Name: Implantation de fibrine Gel sur la souris Lung pour étudier langiogenèse pulmonaire spécifique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Découvrez l'implantation de gels de fibrine sur le poumon de souris pour étudier l'angiogenèse et la régénération alvéolaire. Cette méthode permet d'analyser le microenvironnement pulmonaire et la formation vasculaire in vivo.

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Ce travail a été soutenu par des fonds de l&#39;American Heart Association (AM), US Department of Defense (BC074986), et de l&#39;hôpital Faculté Career Development Fellowship pour enfants de Boston (TM, AM). Les auteurs remercient Amanda Jiang Jiang et Elisabeth pour l&#39;assistance technique.

NOTE: L&#39;étude in vivo chez des animaux a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été examiné et approuvé par le soin et l&#39;utilisation des animaux du Comité Hôpital pour enfants de Boston (numéros de protocole: 13-10-2526R, 14-02-2568R). Tous les médicaments utilisés dans ce protocole sont de qualité pharmaceutique et ces médicaments sont préparés dans des conditions stériles. 1. Préparation de gel de fibrine <ol><li> Préparer un gel de fibrine contenant le VEGF et le bFGF. <ol><li> Décongeler les solutions mères de fibrinogène et de thrombine qui sont stockés à -80 ° C jusqu&#39;à la température ambiante (25 ° C). </li><li> Ajouter thrombine (concentration finale: 2,5 U / ml), CaCl2 (concentration finale: 45 mM), le VEGF (concentration finale: 0 à 100 ng / ml) et bFGF (concentration finale: 0 à 100 ng / ml) au fibrinogène solution (concentration finale: 12,5 mg / ml dans 0,9% sodium d&#39;une solution de chlorure de 43 à 45) dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Mélanger doucement par pipetage. </li><li> Pipette doucement 200 pi du mélange sur un plat de plastique stérile dans un mode goutte à goutte en utilisant la pointe de la pipette p200. </li><li> Incuber les gouttes à 37 ° C pendant 30-60 min jusqu&#39;à ce qu&#39;elles se solidifient. REMARQUE: le gel solidifié peut être maintenu dans la boîte en plastique scellé à la température ambiante (25 ° C) pendant plusieurs heures avant l&#39;implantation (figure 1a). </li></ol></li><li> Couper le gel de fibrine dans environ 3 x 3 x 3 mm en utilisant des cubes de petits ciseaux chirurgicaux avant l&#39;implantation. </li></ol> 2. Préparation de la souris <ol><li> Anesthetize souris adulte (8-12 semaines) par voie intraperitoneale (IP) injection de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) et confirmer que la souris est correctement anesthésiés par pincement de l&#39;orteil souris. <ol><li> Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux de la souris pour prévenir la sécheresse pendant l&#39;expérience. </li></ol></li><li> Shave fur sur le côté gauche de la cage thoracique de la souris. </li><li> Effectuer intubation endotrachéale de la souris. </li><li> Placez la souris sur l&#39;intubation tenir inclinée à 70 ° et maintenez la souris en place en accrochant ses incisives supérieures sur une petite bande de caoutchouc situé en haut de la tribune. </li><li> Rétracter doucement la langue d&#39;un côté en utilisant le forceps émoussé. </li><li> Visualiser le larynx à l&#39;aide d&#39;un col de cygne microscope illuminateur à fibre optique. </li><li> Insérez cathéter endotracheal élastique (21 G) dans la trachée. </li><li> Assurez-vous que la souris est spontanément respire de manière lisse (100-150 régulière respirations / min, aucune respiration paradoxale ou peu profonde). </li><li> Passer la souris en position couchée sous le microscope de dissection. </li><li> Ventiler mécaniquement la souris en utilisant un ventilateur de rongeurs (150 respirations / min et 7 ml / kg volume courant). </li><li> Comptez côtes pour localiser espace intercostal entre 4 ème et 5 ème côtes. </li><li> Créer un champ stérile sur la zone by essuyer soigneusement avec de l&#39;alcool et de Povidone-iode. Couvrir le champ opératoire de manière adéquate avec un champ opératoire stérile. </li></ol> 3. Chirurgie souris <ol><li> Après injection locale de bupivacaïne 0,25% (200 pi) dans la peau, faire une incision de la peau transversale (environ 1 cm de longueur) sur l&#39;espace intercostal l&#39;aide de ciseaux de dissection. </li><li> Après l&#39;injection de bupivacaïne 0,25% (200 pi) dans le muscle intercostal, faire une incision musculaire entre le 4 ème et 5 ème côtes fines à l&#39;aide de petits ciseaux. </li><li> Insérer une dissection écarteur entre les nervures de visualiser parfaitement le poumon gauche. <ol><li> Grattez une petite zone (1 x 1 mm carré) de la plèvre viscérale du centre du poumon gauche en utilisant une pince fine. </li><li> Appliquez une légère pression sur la zone à l&#39;aide d&#39;un coton-tige stérile jusqu&#39;à saignements et les fuites d&#39;air sont complètement contrôlés. </li><li> Mettez petite quantité de mélange frais de fibrinogène / thrombine (colle de fibrine) (étape 1.1.2. 20 &amp; #181; l) sur la zone en utilisant la pointe de la pipette p200. </li></ol></li><li> Placez délicatement une gel de fibrine (étape 1.2) en utilisant une petite pince sur la zone (figure 1b). <ol><li> Vérifiez que le gel est bien fixé sur la zone lors des mouvements respiratoires du poumon. </li></ol></li><li> Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y ait ni fuite aérienne massive, ni saignement du poumon. </li><li> Fermer incisions (muscle et la peau couches) avec suture absorbable, qui ne ont pas à être enlevés. </li><li> Aspirer la cavité thoracique en utilisant 27 aiguille G et seringue de 1 ml pour empêcher un pneumothorax. </li><li> Terminer ventilation mécanique. </li></ol> 4. Récupération souris <ol><li> Assurez-vous que la souris est spontanément respire de manière lisse (100-150 régulière respirations / min, aucune respiration paradoxale ou peu profonde). </li><li> IP injecter 1 ml de pré-chauffé NaCl à 0,9% pour éviter la déshydratation. </li><li> Laisser la souris pour récupérer sur le pavé de l&#39;eau chaude en circulation. </li><li> Retirez le endotracheal tube après confirmant que la souris a une respiration stable. </li><li> Injecter Meloxicam (5 mg / kg, injection sous-cutanée (SC), pour les trois jours que analgésique postopératoire. </li><li> Surveiller les mouvements de la souris attentivement à un minimum de 15 minutes d&#39;intervalle jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit sternale (capable de rouler sur son estomac et rester debout) et conscient. </li><li> Après la récupération, retourner la souris pour une nouvelle cage isolé de souris sans chirurgie. </li><li> Surveillez le site chirurgical pour des signes d&#39;infection (rougeur, enflure, écoulement), les fonctions biologiques fondamentaux de l&#39;animal (apport alimentaire et hydrique, la miction, la défécation, le gain de poids corporel) ainsi que des signes cliniques de détresse (horripilation, la locomotion réduite) jour après la intervention chirurgicale. </li></ol> 5. récolte du poumon <ol><li> 7 à 30 jours après l&#39;implantation, la souris en utilisant euthanasie CO 2 sous forme de source de gaz comprimé. </li><li> Faire une incision entre la pointe du processus xiphoïde et l&#39;sternaleencoche (de sternotomie médiane) et toute la récolte du poumon avec le gel implanté pour l&#39;analyse histologique et biochimique en coupant la trachée et disséquer toutes les connexions vers le cœur, les poumons et la trachée. </li><li> Fixer gel implanté avec poumon avec une solution de paraformaldéhyde 4% pendant une nuit à 4 ° C, incorporer dans le composé octobre, et de prendre sections étape série de 30 um d&#39;épaisseur. </li><li> Effectuer histologique (hématoxyline et éosine) et les analyses immunohistochimiques (de marqueur endothélial: CD31, un marqueur épithélial: aquaporine (AQP) 5 et la protéine tensioactif (SP) -B) en utilisant microscope confocal 22,37,40. </li><li> Compiler des piles de sections optiques (30 pm d&#39;épaisseur) pour former des images en trois dimensions de endotheliales du poumon et les cellules épithéliales image 3D en utilisant le logiciel d&#39;analyse 37. </li><li> Quantifier surfaces projetées des vaisseaux sanguins nouvellement formés en utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image 46. </li></ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Cet article présente une nouvelle méthode pour implanter biomatériaux sur la surface du poumon de souris adulte vivant. Avec ce système, l&#39;angiogenèse hôte poumon dérivé est récapitulé avec succès à l&#39;intérieur du matériau. Ce système permet aux chercheurs d&#39;explorer la diaphonie entre les cellules endotheliales, d&#39;autres cellules (par exemple, des cellules épithéliales, des cellules mésenchymateuses, des cellules immunitaires) et divers composants de l&#39;ECM qui sont nécessaires à l&#39;angio...

L&#39;objectif global de ce protocole est de présenter une méthode pour implanter gel de fibrine sur la surface du poumon de souris adultes, qui permet aux chercheurs de caractériser les mécanismes moléculaires de la vasculaire pulmonaire et le développement alvéolaire et de tirer parti de cette connaissance afin de développer les matériaux biomimétiques capables de récapituler vasculaire pulmonaire alvéolaire formation physiologique et pour traiter diverses maladies pulmonaires. Plus de 35 millions d&#39;Américains souffrent de maladies pulmonaires chroniques, y compris la maladie pulmonaire obstructive chronique et la fibrose pulmonaire. Ces patients ont des symptômes durables respiratoires chroniques tels que l&#39;essoufflement, oppression thoracique, toux tenace, et la fatigue, qui limitent de façon importante leur vie quotidienne 1-3. Malgré une grande quantité d&#39;efforts pour développer des thérapies efficaces pour ces maladies pulmonaires, il ne existe actuellement aucun remède; par conséquent, la qualité de vie de ces patients est médiocre et économique et les coûts humains sont salutgh 7.4. Actuellement, la transplantation pulmonaire est la seule façon de sauver les patients atteints de maladies pulmonaires chroniques en phase terminale. Toutefois, en raison de la pénurie de donneurs de greffe, le coût élevé, des complications graves, et le faible taux de survie 8-11, la transplantation ne est pas une approche optimale. Les récents progrès rapides des techniques d&#39;ingénierie tissulaire a permis aux chercheurs de bioingénieur poumon implantable par repeupler tout le poumon décellularisée avec différents types de cellules progénitrices ou cellules souches pluripotentes induites (iPS) 12,13. Cependant, ces poumons transgéniques sont fonctionnels chez les animaux hôtes que pendant quelques heures après l&#39;implantation 12,14,15. Utilisant biomatériaux pour régénérer les structures complexes et fonctions de poumons a également été assez infructueux. Cela peut être parce que les processus biologiques fondamentaux qui régissent adultes régénération du poumon ne ont pas été bien explorée. Dans le poumon, la formation du système vasculaire est l&#39;un des événements les plus précoces et les plus importants durile développement et la régénération 16-21 ng. Nouvellement formé vascularisations dans le poumon non seulement fournir de l&#39;oxygène, de nutriments et divers composants cellulaires nécessaires à la formation d&#39;organes, mais aussi fournir des signaux réglementaires instructifs aux cellules environnantes 22-25. Ainsi, l&#39;angiogenèse joue un rôle clé dans alvéolarisation régénérative dans les poumons adultes 24,26,27. En outre, l&#39;angiogenèse contribue à déréglementé maladies pulmonaires chroniques telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) 28, la dysplasie bronchopulmonaire (DBP) 21-23, et la fibrose pulmonaire 29. Ainsi, pour élaborer des stratégies plus efficaces pour l&#39;ingénierie poumons ou traiter les maladies pulmonaires chroniques, il est nécessaire de comprendre les mécanismes fondamentaux de l&#39;angiogenèse spécifique poumon. Chaque organe présente des propriétés mécaniques et chimiques uniques, qui peuvent différer entre les conditions physiologiques et pathologiques 30-33. Ces microenviron spécifique d&#39;organements régulent les comportements des cellules endotheliales et orchestrent la formation du réseau vasculaire d&#39;une manière spécifique d&#39;un organe 24,34-36. Ainsi, pour élaborer des stratégies plus efficaces pour la régénération du poumon, le mécanisme sous-jacent angiogenèse spécifique poumon doit être compris. Bien que des dosages classiques de l&#39;angiogenèse in vivo telles que sous-cutanée hydrogel implantation ont été largement utilisés pour la recherche de l&#39;angiogenèse 37 à 39, ces méthodes ne récapitulent angiogenèse spécifique d&#39;un organe. Récemment, un nouveau procédé pour implanter Matrigel dans un moule élastique sur le poumon de la souris a été développé et montré avec succès à recruter des vaisseaux sanguins et des cellules epitheliales pulmonaires dans les 22 gels. Cette approche unique permet aux chercheurs d&#39;explorer le mécanisme spécifique de l&#39;angiogenèse-poumon ainsi que les interactions entre les vaisseaux sanguins et des cellules pulmonaires non-vasculaires dans des conditions physiologiques et pathologiques. Depuis 1) Matrigel ne est pas adapté pour une application clinique; 2) l&#39;emoule lastic utilisé pour couler le gel peut affecter les interactions entre les hydrogels et les tissus pulmonaires d&#39;accueil et 3) le moule élastique sur le poumon provoque potentiellement altération de la fonction pulmonaire et des douleurs lors de la respiration, comme une approche plus cliniquement pertinente, une matrice de fibrine 3D contenant des facteurs angiogéniques (facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF) / facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF)) a été implanté dans le poumon de souris sans coulée dans le moule élastique, et a récapitulé avec succès hôte angiogenèse dérivé du poumon. gel de fibrine, les fibrilles de polymère provenant de la thrombine du fibrinogène clivé, est connu pour piéger une variété de facteurs angiogéniques tels que le VEGF et le bFGF à accélérer l&#39;angiogenèse in vivo 40,41. En raison de sa capacité de régénération et de la nature biodégradable 42, le gel de fibrine est largement utilisé dans le domaine de l&#39;ingénierie tissulaire. Cet article présente une approche nouvelle et unique d&#39;implanter gel de fibrine sur la surface du poumon des adul vivret souris et démontre que l&#39;hôte angiogenèse pulmonaire dérivé est récapitulé à l&#39;intérieur des gels in vivo. Cette méthode, qui permet aux chercheurs d&#39;étudier l&#39;angiogenèse spécifique poumon, sera probablement conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour divers types de maladies pulmonaires et de faire progresser de manière significative les efforts pour régénérer avec succès poumon adulte.

<table><tbody><tr><td>Fibrinogène du placenta humain</td><td>Sigma</td><td>F4883</td><td>Pour la fabrication de gel de fibrine</td></tr><tr><td>Thrombine à partir de plasma bovin</td><td>Sigma</td><td>T9549</td><td>Pour la fabrication de gel de fibrine</td></tr><tr><td>Souris recombinante VEGF 164</td><td>R& D</td><td>493-MV</td><td>Pour supplémentation en gel de fibrine</td></tr><tr><td>Souris recombinante bFGF</td><td>R& D</td><td>3139-FB</td><td>Pour supplémentation au gel de fibrine Support d’intubation</td></tr><tr>pour<td>rongeurs</td><td>Braintree Scientific INC</td><td>RIS 100</td><td>Pour l’intubation</td></tr><tr><td>Source lumineuse à fibre optique</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-35</td><td>Pour l’intubation</td></tr><tr><td>21 G Cathéter élastique</td><td>B.Braun</td><td>4251652-02</td><td>Pour l’intubation</td></tr><tr><td>MiniVent Ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>CGS-8009</td><td>Pour ventilation</td></tr><tr><td>Stemi DV4 Stéromicroscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-070-515</td><td>Pour la chirurgie</td></tr><tr><td>Suture absobable</td><td>Ethicon</td><td>PDP304</td><td>Suture chirurgicale</td></tr><tr><td>Anticorps contre CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>Immunohistochimie</td></tr><tr><td>Anticorps contre AQP5</td><td>Abcam</td><td>AB78486</td><td>Immunohistochimie</td></tr><tr><td>Anticorps contre SP-B</td><td>Abcam</td><td>AB40876</td><td>Immunohistochimie</td></tr></tbody></table>

implantation de fibrine gel sur la souris lung pour étudier l&#39;angiogenèse pulmonaire spécifique

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Les récents progrès significatifs dans les techniques de recherche sur les cellules souches et génie biologique ont fait de grands progrès dans l&#39;utilisation de biomatériaux pour régénérer et réparer les dommages dans les tissus simples dans les domaines orthopédique et parodontales. Cependant, les tentatives pour régénérer les structures et les fonctions des organes (3D) en trois dimensions plus complexes tels que les poumons ne ont pas eu beaucoup de succès parce que les processus biologiques de la régénération d&#39;organes ne ont pas été bien explorée. Il devient clair que l&#39;angiogenèse, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins, joue un rôle clé dans la régénération des organes. Vascularisations nouvellement formé non seulement fournir de l&#39;oxygène, de nutriments et de divers composants cellulaires qui sont requis pour la régénération des organes, mais également à fournir des signaux instructifs régénération des tissus locaux. Par conséquent, pour régénérer avec succès dans les poumons d&#39;un adulte, il est nécessaire de rappeler les micro-environnements spécifiques au poumon dans lequel l&#39;angiogenèse lecteurs régénération des tissus pulmonaires locaux. Bien que conventional essais in vivo de l&#39;angiogenèse, telles que l&#39;implantation sous-cutanée de la matrice extracellulaire (ECM) riche en hydrogels (par exemple, la fibrine ou collagène gels ou Matrigel - mélange de protéines d&#39;ECM sécrétée par des cellules de sarcome Engelbreth-Holm-Swarm souris), sont largement utilisés pour explorer la mécanismes généraux de l&#39;angiogenèse, l&#39;angiogenèse spécifique poumon n&#39;a pas été bien caractérisé parce que les méthodes d&#39;implantation orthotopique de biomatériaux dans les poumons ne ont pas été bien établie. L&#39;objectif de ce protocole est de présenter une méthode unique pour implanter gel de fibrine sur la surface du poumon de souris vivant adulte, permettant la réexposition succès de l&#39;hôte angiogenèse pulmonaire dérivés à l&#39;intérieur du gel. Cette approche permet aux chercheurs d&#39;explorer les mécanismes par lesquels le microenvironnement spécifique poumon Contrôles angiogenèse et la régénération alvéolaire dans les deux conditions normales et pathologiques. Depuis biomatériaux implantés libération et fournir des signaux physiques et chimiques à l adjacentetissus ung, l&#39;implantation de ces biomatériaux sur poumon malade peuvent potentiellement normaliser les tissus malades adjacentes, permettant aux chercheurs de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour divers types de maladies pulmonaires.

Afin de déterminer si la formation vasculaire pulmonaire dérivées hôte est récapitulée à l'intérieur des biomatériaux implantés sur le poumon, des gels de fibrine complétées avec majeur facteurs angiogéniques VEGF et bFGF (0, 10 et 100 ng / ml chacun) ont été implantés sur la surface du poumon de souris vivant que ont déclaré utiliser Matrigel 22. des gels de fibrine 47 qui contiennent ces facteurs de croissance angiogéniques ont été fabriquées conformément à la figure 1a. Après th...

La récapitulation du microenvironnement spécifique à l’organe, qui stimule l’angiogenèse locale, est indispensable pour une régénération réussie des tissus endommagés. Ce rapport fait la démonstration d’une nouvelle méthode pour implanter des gels de fibrine à la surface pulmonaire d’une souris vivante afin d’explorer comment le microenvironnement spécifique aux poumons module l’angiogenèse et la régénération alvéolaire chez la souris adulte.

Implantation de fibrine Gel sur la souris Lung pour étudier l&#39;angiogenèse pulmonaire spécifique

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

L’objectif global de la procédure suivante est d’utiliser l’implantation de gel de fibrine pour étudier la régénération vasculaire et alvéolaire dans le poumon de la souris. Ceci est accompli en préparant d’abord des gouttes de gel de fibrine, complétées par des facteurs angiogéniques. Dans un deuxième temps, l’animal de laboratoire est ventilé mécaniquement et le coffre est ouvert.Ensuite, un gel de fibrine est soigneusement fixé au poumon de la souris avec de la colle de fibrine. Ensuite, dans la dernière étape, le poumon et le gel implanté sont prélevés sept à 30 jours plus tard pour une analyse histologique. En fin de compte, la formation des vaisseaux sanguins et des alvéolaires à l’intérieur de l’implant de gel peut être évaluée par une analyse immunohistochimique.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie vasculaire, telles que comment les organes risquent le microenvironnement, contrôlent l’angiogenèse et la morphogenèse des organes. Pour préparer des gels de fibrine contenant à la fois du VEGF et du BFGF, commencez par réchauffer moins 80 degrés Celsius, des stocks de fibrinogène et de thrombine à température ambiante. Lorsque les stocks sont complètement décongelés, ajoutez de la thrombine, du chlorure de calcium VEGF et BFGF à la solution de fibrinogène dans un tube de 1,5 millilitre. Et puis mélangez la solution par pipetage.Ensuite, pipetez doucement 200 microlitres du mélange, goutte à goutte sur un plat en plastique stérile. Incuber les gouttes à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes jusqu’à ce qu’elles se solidifient. Ensuite, utilisez de petits ciseaux chirurgicaux pour couper les gels en cubes d’environ trois par trois par trois millimètres.Après avoir confirmé la sédation complète chez une souris de huit à 12 semaines par pincement des orteils, couvrez les yeux de l’animal avec une pommade vétérinaire pour prévenir la sécheresse, puis rasez la fourrure sur le côté gauche de la cage thoracique. Pour l’intubation endotrachéale, placez la souris sur un support d’intubation incliné à 70 degrés et accrochez les incisives supérieures sur un petit élastique situé en haut du support pour maintenir l’animal en place. À l’aide d’une pince émoussée, rétractez doucement la langue d’un côté, puis visualisez le larynx à l’aide d’un illuminateur de microscope à col de cygne à fibre optique.Ensuite, insérez un cathéter élastique endotrachéal de calibre 21 dans la trachée. Vérifiez que la souris respire spontanément et doucement, puis placez l’animal en position couchée sous le microscope de dissection. À l’aide d’un ventilateur pour rongeurs, l’animal peut ventiler mécaniquement à 150 respirations par minute et sept millilitres par kilogramme de volume courant.Ensuite, comptez les côtes pour localiser l’espace intercostal entre la quatrième et la cinquième côte. Ensuite, essuyez soigneusement la zone avec de l’alcool et de la povidone iodée pour créer un champ stérile et couvrez la zone chirurgicale avec un tra stérile pour placer le gel sur le poumon. Ensuite, faites une incision cutanée transversale d’un centimètre sur l’espace intercostal.Et puis faites une incision musculaire entre la quatrième et la cinquième côte. Insérez un écarteur de dissection entre les côtes pour visualiser complètement le poumon gauche, puis utilisez des pinces fines pour gratter un carré d’un millimètre de plèvre viscérale du centre du poumon gauche à l’aide d’un coton-tige stérile. Ensuite, appliquez une légère pression sur la zone jusqu’à ce que les saignements et les fuites d’air soient complètement contrôlés, puis versez une petite quantité de colle à la thrombine de fibrinogène non solidifiée sur la zone.Ensuite, placez doucement un gel de fibrine sur la colle et observez les mouvements respiratoires des poumons pour déterminer que le gel est bien fixé. Fermez ensuite les incisions avec une suture résorbable. Aspirez la cavité thoracique à l’aide d’une seringue d’un millilitre munie d’une aiguille de calibre 27 pour prévenir le pneumothorax, puis mettez fin à la ventilation mécanique.Après avoir vérifié que la souris respire bien, injectez un millilitre de chlorure de sodium d’avant-guerre à 0,9 % par voie intrapéritonéale pour prévenir la déshydratation et laissez la souris récupérer sur un coussin d’eau chaude en circulation. Une fois que l’animal présente une respiration stable, retirez la sonde endotrachéale et injectez un analgésique postopératoire. Lorsque l’animal est complètement rétabli, remettez-le dans une nouvelle cage isolée des souris sans chirurgie, en surveillant quotidiennement l’animal pour détecter des signes d’infection ou de complications.Sept à 30 jours après l’implantation, euthanasiez la souris selon le protocole et faites une incision entre l’extrémité de l’apophyse xiphoïde et l’encoche sternale. Ensuite, coupez la trachée en disséquant toutes les connexions du poumon au cœur et à la trachée, prélevez tout le poumon et le gel implanté, puis fixez le gel et le tissu pulmonaire dans une solution d’aldéhyde paraforme à 4 % pendant la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain, intégrez le tissu pulmonaire dans le composé OCT, puis collectez des sections en série du poumon et du gel à une épaisseur de 30 micromètres. Colorer les sections avec de l’hématine et de l’eoin et des anticorps contre les marqueurs d’intérêt appropriés.Ensuite, après avoir pris des images Zack des sections, compilez des piles de sections optiques pour former des images tridimensionnelles des cellules endothéliales et épithéliales pulmonaires. À l’aide d’un logiciel d’analyse d’images 3D. Enfin, quantifiez les zones projetées des vaisseaux sanguins nouvellement formés à l’aide du logiciel d’analyse d’images approprié.Sept jours après l’implantation, le gel de fibrine est incorporé dans le poumon de l’hôte La reconstruction 3D des images de fluorescence confocale a montré que les cellules endothéliales positives au CD 31 dérivées de l’hôte forment des réseaux vasculaires à l’intérieur des gels sept jours après l’implantation de manière dose-dépendante de la dose, de manière dépendante de la dose A-V-E-G-F-F-B-B-F, les cellules épithéliales pulmonaires de type 1 aquaporine cinq positives et de type 2 de la protéine tensioactive B positive sont également recrutées le long des vaisseaux sanguins nouvellement formés à l’intérieur des gels qui sont complétés avec des concentrations plus élevées de VGF et B, FGFH et d. La coloration des coupes histologiques révèle que d’autres types de cellules hôtes migrent également dans le gel sept jours après l’implantation. L’ensemble de ces résultats suggère que les réseaux vasculaires régénératifs dérivés du poumon de l’hôte et la formation alvéolaire sont construits avec succès à l’intérieur des gels de fibrine après une supplémentation en facteurs angiogéniques et une implantation à la surface du poumon de souris adulte après son développement.Cette technique a ouvert la voie à moins de chercheurs dans le domaine de la biologie pulmonaire et de la médecine primaire pour explorer le mécanisme de l’angiogenèse normale et comment elle se manifeste dans l’état pathologique des poumons de souris.

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Nous présentons ici un protocole pour l’implantation chirurgicale d’une fenêtre optique à demeure permanente pour le thorax murin, qui permet une imagerie intravitale à haute résolution du poumon. La permanence de la fenêtre la rend bien adaptée à l’étude des processus cellulaires dynamiques dans le poumon, en particulier ceux qui évoluent lentement, tels que la progression métastatique des cellules tumorales disséminées.

Une fenêtre permanente pour enquêter sur les métastases cancéreuses au poumon

Le manuscrit décrit une méthodologie pour l’établissement ainsi que le suivi longitudinal de la croissance des métastases pulmonaires spontanées à partir de tumeurs mammaires injectées orthotopiquement, susceptible d’intervention à tous les stades de la cascade métastatique.

In vivo Imagerie pour mesurer les métastases pulmonaires spontanées de cellules tumorales mammaires injectées orthotopiquement

Ici, nous présentons un protocole d’imagerie intravitale du poumon gauche de souris transplantée à l’aide de la microscopie à deux photons. Il s’agit d’un outil précieux pour étudier la dynamique cellulaire et les interactions en temps réel après une transplantation pulmonaire murine.

Microscopie intravitale à deux photons du poumon de souris transplanté

Cet article décrit comment créer des poumons de souris issus de la bio-ingénierie à l’aide de méthodes de décellularisation et de recellularisation. Il détaille également la transplantation pulmonaire orthotopique ultérieure.

Transplantation de poumon issu de la bio-ingénierie à l’aide de poumons de souris décellularisés et de cellules endothéliales humaines primaires

La thérapie cellulaire offre une intervention prometteuse pour la fibrose pulmonaire en utilisant des cellules progénitrices pour réparer les tissus endommagés et améliorer la fonction pulmonaire. Comme l’imagerie joue un rôle central dans le suivi de l’intégration cellulaire, nous décrivons ici le suivi in vivo de la thérapie cellulaire pour la fibrose pulmonaire guidé par l’imagerie par particules magnétiques dans un modèle murin.

Suivi in vivo guidé par l’image de cellules progénitrices de l’épithélium pulmonaire distal transplantées pour la fibrose pulmonaire à l’aide de l’imagerie par particules magnétiques

Découvrez l'implantation de gels de fibrine sur le poumon de souris pour étudier l'angiogenèse et la régénération alvéolaire. Cette méthode permet d'analyser le microenvironnement pulmonaire et la formation vasculaire in vivo.

Implantation de fibrine Gel sur la souris Lung pour étudier l'angiogenèse pulmonaire spécifique

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