire se solidifier à température ambiante dans la hotte de culture cellulaire pendant 30 minutes avant de le placer dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 degrés Celsius.Ajoutez 100 microlitres de milieu de croissance sur la couche supérieure de gélose deux fois par semaine pour éviter la dessiccation et prévoyez environ 21 jours pour une formation adéquate des colonies. Pour colorer les cellules, ajoutez 200 microlitres de solution de chlorure de nitro blue tetra oleum dans chaque puits et incubez la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Une fois les colonies colorées, prenez des photos des puits à l’aide de l’imageur et comptez les colonies à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.Voici le test de formation d’une colonie de gélose molle d’un vecteur exprimant les cellules CMT 1 67 LNCX LPC X et CMT 1 67 LL a dépassé de sept un neuf frisé sur les cellules exprimées. Le vecteur exprimant les cellules CMT 1 67 L et CXL PC X et CMT 1 67 LL a été sept a f frisotté. Neuf cellules surexprimant ont été plaquées dans un essai de formation de colonie de gélose molle CMT 1 67 LL est allé sept frisés neuf cellules ont montré une diminution marquée de la formation de colonie Après son développement.Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur le cancer pour explorer la transformation cellulaire in vitro. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer les cellules pour une croissance indépendante d’Anchorage.

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L'applicabilité du test clonogénique pour évaluer la viabilité de la reproduction a été mis en place depuis plus de 50 ans. Ici, nous démontrons la procédure générale pour réaliser le dosage clonogénique de cellules adhérentes.

Test clonogénique: cellules adhérentes

Lorsque vous travaillez avec les médias et des réactifs utilisés pour les micro-organismes de la culture, une technique aseptique doit être pratiqué afin d'assurer la contamination est réduit au minimum. Une variété de méthodes de placage sont couramment utilisés pour isoler, de propager ou de bactéries et de phages énumérer, toutes les procédures qui incorporent qui maintiennent la stérilité des matériaux expérimentaux.

Techniques de laboratoire aseptiques: Méthodes de placage

Cette vidéo décrit un test de formation de colonie de gélose molle pour tester les effets d’un inhibiteur de l’enzyme PADI et de la BB-Cl-amidine sur la tumorigénicité du cancer du sein in vitro. Ce test permet également d’évaluer quantitativement le potentiel de transformation cellulaire dans le contexte de perturbations génétiques.

Essai de formation de colonies de gélose molle : une méthode pour tester les effets de nouveaux composés sur la prolifération des cellules cancéreuses

Cette vidéo décrit le test de formation de colonies, qui aide à déterminer la capacité des cellules cancéreuses du poumon à proliférer indéfiniment et à former des colonies individuelles. Nous pouvons analyser l’effet d’un agent anticancéreux sur les cellules formant des colonies en analysant les changements dans le nombre et/ou la taille des colonies résultantes.

Essai de formation de colonies : évaluation de l’efficacité des agents anticancéreux sur les cellules cancéreuses du poumon formant des colonies

Source : Cayron, J., et Lesterlin, C. Analyse multi-échelle de la croissance bactérienne sous traitements de stress. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo montre la procédure d’évaluation de la filamentation d’E. coli et de la réplication de l’ADN dans le cadre d’un traitement antibiotique inhibiteur de la division cellulaire à l’aide d’un placage pour mesurer la viabilité et d’une cytométrie en flux pour analyser la taille des cellules et le contenu en ADN.

Évaluation de la filamentation induite par les antibiotiques chez E. coli à l’aide du dosage du placage et de la cytométrie en flux

Source : Temkin, M. I. et al. Tests de co-culture à haut débit pour l’étude des interactions microbiennes. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo montre un test in vitro visant à étudier les interactions microbiennes entre Corynebacterium propinquum et Staphylococcus en coculture.

Un test in vitro pour étudier les interactions microbiennes en co-culture

Les protéines interagissent entre elles et ces interactions déterminent en grande partie leurs fonctions. Les partenaires d’interaction protéique peuvent être identifiés à haut débit in vivo à l’aide d’un test de fitness chez la levure basé sur le test de complémentation de fragments de protéine dihydrofolate réductase (DHFR-PCA).

L&#39;échelle du génome interaction protéine-protéine Le dépistage par Protein-fragment complémentation Assay (PCA) dans les cellules vivantes

Ici, nous documentons l’utilisation du test de formation de colonie de gélose molle pour tester les effets d’un inhibiteur de l’enzyme peptidylarginine deiminase (PADI), BB-Cl-amidine, sur la tumorigénicité du cancer du sein in vitro.

L&#39;utilisation de l&#39;essai de formation souple Agar colonie à identifier des inhibiteurs de Tumorigénicité dans les cellules cancéreuses du sein

Les phénotypes de croissance de levure sont précisément mesurés par l’imagerie time-lapse très parallèle des cellules immobilisées se développent dans les microcolonies. Simultanément, la tolérance au stress, l’expression des protéines et la localisation des protéines peuvent être surveillées, générant des ensembles de données intégrés pour étudier comment les différences environnementales et génétiques, ainsi que l’hétérogénéité de l’expression génique entre les cellules isogéniques, modulent...

Imagerie en direct à haut débit des microcolonies pour mesurer l’hétérogénéité de la croissance et de l’expression des gènes

Cette méthode quantifie l’abondance microbienne à l’aide d’un format de plaque de 96 puits pour les unités formant colonie (UFC) et est appliquée au microbiome de la drosophile dans des échantillons d’homogénat de mouches entières. Les UFC sont comptées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images automatisé fourni ici.

Comptage rapide des unités formant des colonies sous forme de plaque à 96 puits appliqué au microbiome de la drosophile

Un protocole est décrit pour la préparation d’un écosystème modèle simple qui recrée le gradient de compteur méthane-oxygène trouvé dans l’habitat naturel des bactéries oxydantes de méthane aérobies, permettant l’étude de leur physiologie dans un contexte spatialement résolu. Les modifications apportées aux essais biochimiques courants pour l’utilisation avec l’écosystème modèle à base d’agarose sont également décrites.

Écosystème modèle à base d’agarose pour la culture de méthanotrophes dans un contre-gradient méthane-oxygène

Apprenez l'essai de formation de colonies en agar mou pour quantifier la croissance indépendante de l'ancrage des cellules transformées. Cette méthode permet d'évaluer le potentiel tumorigène et les effets des protéines suppresseurs de tumeurs.

La formation de dosage souple Agar Colony

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