Techniques expérimentales et d'imagerie pour examen caillot de fibrine Structures en normaux et malades Unis

L’objectif général de cette procédure est d’examiner les différences morphologiques dans les structures anormales des caillots qui se produisent dans le diabète et l’anémie falciforme, des conditions pathologiques pour les caillots diabétiques simulés. Ceci est accompli en imageant les structures des caillots glyqués par microscopie confocale pour des échantillons de sang de patients drépanocytaires. Les caillots de fibrine contenant des globules rouges sont imagés confocals en temps réel.

analyse microscopique peut ensuite être effectuée pour évaluer les taux de fibrinolyse sur les structures normales et glyquées des caillots. En fin de compte, cette analyse en temps réel peut être utilisée pour évaluer les différences morphologiques qui se produisent dans les structures anormales des caillots en réponse aux états pathologiques dans lesquels elles se produisent. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la thrombose et de l’hémostase, telles que : comment les structures du caillot de fibrine sont-elles différentes chez les patients atteints de diabète ou de drépanocytose.

Pour évaluer les caillots diabétiques simulés par microscopie confocale, décongelez d’abord le fibrinogène humain et le conjugué de fibrinogène humain marqué par fluorescence à 10 % à 37 degrés Celsius lorsque les solutions de fibrinogène réchauffées se mélangent au fibrinogène humain et au conjugué de fibrinogène dans une solution de chlorure de sodium de glucose trics et incuberez la solution à l’abri de la lumière dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Vers la fin de l’incubation, utilisez un adhésif non liquide pour fixer un adhésif mince sur les deux côtés d’une lame de microscope en verre pour faire une chambre, puis mélangez une solution de fibrinogène avec un facteur de température ambiante de 13 et de la thrombine jusqu’à un volume final de 50 microlitres, et transférez immédiatement 30 microlitres de la solution de fibrine dans la chambre de la lame de microscope. Placez maintenant une lamelle en verre de 22 x 22 millimètres avec un point de 15 millimètres d’épaisseur sur l’adhésif et scellez les côtés ouverts de la chambre avec un adhésif transparent en veillant à ce que l’adhésif n’interagisse pas avec le caillot.

Laissez les caillots de fibrine polymériser à 21 à 23 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, acquérez des images de microscopie confocale des caillots à l’aide d’un objectif 40x et d’un laser argon de 488 nanomètres pour évaluer les caillots de patients atteints de drépanocytose. Diluez d’abord l’échantillon de globules rouges à 1 million de cellules par millilitre dans un milieu de culture de cellules sans sérum, puis mélangez les cellules avec cinq microlitres de la solution de marquage cellulaire appropriée par pipetage doux.

Après 20 minutes à 37 degrés Celsius, lavez les cellules trois fois dans un milieu à 37 degrés Celsius pendant que les cellules sont dans la centrifugeuse mélanger le facteur de solution de fibrinogène 13 fraîchement préparé et la thrombine comme cela vient d’être démontré. Transférez ensuite 10 microlitres de globules rouges marqués dans la solution de fibrine et distribuez immédiatement 30 microlitres de la solution cellulaire dans une chambre adhésive. Sur une lame de microscope en verre, laissez la fibrine polymériser à 21 à 23 degrés Celsius après deux heures, acquérez des images confocales des caillots à l’aide de lasers d’excitation avec des longueurs d’onde de 488 nanomètres et 633 nanomètres pour exciter la fibrine et les globules rouges marqués par fluorescence respectivement.

Pour évaluer les taux de fibrinolyse et les structures des caillots glyqués, préparez d’abord les caillots glyqués, comme nous venons de le démontrer cette fois-ci. Cependant, après avoir distribué la solution de caillot de fibrine dans la chambre adhésive, ne scellez pas les extrémités de la chambre. Au lieu de cela, laissez les caillots polymériser à 21 à 23 degrés Celsius dans un contenant scellé contenant 250 millilitres d’eau pour éviter la déshydratation.

Après une heure et demie, acquérir des images des caillots par microscopie confocale comme nous venons de le démontrer. Ensuite, pipetez 25 microlitres de plasmine dans l’extrémité ouverte de la chambre et laissez la plasmine se disperser dans tout le caillot par capillarité. Enfin, ouvrez les fonctions de séries chronologiques du logiciel de microscope confocal, cliquez sur le mode d’acquisition et sélectionnez séries chronologiques.

Sélectionnez ensuite le nombre de cycles et l’intervalle de temps d’enregistrement pour capturer des séquences vidéo en temps réel de la lyse du caillot induite par la plasmine L’analyse des caillots normaux et glyqués révèle que les caillots glyqués sont plus denses avec des pores plus petits que les caillots normaux, avec et sans l’ajout du facteur 13 lors de la polymérisation du caillot. En effet, dans les caillots glyqués de l’ONU, il y a une concentration de fibrine plus faible, ce qui crée une structure moins dense que celle observée dans les caillots glyqués, qui contiennent une concentration de fibrine plus élevée. Les caillots de fibrine des patients drépanocytaires contiennent des globules rouges et présentent des structures plus denses que celles des caillots de fibrine sains en raison d’une concentration accrue de fibrinogène chez ces individus.

De plus, la tendance naturelle des globules rouges des patients drépanocytaires à former des agrégats et des sexes, des amas de globules rouges qui s’entrelacent dans le réseau de fibrine, entraînant la formation de structures de caillots aberrantes dont la morphologie est nettement différente de celle observée chez les patients normaux. Enfin, l’analyse des taux de fibrinolyse des caillots normaux par rapport aux caillots glyqués démontre une capacité significativement altérée des caillots diabétiques simulés à la fibrine lytique en l’absence de plasmine suffisante. Ces recherches contribueront à ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine de la thrombose et de l’hémostase, en particulier pour les patients qui développent des pathologies comorbides à la suite de la drépanocytose et du diabète.