Name: Techniques expérimentales et dimagerie pour examen caillot de fibrine Structures en normaux et malades Unis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Découvrez l'analyse morphologique des caillots sanguins dans le diabète et la drépanocytose par microscopie confocale. Cette méthode évalue les taux de fibrinolyse et révèle les différences structurales clés pour la recherche en thrombose.

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Les auteurs tiennent à remercier le laboratoire Lam de Georgia Tech pour les nombreuses discussions utiles qui ont permis de développer les tests expérimentaux. La recherche dont il est question dans cette publication a été financée par le National Heart, Lung, and Blood Institute des National Institutes of Health sous le numéro de bourse K01HL115486 et par la subvention New Innovator 1DP2OD007433-01 du Bureau du directeur des National Institutes of Health. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.

REMARQUE: Le protocole suivant est conforme aux orientations fixées par le Conseil d'examen institutionnel (IRB) à Georgia Tech. 1. Collecte de sang et de globules rouges Isolation procédure <ol><li> Recueillir 40 à 120 ml de sang provenant de donneurs dans 10 ml tubes Vacutainer héparinisés. Lancer PBMC (cellules mononucléées du sang périphérique) isolement au sein de quatre heures de la collecte. Pendant ce temps, maintenir le sang à température ambiante. REMARQUE: O / N stockage du sang en RT ou 4 ° C ne est pas recommandé car cela se traduira par un rendement plus faible CMSP. </li><li> Diluer sang total 1: 1 dans de la glace-froid (4 ° C) PBS stérile. </li><li> Pipette 10 ml de glace-froid polysaccharide hydrophile en un, 50 ml tube conique stérile vide. Transférer doucement sang total dilué sur le dessus du polysaccharide hydrophile. </li><li> Utiliser une pipette de 25 ml dans le sang et à prise lente de la pipette le long du côté du tube très lentement. Assurez-vous que le sang ne est pas mélangé avec le saccharide avant Centrifugation parce que le polysaccharide hydrophile est toxique pour les cellules et les autres, le rendement PBMC sera plus faible. </li><li> Centrifuger des échantillons de sang pour 30 min à 400 g à 4 ° C. Le cas échéant, réduire la vitesse de frein de la centrifugeuse à la moitié du maximum pour une meilleure séparation après centrifugation. </li><li> Aspirer la fraction plasma / plaquettes de l'échantillon de sang centrifugé. Aspirer soigneusement la couche de polysaccharide hydrophile directement au-dessus de la couche de RBC emballé. </li><li> Recueillir 8-10 ml de globules rouges emballés et diluer 1: 1 avec 0,9% de NaCl non stérile saline. </li></ol> 2. confocale Microscopie évaluation de glyquée Structures Clot (simulées diabétiques caillots) <ol><li> Dégivrage fibrinogène humain marqué par fluorescence et de fibrinogène humain conjugué à 37 ° C. </li><li> Pipetter le suivant dans un 0,5 ml tube gradué à centrifuger. <ol><li> Pour les caillots de fibrinogène, normaux en bonne santé, mélanger fibrinogène humain avec 10% marqué par fluorescence fibrinogène humainconjugué dans un tampon Tris 50 mM / NaCl 100 mM à une concentration de 5 mg / ml. </li><li> Pour fibrinogène glyquée artificiellement (pour simuler les caillots diabétiques), incuber fibrinogène humain et de 10% de fibrinogène marqué par fluorescence conjugué dans une solution à 5 mM de glucose dissous dans Tris / NaCl 100 mM 50 pour une concentration résultante de 6,8 mg / ml. </li></ol></li><li> Couvrir les tubes micro-centrifugeuse en utilisant un matériau opaque pour éviter l'exposition à la lumière. Incuber les tubes dans un bain d'eau à 37 ° pendant 48 heures. </li><li> Faites une chambre sur une lame de microscope en verre par l'apposition d'une mince adhésif sur 2 côtés de la lame. </li><li> Après la période d'incubation de 48 heures, préparer des réactifs pour la formation de fibrine par la thrombine et la décongélation FXIIIa alpha humain à TA. </li><li> Diluer FXIIIa à 80 U / ml dans un tampon 5 mM de CaCl 2. </li><li> Diluer la thrombine à 4 U / ml dans un tampon 5 mM de CaCl 2. <ol><li> Pour caillots normaux, se assurer que les concentrations finales de fibrinogène, FXIIIa, et la thrombine sont de 2,5 mg / ml, 20 U / ml et 1 U / ml, respectivement à un volume de 50 ul. </li><li> Pour les caillots glyquées, en sorte que les concentrations finales de fibrinogène, FXIIIa, et la thrombine sont 3,4 mg / ml, 20 U / ml, et 1 U / ml, respectivement à un volume de 50 ul. </li></ol></li><li> Immédiatement pipette 30 ul de la solution de fibrine dans la chambre formée par l'adhésif. </li><li> Placez un 22 mm x 22 mm lamelle de verre d'une épaisseur de 0,15 mm sur le dessus des deux couches d'adhésif. Sceller les côtés ouverts avec adhésif transparent pour empêcher le caillot de fibrine de se dessécher. Se assurer que l'adhésif ne interagit pas avec le caillot de fibrine. </li><li> Autoriser les caillots de fibrine polymériser à 21-23 ° C pendant 2 heures avant l'imagerie confocale. </li><li> Prendre des images de microscopie confocale des caillots utilisant un microscope confocal avec un objectif 40X / 1,30 huile M27 avec un laser à argon 488 nm. </li></ol> 3. microscopie confocale évaluation des caillots de fibrine contenant des hématies de patients Sickle Cell <ol><li> Dégivrage fibrinogène humain marqué par fluorescence et de fibrinogène humain conjugué à 37 ° C. </li><li> Pipetter le suivant dans un 0,5 ml tube gradué à centrifuger. <ol><li> Pour la bonne santé, un caillot de fibrine normale, mélanger le fibrinogène humain avec 10% de conjugué marqué par fluorescence du fibrinogène humain dans un tampon Tris 50 mM / NaCl 100 mM à une concentration de 5 mg / ml. </li><li> Pour les caillots contenant des globules rouges SCD, mélanger le fibrinogène humain et de 10% de conjugué marqué par fluorescence du fibrinogène humain dans un tampon Tris 50 mM / NaCl 100 mM de sorte que la concentration résultante du fibrinogène est de 10 mg / ml. </li></ol></li><li> Étiqueter les globules rouges isolés (à la fois normales et ceux provenant de patients drépanocytaires obtenues à partir du protocole d'isolement RBC) en utilisant une solution cellulaire étiquetage. <ol><li> Suspendre les cellules à une densité de 1 x 10 6 par ml dans un milieu de culture sans sérum choisi. </li><li> Ajouter 5 ul / ml de la suspension cellulaire à la solution de cellules étiquetage. Mélangez bien par pipetage doux doucement. </li><li incuber pendant min c.><li> Centrifuger les tubes de suspension marqués à 1500 rpm pendant 5 min à 37 ° C. </li><li> Retirer délicatement le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 37 ° C moyenne. </li><li> Répétez la procédure de lavage (3.3.4 et 3.3.5) deux fois de plus. </li></ol></li><li> Diluer FXIIIa à 80 U / ml dans un tampon 5 mM de CaCl 2. </li><li> Diluer la thrombine à 4 U / ml dans un tampon 5 mM de CaCl 2. <ol><li> Pour caillots normaux, en sorte que les concentrations finales de fibrinogène, FXIIIa, et la thrombine sont de 2,5 mg / ml, 20 U / ml, et 1 U / ml, respectivement à un volume de 50 ul. </li><li> Pour les caillots contenant SCD globules rouges, en sorte que les concentrations finales de fibrinogène, FXIIIa, et la thrombine sont de 5 mg / ml, 20 U / ml, et 1 U / ml, respectivement à un volume de 50 ul. </li></ol></li><li> Introduire à la pipette 10 ul des globules rouges marqués dans la solution de fibrine. Pipette 30 ul de la fibrine avec des hématies sur le verre de microscope (voir glisser préparation glycated caillots). </li><li> Laisser la fibrine polymériser à 21-23 ° C pendant 2 heures avant l'imagerie confocale. </li><li> Prenez images confocales des caillots à l'aide du microscope confocal, et d'utiliser des lasers d'excitation avec des longueurs d'onde de 488 nm et 633 nm pour exciter la fibrine marqué par fluorescence et de globules rouges. </li></ol> 4. microscopie confocale évaluation de la fibrinolyse Tarifs en glyquée Structures Clot <ol><li> Répétez le protocole de microscopie confocale de caillots glyquée (Protocole Step 2) pour l'évaluation du taux de la fibrinolyse dans caillots glyquée. </li><li> Ne pas fermer les extrémités de la chambre avec un adhésif clair. Laisser les caillots de fibrine à polymériser pendant 1,5 heures à 21-23 ° C dans une enceinte étanche contenant 250 ml d'eau pour éviter la déshydratation. </li><li> Après polymérisation, d'obtenir des images des caillots à l'aide du microscope confocal. </li><li> Pipette plasmine dans l'extrémité ouverte de la chambre et disperser la plasmine par l'intermédiaire du caillot par action capillaire. <ol><li> Pourles expériences de la fibrinolyse normales et avec des concentrations normales glyquées, pipette 25 ul à 200 pg / ml de plasmine dans l'ouverture de la chambre. </li><li> Pour les caillots glyquées, avec des concentrations réduites pipette 25 ul à 50 ug / ml dans l'ouverture de la chambre. </li></ol></li><li> Utilisez la fonction de séries chronologiques (voir la figure 1) dans le logiciel de microscope confocal à capturer en temps réel des séquences vidéo de la plasmine lyse du caillot. <ol><li> Cliquez sur le mode d'acquisition, puis sélectionnez «Time Series". Sélectionnez le nombre de cycles et l'intervalle de temps d'enregistrement. </li></ol></li></ol> 5. Calcul de la fibrinolyse Tarifs <ol><li> Déterminer le taux de lyse en définissant un espace (2500 um 2) et en calculant le temps écoulé nécessaire pour dissoudre une zone fixe du caillot. Calculer le taux de lyse à l'aide de l'équation suivante (figure 2): <img alt="Equation 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52019/52019eq1.jpg" files ftp_upload></li></ol> 6. Analyse statistique de la fibrinolyse Tarifs <ol><li> Analyser les données de lyse en utilisant un logiciel d'analyse statistique. Effectuer une analyse de variance à une voie et un post hoc de Tukey-Kramer 44,45 essai. </li></ol>

<ol><li>Averett, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+Fibrinogen+Model+that+Captures+the+Stress-Strain+Behavior+of+Fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers.</a> Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).</li>
<li>Carlisle, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+properties+of+individual%2C+electrospun+fibrinogen+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers.</a> Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).</li>
<li>Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+origins+of+the+mechanical+properties+of+fibrin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The molecular origins of the mechanical properties of fibrin.</a> Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).</li>
<li>Guthold, M., Cho, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+Unfolding+Mechanisms+Are+Not+Too+Much+of+a+Stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch.</a> Structure. 19, 1536-1538 (2011).</li>
<li>Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+fibrin+clots+II%3A+Linear+viscoelastic+behavior+in+shear+creep%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep.</a> Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).</li>
<li>Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+fibrin+clots.+v.+shear+modulus%2C+creep%2C+and+creep+recovery+of+fine+unligated+clots%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots.</a> Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).</li>
<li>Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+fibrin+clots.+I.%3A+Dynamic+viscoelastic+properties+and+fluid+permeation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation.</a> Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).</li>
<li>Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Origins+of+Fibrin+Clot+Rheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural Origins of Fibrin Clot Rheology.</a> Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).</li>
<li>Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+assembly.+Lateral+aggregation+and+the+role+of+the+two+pairs+of+fibrinopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides.</a> Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).</li>
<li>Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+properties+of+fibrin+for+basic+scientists+and+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians.</a> Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).</li>
<li>Wolberg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+generation+and+fibrin+clot+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Reviews%22%5BJournal%5D)">Thrombin generation and fibrin clot structure.</a> Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).</li>
<li>Wolberg, A. S., Campbell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+generation%2C+fibrin+clot+formation+and+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+and+Apheresis+Science%22%5BJournal%5D)">Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis.</a> Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).</li>
<li>Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructure+of+the+Fibrin+Clot%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nanostructure of the Fibrin Clot.</a> Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).</li>
<li>Dunn, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+fibrin+clot+structure+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Herz%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes.</a> Herz. 29, 470-479 (2004).</li>
<li>Gladwin, M. T., Sachdev, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+abnormalities+in+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).</li>
<li>Collet, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Fibrin+Architecture+Is+Associated+With+Hypofibrinolysis+and+Premature+Coronary+Atherothrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).</li>
<li>Carr, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus%3A+a+hypercoagulable+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+and+its+Complications%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus: a hypercoagulable state.</a> Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).</li>
<li>Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+disease+and+heritability+of+the+prothrombotic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state.</a> Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).</li>
<li>Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+physiology+and+pathology+of+fibrin+structure%2Ffunction%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Reviews%22%5BJournal%5D)">The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function.</a> Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).</li>
<li>American Diabetes Association. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.diabetes.org/">http://www.diabetes.org/</a> (2014).</li>
<li>Alzahrani, S., Ajjan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+article%3A+Coagulation+and+fibrinolysis+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+and+Vascular+Disease+Research%22%5BJournal%5D)">Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes.</a> Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).</li>
<li>Sickle Cell Disease Association of America, Inc. , 
 Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.sicklecelldisease.org/">http://www.sicklecelldisease.org/</a> (2014).</li>
<li>Stuart, M. J., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle-cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Sickle-cell disease.</a> The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).</li>
<li>Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+type+2+diabetes+on+fibrin+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function.</a> Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).</li>
<li>Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+involved+in+the+resistance+of+fibrin+to+clot+lysis+by+plasmin+in+subjects+with+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).</li>
<li>Famodu, A., Reid, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+fibrinogen+levels+in+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+and+geographical+medicine%22%5BJournal%5D)">Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease.</a> Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).</li>
<li>Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Changes+in+Coagulation+and+Viscosity+during+Sickle-Cell+Crisis%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+haematology%22%5BJournal%5D)">Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis.</a> British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).</li>
<li>Ataga, K. I., Orringer, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercoagulability+in+sickle+cell+disease%3A+a+curious+paradox%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox.</a> The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).</li>
<li>Collet, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+fibrin+architecture+is+associated+with+hypofibrinolysis+and+premature+coronary+atherothrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).</li>
<li>Barazzoni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Fibrinogen+Production+in+Type+2+Diabetic+Patients+without+Detectable+Vascular+Complications%3A+Correlation+with+Plasma+Glucagon+Concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).</li>
<li>Ceriello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+activation+in+diabetes+mellitus%3A+the+role+of+hyperglycaemia+and+therapeutic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects.</a> Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).</li>
<li>Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+adhesiveness%2C+plasma+fibrinogen+and+factor+VIII+levels+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus.</a> Diabetologia. 6, 436-440 (1970).</li>
<li>Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+fibrin%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+protein+chemistry%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and fibrin.</a> Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).</li>
<li>Collet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Fibrin+Network+Conformation+and+Fibrin+Fiber+Diameter+on+Fibrinolysis+Speed+Dynamic+and+Structural+Approaches+by+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).</li>
<li>Jörneskog, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+properties+of+the+fibrin+gel+structure+in+patients+with+IDDM%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM.</a> Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).</li>
<li>Svensson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+and+glycation+of+fibrinogen+in+vitro+occur+at+specific+lysine+residues+in+a+concentration+dependent+manner%3A+A+mass+spectrometric+and+isotope+labeling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).</li>
<li>Pieters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycation+of+fibrinogen+in+uncontrolled+diabetic+patients+and+the+effects+of+glycaemic+control+on+fibrinogen+glycation%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation.</a> Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).</li>
<li>Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+fibrin+clot+networks+from+stereoscopic+intermediate+voltage+electron+microscope+images+and+analysis+of+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching.</a> Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).</li>
<li>Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+extravascular+and+intravascular+cells+to+fibrin+network+formation%2C+structure%2C+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability.</a> Blood. 114, 4886-4896 (2009).</li>
<li>Curtis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+microstructural+templating+in+fibrin-thrombin+gel+networks+by+spectral+and+viscoelastic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis.</a> Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).</li>
<li>Kim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+fibrin+network+structure+and+mechanical+properties%3A+an+experimental+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis.</a> Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).</li>
<li>Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+cell+disease+activates+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+induce+cathepsins+k+and+v+activity+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anemia%22%5BJournal%5D)">Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells.</a> Anemia. 2012, 201781(2012).</li>
<li>Allison, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+sickle-cell+haemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Properties of sickle-cell haemoglobin.</a> Biochemical Journal. 65, 212(1957).</li>
<li>Kuehl, R. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuehl%2C+RO+%22Design+of+experiments+%3A+statistical+principles+of+research+design+and+analysis%22">Design of experiments : statistical principles of research design and analysis</a>. , 2nd ed, Cengage Learning. Pacific Grove, CA. (2000).</li>
<li>Lindman, H. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLindman%2C+HR+%22Analysis+of+variance+in+experimental+designs%22">Analysis of variance in experimental designs</a>. , Springer-Verlag Publishing. New York, N.Y., USA. (1992).</li>
<li>Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastable+Mesoscopic+Clusters+in+Solutions+of+Sickle-Cell+Hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin.</a> Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).</li>
<li>Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+theoretical+study+on+the+dissolution+of+mural+fibrin+clots+by+tissue-type+plasminogen+activator%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator.</a> Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).</li>
<li>Sazonova, I. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((127+Mathematic+model+of+fibrin+clot+lysis+by+plasmin%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrinolysis+and+Proteolysis%22%5BJournal%5D)">127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin.</a> Fibrinolysis and Proteolysis. 12, Suppl 1. 45(1998).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Pour obtenir des données significatives sur la structure des mécanismes de coagulation dans des états pathologiques, il est important d'isoler les facteurs impliqués dans la coagulation pour déterminer les effets des protéines et des cellules dans ces conditions. Ce protocole a été développé pour les fins de l'enquête sur la structure du caillot de fibrine dans les états diabétiques et SCD in vitro. Il est nécessaire de comprendre les mécanismes impliqués dans la formation de fibrin...

Des traumatismes de la paroi endothéliale d&#39;un vaisseau sanguin est réparé par la réponse hémostatique, ou la formation d&#39;un caillot de sang. Lorsque le sang pénètre dans la matrice extracellulaire, les facteurs tissulaires activer les plaquettes dans le flux de sang qui facilitent l&#39;initiation de la cascade de coagulation. L&#39;élément mécanique essentiel de ce processus de guérison est la matrice de fibrine, composé de fibres de fibrine qui sont hautement élastique, et peut supporter des forces importantes 1-4. De nombreux chercheurs ont étudié la structure de la formation, et la fonction de la fibrine abondamment dans les dernières décennies 5-13. Les patients atteints de maladies telles que le diabète sucré et la drépanocytose ont un risque accru de développer des complications thrombotiques telles que l&#39;infarctus du myocarde, la cardiopathie ischémique, les accidents vasculaires cérébraux et 14-19. Plus de 2 millions de personnes sont nouvellement diagnostiquées avec le diabète sucré chaque année aux États-Unis. Il existe deux types de diabète: type I, où lecorps ne parvient pas à produire des quantités adéquates d&#39;insuline, et Type II, où le corps devient résistant à l&#39;insuline. Chez les patients diabétiques, les maladies cardiovasculaires (CVD) est la cause de 80% de la morbidité et de la mortalité associée à la maladie 20,21. La drépanocytose (SCD) est une maladie génétique du sang qui touche plus de 100 000 personnes aux États-Unis 22. SCD est une maladie point mutation qui provoque des globules rouges à devenir en forme de croissant, ce qui rend difficile pour les cellules de passer à travers le système vasculaire sanguin 23. Ces deux états pathologiques augmenter les chances de développer des maladies athérothrombotiques dans le corps. Une des raisons à cela est le résultat de la structure de fibrine modifié et la fonction dans les Etats malades 14,24-26. Dans les deux diabète et la drépanocytose, il est hypercoagulation et l&#39;activité de hypofibrinolyse qui induit l&#39;athérothrombose et les maladies cardiovasculaires (CVD) par rapport à des patients sains 17,27,28. Il est connu que hypofibrinolyse favorise la progression de l&#39;athérosclérose et engendre des événements ischémiques récurrents pour les patients atteints de maladie coronarienne prématurée 29. Dans le manuscrit en cours, nous avons étudié le rôle des propriétés physiques fibrine dans ce contexte particulier. Structures de caillot de fibrine chez les patients non malades sont composés de fibres fines et des pores plus grands, et généralement moins dense 14,24. La porosité accrue et des caillots de fibrine moins denses chez les patients en bonne santé ont été trouvées 16 pour faciliter la fibrinolyse. Dans des conditions hyperthrombotic telles que la maladie diabétique et la faucille cellule, il existe une augmentation de la production de fibrinogène, ce qui provoque la concentration de fibrinogène à augmenter à partir de niveaux normaux de 2,5 mg / ml dans 30 à 33 patients en bonne santé. Les caillots de fibrine formés chez les patients diabétiques se sont révélés être moins poreux, plus rigide, plus de points de ramification, et plus dense en comparaison avec sain, non-diapatients Bétique 14,24,33-35. La structure de fibrine modifiée est le résultat de mécanismes de glycation qui se produisent dans les protéines impliquées dans la formation du caillot. Non enzymatique (irréversible) glycation se produit lorsque les molécules de glucose se lient à des résidus de lysine sur la molécule de fibrinogène, qui inhibe le facteur XIIIa humaine (FXIIIa) à partir de résidus lysine et glutamine correctement reticulation 33,36,37. L&#39;analyse structurale des réseaux de fibrine a été largement étudié ces derniers temps. En particulier, les chercheurs ont utilisé la microscopie électronique et reconstruction 3D de réseaux de fibrine 38, a étudié comment les deux (endotheliales) Les piles et extravasculaires (fibroblastes et de muscle lisse) intravasculaires cellules influent sur ​​la structure de fibrine 39, viscoélastique utilisé et l&#39;analyse spectrale à analyser les structures de fibrine 40, et corrélations développés entre la structure de fibrine et les propriétés mécaniques utilisant des approches expérimentales et informatiques 41 </sup&gt;. L&#39;objectif de l&#39;étude était de formuler des structures de caillot dans des conditions de thrombose cellulaire diabétique et la faucille simulées et d&#39;utiliser la microscopie confocale pour l&#39;examen de la structure et la fonction des caillots dans les États malades. Les caillots de fibrine ont été formés à partir de fibrinogène humain, de la thrombine humaine, et FXIIIa. Les caillots ont été lysées à l&#39;aide de plasmine. Pour simuler les conditions diabétiques, augmentation de la concentration de fibrinogène a été incubé dans une solution de glucose pour induire in vitro fibrinogène glycation. Pour simuler les conditions de coagulation drépanocytaires, une augmentation des concentrations de fibrinogène ont été mélangés avec hématocrite falciforme recueillies auprès de patients comme précédemment par notre groupe 42. Ces méthodes ont été utilisées pour examiner la structure et les fonctions impliquées dans la formation de caillot de fibrine et de la fibrinolyse dans des conditions malades, ainsi que les mécanismes qui induisent les maladies cardiovasculaires. Basé sur l&#39;information courante sur ces maladies, les structures de fibrine caillot glyquée étaient plus dense avec moins d&#39;unnd pores plus petits. Les caillots de fibrine avec les globules rouges provenant de patients atteints de drépanocytose (RBC) étaient également plus dense et affichées agrégation des globules rouges et des grappes agglomérées de fibrine. Ce est un phénomène bien établi qui a été précédemment déterminé 43. On a également émis l&#39;hypothèse que le taux de la fibrinolyse est sensiblement inférieure à la formation de caillots de fibrine avec ou sans glyquées réduite par rapport à la plasmine en bonne santé, la fibrine normal. Les résultats ont montré que, pour la formation de caillots de fibrine glyquées, des résultats sensiblement différents de taux de lyse n&#39;a été observée que dans des conditions de concentration de la plasmine réduite. Cette technique expérimentale de l&#39;utilisation de la microscopie confocale offre des avantages significatifs par rapport à d&#39;autres méthodes d&#39;imagerie parce que les cellules et les protéines restent dans leur état natif, ce qui permet la capture de vidéo en temps réel de l&#39;activité de coagulation. Cette méthode de coagulation synthétiquement induction est également moins coûteux et plus efficace du temps que l&#39;obtention d&#39;échantillons de patients et le filtrage out individueldes protéines et des enzymes. En outre, en utilisant des protéines et des enzymes séparés de synthétiser des caillots, les caillots ont été normalisées de sorte qu&#39;il n&#39;y avait pas variabilité entre les échantillons à la suite d&#39;autres protéines dans le plasma.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque (polysaccharide hydrophile)</td><td>GE Healthcare</td><td>45-001-749</td><td></td></tr><tr><td>10 ml tubes vacutainers héparinés</td><td>BD Biosciences</td><td>366643</td><td></td></tr> Human <tr><td>Fibrinogen</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 conjugué de fibrinogène humain</td><td>Sondes moléculaires</td><td>F13191</td><td></td></tr><tr><td>Tube à microcentrifuger gradué de 0,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Poudre de glucose</td><td>Life Technologies</td><td>15023-02</td><td></td></tr><tr><td>FXIIIa</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>VIS Microscope confocal</td><td>Zeiss LSM 510</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris</td><td>Lonza</td><td>S50-642</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium (CaCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiD solution de marquage cellulaire</td><td>Life Technologies</td><td>L7781</td><td></td></tr><tr><td>Plasmine</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (5 M NaCl)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de modélisation statistique</td><td>IBM</td><td>SPSS Statistics 22</td><td></td></tr></tbody></table>

techniques expérimentales et d&#39;imagerie pour examen caillot de fibrine structures en normaux et malades unis

Experimental and Imaging Techniques for Examining Fibrin Clot Structures in Normal and Diseased States

Fibrin est une protéine de la matrice extracellulaire responsable du maintien de l’intégrité structurelle des caillots sanguins. De nombreuses recherches ont été menées sur la fibrine au cours des dernières années, notamment sur la synthèse, la fonction de la structure et la lyse des caillots. Cependant, il y a encore beaucoup d’inconnues sur les caractéristiques morphologiques et structurelles des caillots qui résultent des patients atteints de la maladie. Dans cette étude, des techniques expérimentales sont présentées qui permettent d’examiner les différences morphologiques des structures anormales du caillot dues à des états pathologiques tels que le diabète et l’anémie falciforme. Notre étude se concentre sur la préparation et l’évaluation des caillots de fibrine afin d’évaluer les différences morphologiques à l’aide de divers tests expérimentaux et de la microscopie confocale. De plus, une méthode est également décrite qui permet de calculer en continu et en temps réel les taux de lyse dans les caillots de fibrine. Les techniques décrites dans le présent document sont importantes pour les chercheurs et les cliniciens qui cherchent à élucider les pathologies thrombotiques comorbides telles que les infarctus du myocarde, les cardiopathies ischémiques et les accidents vasculaires cérébraux chez les patients atteints de diabète ou de drépanocytose.

Microscopie confocale Analyse des glyquée fibrine Structures Clot Les images de microscopie confocale de caillots normaux et glyquée sont présentés dans la figure 3. Confocale analyse au microscope des caillots normaux et glyquée révèle que caillots glyquée sont plus denses avec des pores plus petits que les caillots normaux à la fois avec et sans l'ajout de FXIIIa cours de la polymérisation caillot. Sur la figure 3A et 3B, il ya une concent...

Dans ce manuscrit, des techniques expérimentales, y compris la préparation du sang, la microscopie confocale et l’analyse du taux de lyse, pour examiner les différences morphologiques entre les structures normales et anormales des caillots dues à des états pathologiques, sont présentées.

Techniques expérimentales et d&#39;imagerie pour examen caillot de fibrine Structures en normaux et malades Unis

Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on ...

L’objectif général de cette procédure est d’examiner les différences morphologiques dans les structures anormales des caillots qui se produisent dans le diabète et l’anémie falciforme, des conditions pathologiques pour les caillots diabétiques simulés. Ceci est accompli en imageant les structures des caillots glyqués par microscopie confocale pour des échantillons de sang de patients drépanocytaires. Les caillots de fibrine contenant des globules rouges sont imagés confocals en temps réel.Une analyse microscopique peut ensuite être effectuée pour évaluer les taux de fibrinolyse sur les structures normales et glyquées des caillots. En fin de compte, cette analyse en temps réel peut être utilisée pour évaluer les différences morphologiques qui se produisent dans les structures anormales des caillots en réponse aux états pathologiques dans lesquels elles se produisent. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la thrombose et de l’hémostase, telles que : comment les structures du caillot de fibrine sont-elles différentes chez les patients atteints de diabète ou de drépanocytose.Pour évaluer les caillots diabétiques simulés par microscopie confocale, décongelez d’abord le fibrinogène humain et le conjugué de fibrinogène humain marqué par fluorescence à 10 % à 37 degrés Celsius lorsque les solutions de fibrinogène réchauffées se mélangent au fibrinogène humain et au conjugué de fibrinogène dans une solution de chlorure de sodium de glucose trics et incuberez la solution à l’abri de la lumière dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Vers la fin de l’incubation, utilisez un adhésif non liquide pour fixer un adhésif mince sur les deux côtés d’une lame de microscope en verre pour faire une chambre, puis mélangez une solution de fibrinogène avec un facteur de température ambiante de 13 et de la thrombine jusqu’à un volume final de 50 microlitres, et transférez immédiatement 30 microlitres de la solution de fibrine dans la chambre de la lame de microscope. Placez maintenant une lamelle en verre de 22 x 22 millimètres avec un point de 15 millimètres d’épaisseur sur l’adhésif et scellez les côtés ouverts de la chambre avec un adhésif transparent en veillant à ce que l’adhésif n’interagisse pas avec le caillot.Laissez les caillots de fibrine polymériser à 21 à 23 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, acquérez des images de microscopie confocale des caillots à l’aide d’un objectif 40x et d’un laser argon de 488 nanomètres pour évaluer les caillots de patients atteints de drépanocytose. Diluez d’abord l’échantillon de globules rouges à 1 million de cellules par millilitre dans un milieu de culture de cellules sans sérum, puis mélangez les cellules avec cinq microlitres de la solution de marquage cellulaire appropriée par pipetage doux.Après 20 minutes à 37 degrés Celsius, lavez les cellules trois fois dans un milieu à 37 degrés Celsius pendant que les cellules sont dans la centrifugeuse mélanger le facteur de solution de fibrinogène 13 fraîchement préparé et la thrombine comme cela vient d’être démontré. Transférez ensuite 10 microlitres de globules rouges marqués dans la solution de fibrine et distribuez immédiatement 30 microlitres de la solution cellulaire dans une chambre adhésive. Sur une lame de microscope en verre, laissez la fibrine polymériser à 21 à 23 degrés Celsius après deux heures, acquérez des images confocales des caillots à l’aide de lasers d’excitation avec des longueurs d’onde de 488 nanomètres et 633 nanomètres pour exciter la fibrine et les globules rouges marqués par fluorescence respectivement.Pour évaluer les taux de fibrinolyse et les structures des caillots glyqués, préparez d’abord les caillots glyqués, comme nous venons de le démontrer cette fois-ci. Cependant, après avoir distribué la solution de caillot de fibrine dans la chambre adhésive, ne scellez pas les extrémités de la chambre. Au lieu de cela, laissez les caillots polymériser à 21 à 23 degrés Celsius dans un contenant scellé contenant 250 millilitres d’eau pour éviter la déshydratation.Après une heure et demie, acquérir des images des caillots par microscopie confocale comme nous venons de le démontrer. Ensuite, pipetez 25 microlitres de plasmine dans l’extrémité ouverte de la chambre et laissez la plasmine se disperser dans tout le caillot par capillarité. Enfin, ouvrez les fonctions de séries chronologiques du logiciel de microscope confocal, cliquez sur le mode d’acquisition et sélectionnez séries chronologiques.Sélectionnez ensuite le nombre de cycles et l’intervalle de temps d’enregistrement pour capturer des séquences vidéo en temps réel de la lyse du caillot induite par la plasmine L’analyse des caillots normaux et glyqués révèle que les caillots glyqués sont plus denses avec des pores plus petits que les caillots normaux, avec et sans l’ajout du facteur 13 lors de la polymérisation du caillot. En effet, dans les caillots glyqués de l’ONU, il y a une concentration de fibrine plus faible, ce qui crée une structure moins dense que celle observée dans les caillots glyqués, qui contiennent une concentration de fibrine plus élevée. Les caillots de fibrine des patients drépanocytaires contiennent des globules rouges et présentent des structures plus denses que celles des caillots de fibrine sains en raison d’une concentration accrue de fibrinogène chez ces individus.De plus, la tendance naturelle des globules rouges des patients drépanocytaires à former des agrégats et des sexes, des amas de globules rouges qui s’entrelacent dans le réseau de fibrine, entraînant la formation de structures de caillots aberrantes dont la morphologie est nettement différente de celle observée chez les patients normaux. Enfin, l’analyse des taux de fibrinolyse des caillots normaux par rapport aux caillots glyqués démontre une capacité significativement altérée des caillots diabétiques simulés à la fibrine lytique en l’absence de plasmine suffisante. Ces recherches contribueront à ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine de la thrombose et de l’hémostase, en particulier pour les patients qui développent des pathologies comorbides à la suite de la drépanocytose et du diabète.

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Des techniques de microscopie et de traitement d’image de time-lapse ont été employées pour observer et analyser le compactage fibroblaste-négocié de gel et le réalignement de fibre de fibrine dans un bioréacteur commandé par l’environnement sur une période de 48 heures.

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Combiné proche infrarouge imagerie fluorescente et la tomographie par Micro-calculé pour Directement Visualizing cérébrale thromboembolies

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Présentées ici sont deux méthodes qui peuvent être utilisés individuellement ou en combinaison pour analyser l’effet de la protéine bêta-amyloïde sur structure de caillot de fibrine. Inclus est un protocole créant un caillot de fibrine in vitro , suivie de turbidité de caillot et la microscopie électronique à balayage méthodes.

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Nous présentons un modèle in vitro de maladie vasculaire pour étudier des interactions de sang entier avec l’endothélium patient-dérivé. Ce système permet l’étude des propriétés thrombogéniques des cellules endothéliales primaires dans diverses circonstances. La méthode est particulièrement adaptée pour évaluer la thrombogénicité in situ et la thérapie anticoagulation pendant les différentes phases de la coagulation.

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La fibrine est responsable de la formation de caillots pendant l’hémostase et la thrombose. Les tests de turbidité et thromboelastograhy (TEG) peuvent être utilisés comme outils synergiques qui fournissent une évaluation complémentaire d’un caillot. Ces deux techniques ensemble peuvent donner plus de perspicacité dans la façon dont les conditions de coagulation affectent la formation de caillots de fibrine.

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