La culture de cellules de mammifères en utilisant un système pneumatique bioréacteur à usage unique

L’objectif global de cette procédure est de cultiver de grandes quantités de cellules de mammifères. Pour ce faire, il faut d’abord calibrer le pH et l’oxygène dissous ou les sondes d’oxyde de sodium, puis autoclaver le pH, les sondes d’oxygène et le manchon de la sonde de température. La deuxième étape consiste à insérer les sondes et le manchon dans la cuve et à positionner la cuve sur le bioréacteur et à connecter l’échappement, le filtre, les conduites de gaz et la sonde de température.

L’étape suivante consiste à connecter les câbles d’oxygène dissous et de pH et à connecter de manière aseptique le fluide et les micro-porteurs qui sont pompés dans le bioréacteur. La dernière étape consiste à démarrer les contrôleurs pour s’assurer que le bioréacteur atteint la vitesse de la roue, la température et la saturation en oxygène souhaitées. En fin de compte, après l’inoculation et la surveillance informatique, la culture peut être traitée pour l’extraction et la purification du produit souhaité.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le bioréacteur à cuve d’agitation réutilisable est que le bioréacteur à roue pneumatique est facile à utiliser et minimise les risques de contamination microbienne. Commençons. Pour commencer le protocole, connectez-vous à l’écran hello.

Ensuite, inspectez la sonde de pH et confirmez que l’extrémité de la sonde est remplie de solution électrolytique. Procurez-vous un bécher avec une solution de pH quatre, un autre bécher avec une solution de pH sept et un flacon toilette avec de l’eau distillée. Connectez ensuite le câble de pH à la sonde de pH.

Accédez à l’onglet actions de l’interface hello, sélectionnez calibrer. Sélectionnez ensuite l’onglet PHA et l’étalonnage en deux points. Entrez la température du tampon dans le champ de température de la solution d’étalonnage.

Placez la sonde dans la solution de pH quatre pour l’étalonnage Entrez la valeur dans le champ zéro. Une fois le graphique stabilisé, poussez, calibrez et rincez la sonde de pH avec de l’eau distillée. Répétez l’étalonnage pour le pH sept et enregistrez les paramètres.

Entrez la valeur du tampon dans le champ span et attendez que le greffon se stabilise. Pour commencer l’oxygène dissous ou effectuer l’étalonnage. Assurez-vous que le capteur d’oxygène dissous est connecté au système depuis plusieurs heures et qu’il a été polarisé dans l’onglet d’étalonnage, sélectionnez DOA et étalonnage en deux points.

Déconnectez le capteur d’oxygène dis. Entrez zéro dans l’onglet zéro et attendez que le graphique se stabilise. Avant de sélectionner l’étalonnage, reconnectez le capteur d’oxygène et entrez 100 dans le champ Span.

Lorsque le graphique se stabilise, cliquez sur calibrer deux. Enregistrez ensuite les paramètres et fermez le programme. Après l’étalonnage, placez les capteurs et le puits thermique dans des sachets d’autoclave et autoclavez-les pendant 30 minutes à 121 degrés Celsius et 15 PSI.

Une fois l’autoclave terminé, désinfectez les sachets de l’autoclave avec de l’alcool isopropylique à 70 % et transférez-les dans une enceinte de sécurité biologique ou une ESB. Désinfectez et introduisez le récipient de réactif dans l’ESB. Retirez l’emballage intérieur et vérifiez que le récipient et le tube ne sont pas endommagés.

Ensuite, installez le capteur d’oxygène dissous dans l’orifice avant gauche du récipient de réactif et le puits thermique dans l’orifice arrière gauche. Installez le capteur de pH dans le port avant droit à installer. Ouvrez le capuchon du capteur et vissez-le légèrement dans l’orifice situé sur le dessus du récipient.

Transférez ensuite le navire hors de l’ESB. Assurez-vous que les câbles des sondes de pH et d’oxygène dissous se trouvent à l’extérieur du manchon du récipient et que rien ne se trouve à l’intérieur du manchon. Tenez le récipient de manière à ce que vous soyez face à l’avant et glissez le récipient les pieds en premier dans le manchon.

Assurez-vous que le fond du récipient repose sur les radiateurs. Installez ensuite soigneusement le capteur de température dans le système thermique de la cuve. Puits. Ensuite, retirez les jeux de tubes du sac.

Faites correspondre le code couleur sur le tube aux connecteurs et pompes correspondants sur l’unité de commande du bioréacteur. Acheminez les lignes d’ajout de média et d’échantillonnage derrière le capteur d’oxygène dissous et le thermique. Bien insérez le tube dans la pompe à code couleur sur le côté gauche du bioréacteur.

Connectez les conduites de gaz principale et micro. Appuyez sur le connecteur de la conduite de gaz principale dans sa sortie de gaz pour installer la conduite de gaz principale. Ensuite, tournez le connecteur de la micro conduite de gaz dans le sens des aiguilles d’une montre dans sa sortie de gaz Pour installer la micro conduite de gaz.

Pour installer le tube du four à filtre, ouvrez le four à filtre et fixez le tube du filtre d’échappement à l’uan. Assurez-vous que le tube passe à travers les deux crochets du filtre et sort du four. Acheminez la ligne du bas à travers le crochet au bas du four à filtre et fermez la porte.

Connectez ensuite les câbles aux sondes d’oxygène dissous et de pH. Une fois l’installation terminée, établissez une connexion stérile à l’aide de raccords de leurre entre une ligne d’édition moyenne inutilisée et la source du sac de bouteille moyenne. Accédez à l’onglet actions de l’interface Hello.

Cliquez sur Pompes de contrôle, sélectionnez Pompe de fluide, puis cliquez sur le curseur pour allumer la pompe de fluide. Ajoutez ensuite 1,5 à 3,0 litres de média et cliquez sur le curseur pour éteindre la pompe. Le système est maintenant prêt à pomper des micro-transporteurs préalablement préparés dans le réacteur.

Ceux-ci peuvent être ajoutés à l’aide d’une ligne d’addition. Fixez la bouteille MICROCAR à la ligne d’ajout appropriée à l’aide d’un verrou de leurre stérile. Allumez la pompe d’appoint dans l’écran de la pompe de commande.

Après l’ajout des micro-supports, éteignez la pompe à l’aide du curseur, revenez à l’écran principal de l’interface hello, sélectionnez les actions, puis avancez. Sélectionnez le contrôleur approprié pour modifier les paramètres. Réglez les contrôleurs sur auto et entrez les points de consigne.

Après avoir réglé les contrôleurs, allumez la pompe à air. Regardez à l’intérieur de la cuve du réactif pour vous assurer que la roue pneumatique tourne. Assurez-vous que le capteur d’oxygène dissous est complètement polarisé et que la valeur d’oxygène dissous s’est stabilisée.

Calibrez ensuite la forme du capteur d’oxygène dis, une connexion stérile entre une ligne d’addition de milieu inutilisée identifiée par une bande orange et la source du sac de la bouteille de cellule à l’aide de raccords de leurre. Ensuite, installez la section en silicone du tube dans la pompe à fluide. Assurez-vous que le collier de serrage est ouvert et que le collier de serrage de tube ramifié est fermé.

Accédez à l’onglet de la pompe de commande, puis allumez la pompe de fluide. Ajoutez les cellules et éteignez la pompe de fluide. Après l’inoculation, accédez à l’onglet Actions et sélectionnez Prélever l’échantillon.

Assurez-vous que le tube d’échantillonnage se trouve dans la pompe d’échantillonnage et manipulez le robinet d’arrêt d’échantillonnage conformément aux instructions à l’écran. Retirez la seringue avec l’échantillon pour le comptage des cellules et d’autres applications en aval effectuent le comptage des cellules. Enfin, lorsque les cellules ont atteint la densité souhaitée de 1,2 fois 10 à six cellules par millilitre, une septique ajoute l’inoculum du virus à une seringue de 20 millilitres.

Connectez la seringue à un orifice d’ajout de rechange sur le réacteur. Utilisez l’écran de la pompe de contrôle pour allumer la pompe d’addition et ajouter l’inoculum du virus. La majorité des cellules A 5 49 ont adhéré aux micro-porteurs en deux heures.

Après 12 heures, les cellules ont montré des signes d’aplatissement et d’étalement à la surface de la microvoiture. Au bout de 24 heures, les microporteurs présentaient une distribution uniforme des cellules. La colonisation des microcars se fait rapidement, comme on le voit ici.

Le pourcentage de colonisation par une microvoiture par 54 9 cellules est de 75 % par 24 heures. Ce graphique montre le nombre de cellules viables a 54 9 en culture avant et après l’infection par l’adénovirus. Les cellules continuent de croître de façon exponentielle jusqu’à 1 million de cellules par millilitre après 48 heures.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’assembler et de faire fonctionner un bioréacteur à roue pneumatique pour cultiver des cellules de mammifères à haute densité pour la production cellulaire ou protéique. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.