Name: Analyse en temps réel de profil métabolique dans Ex Vivo Cultures souris intestinale Crypte organoïde (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Découvrez l'analyse du profil métabolique en temps réel d'organoides de cryptes intestinales murines ex vivo. Cette méthode utilise l'analyseur de flux extracellulaire XF 24 pour mesurer la consommation d'oxygène et l'acidification.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cette étude a été soutenue par des subventions SR1 CA 135561, R01 CA151494, CA174432 et R01 P3013330 des Instituts nationaux de la santé. Nous tenons à remercier Michele Houston, Elena Dhima et le Dr Anna Velcich pour leurs précieux commentaires dans l&#39;élaboration du protocole d&#39;isolement de la crypte. Nous remercions également la formation sur le diabète et le Centre de recherche de l&#39;Albert Einstein College of Medicine soutenu par le NIH P60DK20541, et le Dr Michael Brownlee et le Dr Xue Liang-Du, qui dirigent et exploiter les installations Seahorse, respectivement.

Cette étude a été réalisée en conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le Comité d&#39;éthique de l&#39;expérimentation animale de l&#39;Albert Einstein College of Medicine. 1. Crypte Isolement et culture <ol><li> Isolation des cryptes de l&#39;intestin grêle: <ol><li> Isoler cryptes intestinales de tout modèle de souris d&#39;intérêt. Euthanasier les souris avec du CO 2 suivie d&#39;une dislocation cervicale. </li><li> Ouvrez l&#39;abdomen longitudinalement et remplir l&#39;intestin grêle (SI) avec une solution saline tamponnée froid glace phosphate, PBS (-Ca 2+; -Mg 2+) avec 2x antibiotique antifongique (anti-anti). Rapidement isoler l&#39;intestin grêle. </li><li> Bien disséquer sans graisse mésentérique aide d&#39;un scalpel. Veillez à ne pas perforer le tissu - en tout temps garder le tissu humide avec PBS glacé. Ouvrez inteStine longitudinalement et laver soigneusement avec du PBS glacé. </li><li> Couper l&#39;intestin grêle en deux sections et aplatir à l&#39;aide d&#39;un coton-tige humide, doucement gratter les villosités en utilisant une lame de pré-refroidissement. Laver vigoureusement dans PBS glacé plusieurs fois. </li><li> Incuber 3 min dans 20 ml de PBS 1X par 3 mM d&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) /0.5 mM de dithiothréitol (DTT) pour la dissociation non enzymatique du tissu. </li><li> Couper le tissu en petits morceaux (2-4 mm) en utilisant une lame de rasoir sur une lame de pré-refroidi. Transférer les morceaux dans un tube de 50 ml contenant 20 ml de PBS refroidi à la glace. </li><li> Pipette et doucement 10x en utilisant une pipette de 10 ml stérile à usage unique. Laissez fragments de tissus sédimentent par gravité. Retirer le surnageant avec une pipette. Répétez trois fois de plus; assurez-vous surnageant est clair. </li><li> Ajouter 20 ml de PBS par 2 mM EDTA. Swirl et incuber à 4 ° C pendant 30 min sous agitation légère. </li><li> Laissez sédiments de tissus et éliminer le surnageant. Ajouter 15 ml PBS glacé et pipettede haut en bas 5x avec une pipette de 10 ml. Soit les fragments de tissus et des sédiments recueillir le surnageant comme une fraction (F1). Répéter collecte F2-F5, chaque fraction maintenu séparément. </li><li> Ajouter 15 ml PBS glacé et cette fois agiter vigoureusement à la main pendant 15 secondes. Recueillir F6 et F7 pour répéter, F8. Si des morceaux de tissus commencent à flotter, appuyez sur pour les aider à régler. </li><li> Inspecter une partie aliquote de chaque fraction sous le microscope. Mettent en commun les fractions contenant cryptes. </li><li> Faire passer les fractions combinées à travers un tamis cellulaire en nylon de 70 pm, la collecte des cryptes dans un tube de 50 ml. </li><li> Centrifugeuse à 100 g pendant 5 min à 4 ° C, éliminer le surnageant et remettre le culot dans 10 ml PBS glacé avec cryptes anti-anti-transfert et 2x à un tube de 15 ml. Répétez le lavage une fois de plus. </li><li> Laver les cryptes une fois avec 10 ml glacée ADF, avancée DMEM / F-12 (Dulbecco &quot;s Modified Eagle Medium / Ham&quot; s F-12) - 2x anti-anti. </li><li> Laver les cryptes une fois avec 10 ml de ADF - 1x anti-anti. </li><li> Comptez le nombre de cryptes en utilisant un hématimètre. Ajuster le volume de la solution de crypte et transférer dans un tube de 1,5 ml de sorte que la concentration finale de la crypte sera remis en suspension lors de 100-500 cryptes par 50 pi de mélange de protéines gélatineux (Matrigel). Centrifuger à 100 g pendant 5 min à 4 ° C et remettre les cryptes dans le mélange de protéine gélatineux. </li><li> Plaque 50 pi de crypte - gélatineux suspension de mélange de protéines par puits dans une plaque de 24 puits (zone de croissance: 2 cm 2), plaçant soigneusement la chute de suspension au centre de chaque puits. Maintenir la plaque dans un CO 2, à 37 ° C pendant ~ 30 incubateur min jusqu&#39;à ce que la suspension se solidifie. </li><li> Ajouter 500 ul médias glacée de culture complet (Advanced DMEM / F12 avec 1x contre - contre 10 mM 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 1x GlutaMAX, 1x B27, supplément de 1x N2, 1 mM N-acétyl-L-cystéine (NAC), 50 ng / ml de facteur de croissance épidermique (EGF), 100 ng / mlCaboche, 500 ng / ml R-Spondin). <ol><li> Reconstituer les facteurs de croissance à 0,1% de sérum-albumine bovine (BSA) dans du PBS. </li></ol></li></ol></li><li> Crypte Organoid Culture et Passage: <ol><li> Passage organites de la crypte 14-21 jours après l&#39;ensemencement (ou au besoin) comme suit: <ol><li> Changer médias chaque vendredi et lundi. Le mercredi, remplacer la moitié des médias avec les médias fraîche. </li></ol></li><li> Retirer le milieu de culture. Laver l&#39;échantillon deux fois avec 500 ul de PBS à 5 min d&#39;intervalle. </li><li> Retirer du PBS et casser doucement le mélange de protéines gélatineux en utilisant une pointe de micro pipette P1000 stérile. </li><li> Ajouter milieux de culture 1 ml complet à un seul puits et remettre en suspension les organites dans 1 ml médias. </li><li> Perturber légèrement les organites aide d&#39;un P1000 par aspiration et refoulement 20-30x (vérifier au microscope pour la dissociation organoïde bon avec un bon rendement de la crypte jusqu&#39;à une technique cohérente est développé). </li><li> Transférer les cryptes à un tube de 1,5 ml;centrifuger à 100 xg à 4 ° C, 5 min. </li><li> Laver le culot deux fois avec 1 ml de milieu de culture complet. </li><li> Split à un rapport de 1: 3 ou 1: 6 en tant que besoin, des cryptes remise en suspension dans 50 ul de Matrigel par puits. Procédez comme décrit ci-dessus (section 1.1.16-18). </li></ol></li><li> Crypte de congélation Organoid: <ol><li> Retirer le milieu de culture. Laver l&#39;échantillon avec 500 ul de PBS. </li><li> Disperser le mélange de protéines gélatineux en utilisant une pointe de pipette P1000. </li><li> Ajouter 1 ml de milieu à un seul puits et remettre en suspension les organites dans 1 ml médias. </li><li> Casser délicatement les organites aide d&#39;un P1000 par aspiration et refoulement 20-30x. </li><li> Transférer les organites à un tube de 1,5 ml. Centrifugeuse à 100 g à 4 ° C, 5 min. </li><li> Laver le culot deux fois avec 1 ml de milieu de culture complet. </li><li> cryptes de remettre en suspension dans 500 ul de gel médias. </li><li> cryptes de transfert à un cryotube, placer le tube dans un récipient de congélation et de stocker dans un congélateur à -80 ° C overniGHT. </li><li> Transfert des cryptes de l&#39;azote liquide 2 réservoir. <ol><li> Récupérer organites de la crypte gelés par la fonte rapidement dans un bain d&#39;eau à 37 C °. Laver avec 500 ul de milieu de culture complet une fois, centrifuger à 100 x g, 5 min et remettre en suspension dans le mélange de protéine gélatineuse, et la culture comme décrit ci-dessus. Pour une meilleure récupération, ajouter un inhibiteur de ROCK (Y-27632) au milieu de congélation. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Crypte Organoid métabolisme Assay <ol><li> Plaque de 24 puits Préparation: <ol><li> Isoler et compter cryptes selon le protocole (voir la section 1.1 pour l&#39;isolement de la crypte et la section 1.2 pour le passage de la crypte). </li><li> cryptes de remettre en suspension dans le mélange de protéines gélatineux (100-200 cryptes par 20 pi). </li><li> Plate crypte gélatineuse mélange de protéines en suspension dans une plaque de 24 puits essai (assurez-vous qu&#39;il ya au moins trois exemplaires pour chaque échantillon) et permet la suspension se solidifier à 37 ° C en CO 2incubateur; puis ajouter 500 ul de milieu de culture complet. </li><li> cryptes de culture (comme décrit dans la section 1.1) et d&#39;observer au microscope jusqu&#39;à cryptes deviennent des organites pleinement développés. </li></ol></li><li> Extracellulaire Flux test: <ol><li> Hydrate cartouche pendant une nuit dans un non-CO 2 (0% de CO 2), 37 ° C incubateur. </li><li> Retirez le milieu de culture et laver deux fois avec 500 organoïdes DMEM ul (sans: glucose, L-glutamine, du pyruvate de sodium et de bicarbonate de sodium et avec: rouge phénol). Attendez 5 min. </li><li> Ajouter 675 ul par puits milieu analytique (DMEM avec 2 mM de L-glutamine et 5 mM de D-glucose) dans chaque puits. </li><li> Vérifier morphologie microscopique de crypte de sorte que organites et le mélange de protéines gélatineux sont intactes après les lavages. Incuber 1 heure à une non-CO 2, 37 ° C incubateur. </li><li> Préparation des composés 10 uM injectables (oligomycine, le carbonyl cyanide p-trifluoro-méthoxy-phényl-hydrazone (FCCP), rotenone) en milieu de dosage. </li><li> Mise en place de la cartouche en chargeant 75 pi de 10 um composés injectables dans les ports de la cartouche de façon séquentielle: Port A - oligomycine; Port B - FCCP; Port et C - roténone (Les concentrations finales au cours de l&#39;essai sera de 1 M). </li><li> Incuber cartouche 30 min - 1 heure à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 non. </li><li> En même temps, activez l&#39;Analyzer XF et créer le modèle de protocole d&#39;essai. </li><li> Insérer la cartouche et la plaque d&#39;utilité dans Analyzer XF et exécuter &quot;calibrer&quot; cartouche. </li><li> Vérifiez organites de la crypte au microscope afin de s&#39;assurer qu&#39;ils sont attachés au mélange de protéines gélatineux. </li><li> cellule de charge plaque de culture dans le protocole d&#39;essai de l&#39;appareil et l&#39;exécution. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Jemal, A., et al. CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).</li>
<li>Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eating+patterns+and+risk+of+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Eating patterns and risk of colon cancer.</a> Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).</li>
<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li>
<li>Coles, N. W., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+in+Ehrlich+ascites-carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells.</a> Biochem J. 83, 284-291 (1962).</li>
<li>Medina, M. A., Castro I, N. unezde <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutaminolysis+and+glycolysis+interactions+in+proliferant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells.</a> Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).</li>
<li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+changes+in+cancer+cells+upon+suppression+of+MYC%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metab%22%5BJournal%5D)">Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC.</a> Cancer Metab. 1, 7(2013).</li>
<li>Malmgren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+changes+in+histone+modifications%2C+mRNA+levels%2C+and+metabolite+profiles+in+clonal+INS-1+832%2F13+%CE%B2-cells+accompany+functional+adaptations+to+lipotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 β-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity.</a> J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).</li>
<li>Whitehead, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li>
<li>Roig, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+epithelial+cells+derived+from+human+colon+biopsies+express+stem+cell+markers+and+differentiate+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro.</a> Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+LGR5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li>
</ol>

Il n&#39;y a aucune divulgation.

Nous avons testé le taux de consommation d&#39;oxygène (OCR) et le taux d&#39;acidification extracellulaire (ECAR) de cryptes isolées à partir de souris âgées de 8 mois et cultivées en organites ex vivo. Après la mesure du taux de base, le métabolisme crypte a été évaluée en ajoutant oligomycine, cyanure de carbonyle -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) et la roténone, séquentiellement. Basal OCR et ECAR base ont été enregistrées 0-29 min (figure 2A et ...

Le cancer colorectal (CCR) est la troisième cause de décès liés au cancer aux États-Unis. Cancer du côlon sporadique --à-dire celle qui résulte plus tard dans la vie (&gt; 50 ans) et sans facteurs génétiques prédisposant claires - représentent environ 80% de tous les cas, avec une incidence fortement influencée par les habitudes alimentaires à long terme 1,2. Ces tumeurs présentent un changement métabolique à la dépendance de la glycolyse oxydatif, connu comme l&#39;effet Warburg, qui peut en partie faire des concentrations plus élevées de blocs de construction cellulaires et de l&#39;énergie disponibles (par glutaminolysis) pour permettre et peut-être d&#39;atteindre des taux élevés de prolifération des cellules tumorales 3-5 . Études sur le cancer du côlon ainsi que d&#39;autres cancers gastro-intestinaux, y compris les petits cancers de l&#39;intestin fournissent des indications importantes sur la cause de la formation de tumeurs. Étudier les différences métaboliques entre les états normaux, pro-tumorigènes et tumorigènes de systèmes d&#39;organes gastro-intestinaux peuvent aider detESILIATION de risque relatif pour le développement de la tumeur ainsi que la détection précoce des néoplasies. De plus, la compréhension de métabolisme bioénergétique impliquant la respiration mitochondriale et la glycolyse donnera un aperçu fondamental dans la façon dont la physiologie cellulaire, le vieillissement et la maladie perturbe l&#39;homéostasie intestinale état. L&#39;utilisation de la technologie bioénergétique de dosage pour l&#39;analyse de flux extracellulaire peut évaluer le taux de respiration mitochondriale et de la glycolyse en même temps dans les cellules en croissance en culture en temps réel de 6,7. Jusqu&#39;à récemment, les études in vitro de l&#39;intestin grêle ont été limités à des lignées cellulaires dérivées de tumeurs bénignes ou malignes 8,9 et ne représentent pas la physiologie de l&#39;épithélium intestinale normale et l&#39;influence du micro-environnement dans lequel elles résident. En 2009, Sato et al. 10 ex vivo introduit un système de culture à croissance tridimensionnelle (3D) de souris organites épithéliales de l&#39;intestin, ou epithElial «mini-tripes&quot;, adapté à des recherches expérimentales, diagnostiques et thérapeutiques 10,11. En outre, cryptes isolées de souris soumis à restriction calorique maintenir leurs propriétés de croissance modifiées que organites dans ces cultures 12. Par rapport à des lignées cellulaires transformées, cultures organoïdes crypte peuvent être utilisés pour générer des données physiologiquement pertinents présentant une bien meilleure modèle pour comprendre l&#39;état in vivo. Nous avons adapté la technologie d&#39;analyse bioénergétique pour doser le métabolisme énergétique des organites des cryptes intestinales. Souris organites de la crypte intestinale ont été cultivées ex vivo de développer les études sur le métabolisme de l&#39;énergie organoïdes crypte présentés. Le taux de consommation d&#39;oxygène (OCR) et le taux d&#39;acidification extracellulaire (ECAR) des organites cryptes ont été mesurées en l&#39;absence et en présence de deux inhibiteurs différents métaboliques (oligomycine, la roténone) et un transporteur d&#39;ions (carbonyl cyanure p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). L&#39;orga crypteréponse métabolique solénoïde à ces composés chimiques ont été traduit avec succès en changeant ECAR et valeurs OCR. Études bioénergétiques cellulaires permettent d&#39;élucider les interactions réciproques entre l&#39;état métabolique et le risque de maladie et le phénotype dans le cancer, l&#39;obésité, le diabète, les maladies métaboliques et les maladies mitochondriales et aider méthodes de dépistage à l&#39;avance avec des implications directes pour la médecine translationnelle. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour isoler petites cryptes intestinales et à la culture organites de la crypte. En outre, nous introduisons une nouvelle méthode pour utiliser des cultures organoïdes crypte pour les essais métaboliques.

<table><tbody><tr><td>Matrice membranaire basale BD Matrigel, DFR, sans rouge de phénol, sans LDEV</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solution saline tamponnée au phosphate), sans magnésium, sans calcium, pH 7,2</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime ; s Aigle modifié&prime ; s Moyen sans glucose, L-glutamine, rouge de phénol, pyruvate de sodium et bicarbonate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>Sel de sodium rouge de phénol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4758</td><td>Concentration finale 15 mg/l dans le DMEM (D5030) - step 2.2.2</td></tr><tr><td>Antibio-Antimycosique, 100x, 100 ml</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Concentration finale 1x ou 2x</td></tr><tr><td>péniciline-streptomycine, liquid</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Concentration finale 1x</td></tr><tr><td>Gibco&reg ; GlutaMAX&commerce ; supplément</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>Concentration finale 1x</td></tr><tr><td>Gibco&reg ; HEPES (acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthane sulfonique), 1 M Life</td><td>Technologies</td><td>15630-080</td><td>Concentration finale 10 mM</td></tr><tr><td>N-acétyl-L-cystéine, 25 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-25G</td><td>Concentration finale 1 mM</td></tr><tr><td>100x N-2 supplément, liquide</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Concentration finale 1x</td></tr><tr><td>50x B-27&reg ; supplément moins Vitamine A,</td><td>Invitrogen</td> <td>liquide12587-010</td><td>Concentration finale 1x</td></tr><tr><td>souris recombinante R-Spondin 1, CF, 50 &mu ; g</td><td>R& D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>Concentration finale 500 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinant Murin EGF, 100 &mu ; g</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>Concentration finale 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Tête murine recombinante, 20 &mu ; g</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Concentration finale 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Gibco&reg ; L-glutamine, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Concentration finale 2 mM</td></tr><tr><td>Gibco&reg ; glucose en poudre</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td>Concentration finale 5 mM</td></tr><tr><td>Ambion&reg ; 0,5 M EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique), pH 8,0</td><td>Life Technologies</td><td>AM9260G</td><td>Concentration finale 3 mM pour <fort>pas 1.1.5</fort> ; 2 mM pour <fort>pas 1.1.8</fort></td></tr><tr><td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td>DTT (dithiothréitol), 1M</td><td>Life Technologies</td><td>P2325</td><td>Concentration finale 3 mM</td></tr><tr><td>d’albumine de sérum de bovin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td>0,1 % dans PBS</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>1 % dans PBS</td></tr><tr><td>Recovery&trade ; Culture cellulaire Congélation Medium Life</td><td>Technologies</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de ROCK (Y-27632)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Concentration finale 10 &mu ; M</td></tr><tr><td>Oligomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td>Concentration finale 1 &mu ; M</td></tr><tr><td>Cyanure de carbonyle-p-trifluoro-méthoxy-phényl-hydrazone (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>Concentration finale 1 &mu ; M</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>Concentration finale 1 &mu ; M</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Concentration finale 0,1 N dans l’analyseur</td></tr> de <tr><td>flux extracellulaire PBS XF24 (analyseur XF)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analyse en temps réel de profil métabolique dans ex vivo cultures souris intestinale crypte organoïde

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

La muqueuse intestinale présente une architecture répétitive organisée en deux structures fondamentales: villosités, faisant saillie dans la lumière intestinale et composées d&#39;entérocytes matures, des cellules caliciformes et des cellules entéro-endocrines; et cryptes, résidant à proximité de la sous-muqueuse et la musculeuse, l&#39;hébergement souches adultes et des cellules progénitrices et des cellules matures de Paneth, ainsi que du stroma et les cellules immunitaires du microenvironnement de la crypte. Jusqu&#39;à ces dernières années, des études in vitro de l&#39;intestin grêle a été limité à des lignées cellulaires dérivées de tumeurs bénignes ou malignes, et ne pas représenter la physiologie de l&#39;épithélium intestinale normale et l&#39;influence du microenvironnement dans lequel ils résident. Ici, nous démontrons une méthode adaptée de Sato et al. (2009) pour la mise en culture primaire organites des cryptes intestinales de souris dérivées de souris C57BL / 6. En outre, nous présentons l&#39;utilisation de cultures organoïdes crypte de doser le profil métabolique crypte en temps réel par mesurement de la consommation de base d&#39;oxygène, le taux de la glycolyse, la production d&#39;ATP et de la capacité respiratoire. Organites conservent les propriétés définies par leur source et conservent les aspects de leur adaptation métabolique réfléchie par la consommation d&#39;oxygène et les taux d&#39;acidification extracellulaire. Études métaboliques en temps réel dans cette crypte organoïde de système de culture sont un outil puissant pour étudier le métabolisme de l&#39;énergie organoïde crypte, et comment elle peut être modulée par des facteurs nutritionnels et pharmacologiques.

Organites crypte ont été établies à partir de 8 mois C57BL / 6 Fed purifié alimentation des rongeurs American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Organites des cryptes intestinales peuvent être mises en culture pendant des périodes prolongées d'un seul crypte (figure 1A, seule flèche rouge). Organites poussent hors des structures de la crypte comme dans 18-20 jours de culture (figure 1B, flèches rouges). Cryptes ont été passées toutes les 3 semaines et organites efficacement récupérés ...

Les petits organites des cryptes intestinales en culture ex vivo de fournir un système de culture de tissu qui récapitule croissance des cryptes charge sur les cellules souches et leur niche. Nous avons établi une méthode pour analyser le profil métabolique en temps réel organites de la crypte de la souris primaire. Nous avons trouvé organites maintenir les propriétés physiologiques définis par leur source.

Analyse en temps réel de profil métabolique dans Ex Vivo Cultures souris intestinale Crypte organoïde

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Le but de cette procédure est d’analyser en temps réel le profil métabolique des organoïdes primaires des cryptes de souris. Ceci est accompli en recueillant d’abord l’intestin grêle de la souris, suivi de l’isolement des cryptes intestinales André se pliant en matrigel. La deuxième étape consiste à cultiver les cryptes jusqu’à ce qu’elles forment des organoïdes de crypte adultes.L’étape suivante est la préparation d’un test en cartouche pour les études métaboliques. La dernière étape consiste à charger la cartouche et la plaque utilitaire dans l’analyseur de flux extracellulaire XF 24 et à effectuer une analyse de flux extracellulaire pour mesurer le taux de consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire des organoïdes de la crypte K. En fin de compte, cette procédure permet d’étudier en temps réel le profil métabolique des organoïdes primaires de la crypte intestinale de souris.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’utilisation de la culture cellulaire pour les essais métaboliques est qu’elle nous permet d’évaluer le métabolisme intestinal des crypto-organes en temps réel. Les cultures d’organoïdes imitent l’état immunitaire avec plus de précision, ce qui permet de générer des données physiologiques plus pertinentes. La technique peut également être étendue à l’analyse d’autres cultures d’organoïdes XI 3D.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cancer, telles que la caractérisation des changements métaboliques dans les Crips de l’intestin grêle au cours de la tumorgenèse, et dans la recherche sur le diabète et le métabolisme, comme la comparaison du métabolisme des états normaux et pathologiques. Pour commencer cette procédure, ouvrez longitudinalement l’abdomen d’une souris euthanasiée. Remplissez l’intestin grêle avec du PBS sans calcium ni magnésium glacé et deux antibiotiques antimycosiques.Ensuite, isolez rapidement l’intestin grêle. Retirez la graisse mésentérique à l’aide d’un scalpel. Veillez à ne pas perforer le tissu et à garder le tissu humide avec du PBS glacé pendant toute la procédure.Ouvrez l’intestin et lavez-le soigneusement avec du PBS glacé. Après cela, coupez l’intestin grêle en deux sections. Aplatissez-les à l’aide d’un coton-tige humide.Ensuite, grattez doucement le VII à l’aide d’une glissière préco. Lavez les mouchoirs vigoureusement dans du PBS glacé plusieurs fois. Ensuite, incubez-les dans 20 millilitres d’un XPBS avec trois millimolaires d’EDTA et 0,5 millimolaire de DTT pendant trois minutes.Ensuite, coupez les tissus en morceaux de deux à quatre millimètres sur une lame préco. À l’aide d’une lame de rasoir, transférez les morceaux dans un tube de 50 millilitres contenant 20 millilitres de PBS glacé. Ensuite, pipetez doucement de haut en bas 10 fois à l’aide d’une pipette jetable stérile de 10 millilitres.Une fois que les fragments de tissu se sont déposés par gravité, retirez le SUP natum à l’aide d’une pipette. Répétez la procédure trois fois de plus et assurez-vous que le surnageant est clair. Maintenant, transférez les morceaux de tissu dans un tube de 50 millilitres contenant 20 millilitres de PBS avec deux millimoles molaires EDTA SW et incubez le mélange à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes en le balançant doucement.Après cela, laissez le tissu se déposer et jetez le supinate. Ajoutez 15 millilitres de charbon de glace PBS et des tuyaux de haut en bas cinq fois. Laissez les fragments de tissu se déposer et collectez le supinat sous forme de fraction un.Répétez les procédures pour recueillir la fraction deux à la fraction cinq et gardez les fractions séparées. Ensuite, ajoutez 15 millilitres de glace appelée PBS et secouez vigoureusement à la main pendant 15 secondes. Prélevez la fraction six et répétez les procédures pour la fraction sept et la fraction huit.Si les morceaux de tissu commencent à flotter, tapotez le tube pour les aider à se déposer. Ensuite, inspectez une aliquote de chaque fraction à la recherche de crips au microscope. Ceci est un exemple d’une mauvaise fraction, et ceci est un exemple d’une bonne fraction.Rassemblez ceux qui contiennent des Crips. Après cela, passez les fractions tirées dans une passoire à cellules de nylon de 70 microns et collectez les Crips dans un tube de 50 millilitres. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 100 fois G pendant cinq minutes, quatre degrés Celsius, jetez le supinate et remettez le PT en suspension dans 10 millilitres de PBS glacé avec deux antibiotiques antimycosiques.Transférez ensuite les Crips dans un tube de 15 millilitres et répétez le lavage une fois de plus. Ensuite, lavez les cryptes une fois avec 10 millilitres de glacé, un DF avancé D-M-E-M-F 12 contenant deux antibiotiques antimycosiques. Ensuite, lavez les cryptes une fois avec 10 millilitres d’un DF contenant un antibiotique antimycosique.Après cela, comptez les cryptes à l’aide d’un hémocytomètre. Ajustez le volume de la solution de crypte et transférez-la dans un tube de 1,5 millilitre de sorte que la concentration finale de la crypte lorsqu’elle est remise en suspension soit de 100 à 200 cryptes pour 20 microlitres de mélange de protéines gélatineuses. Ensuite, centrifugez la solution de crypte à 100 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Retirez le séné et remettez en suspension les cryptes dans le mélange de protéines gélatineuses. Ensuite, plaquez 20 microlitres de la suspension de mélange de protéines gélatineuses de la crypte par puits dans une plaque utilitaire de 24 puits. Conservez la plaque dans un incubateur à CO2 à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes jusqu’à ce que la suspension se solidifie.Ajoutez ensuite 500 microlitres de milieu de culture complet et glacé dans chaque puits et cultivez les Crips jusqu’à ce qu’ils deviennent les organoïdes complètement développés. Dans cette procédure, hydratez la cartouche pendant la nuit dans un incubateur sans dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Retirez ensuite le milieu de culture et lavez les organoïdes deux fois avec 500 microlitres de DMEM. Après cinq minutes, ajoutez 675 microlitres de milieu de dosage à chacun.Eh bien, vérifiez ensuite la morphologie microscopique des organoïdes de la crypte pour les incuber dans un incubateur sans dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, préparez 10 composés injectables micromolaires dans le milieu de dosage. Configurez la cartouche en chargeant séquentiellement 75 microlitres de composés injectables de 10 micromolaires dans les ports de la cartouche.Ensuite, incubez la cartouche pendant 30 minutes à une heure dans un incubateur sans dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Simultanément, allumez l’analyseur XF et créez le modèle de protocole de test. Placez la cartouche et la plaque utilitaire dans l’analyseur XF et exécutez la cartouche d’étalonnage. Après cela, chargez la plaque de culture cellulaire dans l’instrument et exécutez le test.Le protocole montré ici sont les organoïdes de la crypte dérivés d’une souris C 57 black six vieille de huit mois en deux jours ou 18 jours. Culture. Cette figure montre le dosage métabolique à l’aide d’organoïdes dérivés de souris C 57 black six âgées de huit mois, dans lesquels le taux de consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire sont présentés. Les cryptes sont indiquées en rouge et le contrôle est indiqué en bleu.Les réactifs préchargés dans la cartouche ont été injectés séquentiellement sous forme d’oligomycine, de B-F-C-C-P et de roténone C. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du cancer et du métabolisme pour explorer les changements métaboliques dans les organoïdes cryptiques dérivés de patients. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer le métabolisme de la crypte intestinale et des organoïdes en temps réel.Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

real-time-analysis-metabolic-profile-ex-vivo-mouse-intestinal-crypt

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dans cette vidéo, nous montrons une technique pour isoler des cryptes entières de l’intestin grêle d’une souris. Les cryptes entières isolées peuvent être utilisées pour propager des organoïdes 3D à longue durée de vie et auto-renouvelés in vitro.

Isolement des cryptes intestinales : une méthode pour isoler des cryptes entières de l’intestin grêle d’un modèle murin

La technologie d’imagerie améliorée permet l’imagerie tridimensionnelle des organes au cours du développement. Nous décrivons ici un système complet de culture d’organes qui permet l’imagerie en direct des villosités en développement dans l’intestin fœtal de la souris.

Souris foetal entier Intestin Système de culture pour Ex Vivo Manipulation des voies de signalisation et d'imagerie en direct en trois dimensions du développement des villosités

Dans ce protocole vidéo, nous expliquons étape par étape la transduction lentivirale dans les organoïdes de l’épithélium intestinal primaire et le traitement et l’analyse en aval de ces cultures par RT-PCR quantitative, ARN-microarray et immunohistochimie.

Un protocole pour Lentiviral transduction et analyse aval de intestinale organoïdes

Ici, un protocole pour récolter, conserver et traiter les souris petits organites intestinaux avec des motifs de pathogènes associés moléculaires (PAMP) et Listeria monocytogenes est décrit, ainsi que l' accent sur ​​l' expression des gènes et des techniques de normalisation appropriées pour la protéine.

le<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture et Pattern Recognition Receptor Stimulation de la souris Intestinal organites

Nous décrivons des instructions étape par étape à : 1) engineerly organoids intestinal utilisant des nanoparticules magnétiques pour la transduction lenti- ou rétroviral, et, 2) produisent des sections congelées des organoïdes machinés. Cette approche fournit un outil puissant pour modifier efficacement l'expression des gènes chez les organoïdes pour l'étude des effets en aval.

Génie génétique des organoïdes intestinaux de souris primaires utilisant les vecteurs viraux de transduction magnétique de nanoparticule pour la section congelée

Cet article présente une méthode unique d’analyse des interactions hôte-microbiome à l’aide d’un nouveau système de culture d’organes intestinaux pour des expériences ex vivo.

Un système de culture d’organes intestinaux pour l’analyse des interactions hôte-microbiote

Le présent protocole décrit une méthode de détection des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les organoïdes murins intestinaux à l’aide d’une imagerie qualitative et de tests de cytométrie quantitative. Ce travail peut être potentiellement étendu à d’autres sondes fluorescentes pour tester l’effet de composés sélectionnés sur les ROS.

Analyse du stress oxydatif dans les organoïdes intestinaux murins à l’aide d’une sonde fluorogénique sensible aux espèces réactives de l’oxygène

Le présent protocole décrit l’établissement d’un système organoïde du côlon murin pour étudier l’activité et le fonctionnement des cellules souches du côlon dans un modèle knockout claudin-7.

Culture tridimensionnelle de cryptes coliques murines pour étudier la fonction des cellules souches intestinales ex vivo

Nous décrivons un protocole détaillant l’isolement des cryptes coliques murines pour le développement de colonoïdes en 3 dimensions. Les colonoïdes établis peuvent ensuite être différenciés en phase terminale pour refléter la composition cellulaire de l’épithélium hôte avant de recevoir un défi inflammatoire ou d’être dirigés vers l’établissement d’une monocouche épithéliale.

Étude des effets épithéliaux de l’inflammation intestinale in vitro sur les colonoïdes murins établis

Nous décrivons un protocole pour isoler les cryptes de l’intestin grêle murin et cultiver des organoïdes intestinaux 3D à partir des cryptes. De plus, nous décrivons une méthode pour générer des organoïdes à partir d’une seule cellule souche intestinale en l’absence d’une niche cellulaire sous-épithéliale.

La culture 3D d’organoïdes à partir de cryptes intestinales murines et d’une seule cellule souche pour la recherche organoïde

Découvrez l'analyse du profil métabolique en temps réel d'organoides de cryptes intestinales murines ex vivo. Cette méthode utilise l'analyseur de flux extracellulaire XF 24 pour mesurer la consommation d'oxygène et l'acidification.

Analyse en temps réel de profil métabolique dans Ex Vivo Cultures souris intestinale Crypte organoïde

Explorer plus de vidéos