Caractériser la composition de moteurs moléculaires sur les moyens axonale Cargo Utilisation de l'analyse "Cargo Mapping"

L’objectif général de la cartographie du fret est de déterminer la quantité relative et le type de protéines motrices moléculaires qui s’associent et déplacent les cargaisons vésiculaires, et de corréler cette composition de moteurs avec une directionnalité du mouvement du fret en direct. Ceci est accompli en cultivant d’abord des neurones primaires de l’hippocampe de souris dans des dispositifs microfluidiques afin que les axones se développent relativement droits et en enregistrant le mouvement intracellulaire en direct des protéines cargo marquées par fluorescence dans les axones des neurones transfectés transitoirement. La deuxième étape consiste à fixer les neurones au cours de l’imagerie du cargo vivant, puis à colorer les axones avec des anticorps contre les protéines motrices moléculaires telles que la kinésine et les dines, suivie d’une imagerie par microscopie d’immunofluorescence.

Ensuite, les images fixes de la cargaison et du moteur sont alignées sur les tracés du mouvement de la cargaison au fil du temps, également appelés krafts, afin de corréler le mouvement de la cargaison en direct avec les moteurs associés colorés, tels que déterminés par la coloration immunofluorescente. La dernière étape consiste à déterminer la position des sous-pixels des protéines de fret et de moteur à l’aide d’un progiciel MATLAB développé sur mesure, appelé colocalisation motrice. Ce logiciel fournit les coordonnées XY précises de chaque position de cargaison et de moteur, ainsi que la quantité relative d’intensités de fluorescence associées aux cargaisons et aux moteurs.

En fin de compte, la corrélation de la microscopie à fluorescence de cargaisons et de moteurs vivants et fixes au niveau de résolution inférieure au pixel fournit des informations sur les types de moteurs associés à des cargaisons spécifiques pour lesquelles la directionnalité du mouvement est connue. Cette méthode donne donc un aperçu du mécanisme de transport des exons. Il peut être appliqué à d’autres études corrélant la microscopie vivante avec la coloration immunofluorescente, telles que l’Association des protéines aux microtubiaux pendant la dynamique des tubaires microt ou le recrutement de protéines pendant l’endocytose.

La démonstration visuelle de cette méthode aidera à effectuer les étapes de fixation et d’analyse de l’imagerie, qui pourraient autrement être difficiles à apprendre car elles nécessitent une configuration spécialisée. Les neurones primaires de l’hippocampe de souris pour cette procédure sont préparés comme indiqué dans le texte du protocole et remis en suspension dans la croissance neurobasale de l’œuf. Milieu pour plaquer les neurones dans le dispositif microfluidique.

Retirer le milieu du réservoir microfluidique un et un amorceur. Appliquez 20 microlitres de cellules dans le réservoir microfluidique et laissez-les s’écouler à travers. Placez l’appareil dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 pendant 20 minutes.

Regardez au microscope pour vous assurer que les cellules adhèrent au verre couvert. Ajoutez du neuro basal, un milieu de croissance pour compléter tous les réservoirs. Retournez l’appareil avec les cellules dans l’incubateur le neuvième jour.

En culture, les neurones étendent les axones à travers les microcanaux et sont prêts pour la transfection pour l’expression des protéines fluorescentes. L’imagerie en direct des neurones primaires de l’hippocampe de la souris transfectée est réalisée sur un microscope à lumière épifluorescence inversée, équipé d’un incubateur à 37 degrés Celsius et d’une chambre de contrôle du CO2. Pour commencer cette procédure, sélectionnez l’objectif à huile 100x.

Appliquez de l’huile sur l’objectif et montez la lamelle avec les neurones de l’hippocampe développés dans un dispositif microfluidique sur la platine du microscope. Pour éviter la mort neuronale, travaillez rapidement pour maintenir les échantillons au microscope pendant une heure au maximum. Trouvez les axones des cellules transfectées qui s’étendent à travers les canaux de la chambre microfluidique.

Notez le nombre de canaux dans lesquels l’axone transfecté a été trouvé. Comptez le nombre de canaux à l’aide d’un compteur de pointage manuel pour un enregistrement optimal du mouvement en direct et une analyse de colocalisation ultérieure. Choisissez des axones qui poussent relativement à plat à travers les canaux afin que l’imagerie de la plupart des vésicules puisse être effectuée au point.

Faciliter l’alignement ultérieur des images fixes avec les trajectoires de mouvement sur la greffe chm. Alignez le bord droit des micro-canaux avec le champ de vision pendant l’imagerie. Afin de réussir à fixer les cellules pendant l’imagerie en direct, il est préférable d’effectuer la procédure avec deux personnes, une personne pour ajouter le fixateur et une autre personne pour ajuster la mise au point.

Il est également important d’avoir tous les réactifs à portée de main. À l’aide d’une pipette de transfert en plastique d’un millilitre. Retirez la majeure partie du fluide des réservoirs deux et deux Prime Start imageant le mouvement réel de la cargaison avec des spécifications en accéléré spécifiques à la dynamique de transport de la cargaison analysée.

Une fois que suffisamment de données sur les mouvements en direct ont été recueillies, demandez à une personne de remplir les réservoirs deux et deux avec un fixateur de préchauffage. Évitez de toucher le dispositif microfluidique car cela perturberait la mise au point de l’imagerie en direct. Demandez à l’autre personne d’ajuster la mise au point pendant que le fixateur est ajouté.

De la même manière, remplir les réservoirs un et un primaire avec la fixation fixatrice est réussi lorsque l’arrêt immédiat du mouvement est observé. Par la suite, les neurones fixes sont colorés avec des anticorps contre les protéines motrices endogènes et imagés comme décrit dans le texte du protocole. Pour commencer, la cartographie du fret doit générer un chromogramme du mouvement du fret à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.

Le plug-in Image J développé par Rich Dorf Insights est recommandé pour générer Kraft à l’aide d’un logiciel graphique disponible dans le commerce, aligner manuellement l’image d’immunofluorescence de la cargaison sur le graphique CHM du mouvement de la cargaison, superposer le ponctué de fret sur la position des trajectoires dans le graphe CHM au point de fixation de sorte que chaque pointu de fret corresponde à une trajectoire spécifique sur le graphique CHM. Pour de meilleurs résultats d’alignement, utilisez la tranche Z qui est la mieux mise au point pour la cargaison cartographiée. Plusieurs tranches Z peuvent être utilisées pour chaque image de la pile Z.

Déterminez les coordonnées XY et les amplitudes d’intensité de chaque puncta fluorescent à l’aide d’un algorithme établi pour ajuster les gaussiennes 2D à la fonction d’étalement de points qui représente les sources ponctuelles dans chacun des trois canaux. Pour obtenir les coordonnées XY, un progiciel MATLAB personnalisé appelé colocalisation motrice a été développé, qui intègre un algorithme d’ajustement gaussien développé par Yakima DONA et ses collègues pour chacun des points de fret individuels qui ont été cartographiés sur les trajectoires mobiles ou stationnaires. Sur le graphique de Kog, sélectionnez les coordonnées XY et les amplitudes d’intensité à partir des résultats du programme de colocalisation motrice.

Utilisez plusieurs images Zack pour cartographier davantage de cargaisons qui se trouvent dans différents plans focaux. Comparez les coordonnées XY individuelles de la cargaison cartographiée à celles obtenues pour chacun des canaux du moteur dans la tranche Z correspondante. Déterminez et sélectionnez les coordonnées du moteur XY qui se trouvent dans un rayon de 300 nanomètres de la cargaison pour les cargaisons et les moteurs qui ont signalé dans le même plan focal.

Utilisez le progiciel de colocalisation motrice pour déterminer les points situés dans un rayon de 300 nanomètres. La cartographie du fret a été utilisée pour corréler le transport de vésicules portant des protéines prions normales marquées avec une protéine fluorescente jaune ou Y-F-P-P-R-P-C avec des quantités relatives de kinésine et de moteurs dine dans les axones. Ce graphique montre le mouvement de la vésicule F-P-P-R-P-C et la ligne pointillée indique le temps de fixation pendant l’imagerie en direct.

Les images de fluorescence des vésicules fixes Y-F-P-P-R-P-C ainsi que les images d’immunofluorescence correspondantes de la chaîne légère kinésine un et dine sont alignées sur le chromographe. Cet élargissement montre les signaux immunofluorescents de chacun des trois canaux avec des affectations de fonction gian 2D. Ce graphique représente la quantification de la colocalisation entre les vésicules Y-F-P-P-R-P-C, la chaîne légère de kinésine un et le dine dans les neurones de type sauvage et dans les neurones dépourvus de chaîne lourde de KINÉSIN.

La quantité relative de kinésine de la chaîne légère un et dine associée aux vésicules Y-F-P-P-R-P-C est obtenue à partir des amplitudes gaussiennes et tracée pour examiner les corrélations possibles entre les quantités motrices relatives et la directionnalité du mouvement. Cet exemple de neurones de type sauvage indique que les vésicules Y-F-P-P-R-P-C, qui sont mobiles ou stationnaires, s’associent soit à la chaîne légère KINÉSINE un, soit à la dine, soit aux deux. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée dans les trois jours. En plus d’environ 10 jours de préparation à l’imagerie pré-EM des dispositifs micro-filliques et du neurone primaire, en trois jours, vous serez en mesure d’effectuer une imagerie en direct de la coloration immunofluorescente et de l’analyse des données.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’enregistrer le mouvement en direct de cargaisons et de neurones marqués par fluorescence qui ont été cultivés dans des dispositifs microfluidiques. Comment fixer les cellules C pendant l’imagerie, comment analyser la colocalisation en tant que résolution inférieure au pixel, et comment corréler la colocalisation d’une cargaison et de protéines motrices moléculaires avec le mouvement de la cargaison.