Name: Caractériser la composition de moteurs moléculaires sur les moyens axonale Cargo Utilisation de lanalyse Cargo Mapping (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Découvrez la cartographie de cargaisons pour caractériser les moteurs moléculaires sur les axones de neurones hippocampiques de souris. Cette méthode corréle la composition des protéines motrices avec la directionnalité du transport vésiculaire.

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Nous remercions Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman et Daniel Whisler pour leur aide dans l’adaptation et le développement du logiciel de quantification des analyses de cartographie du fret, et Emily Niederst pour son aide dans la fabrication des dispositifs microfluidiques. Ce travail a été soutenu en partie par une subvention NIH-NIA AG032180 à L.S.B.G. et à l’Institut médical Howard Hughes. L.S. a été soutenu en partie par une subvention de formation en bioinformatique des NIH T32 GM008806, S.E.E. a été soutenu par une bourse de la Fondation Damon Runyon pour la recherche sur le cancer, une subvention de formation en neuroplasticité des NIH AG000216, et par une subvention de la Fondation Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging, G.E.C a été soutenu par un prix NIH/NCATS 1 TL1 TR001114 et par la fondation Achievement Rewards for College Scientists.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole présenté ici permet la corrélation de la directionnalité du mouvement des particules fluorescentes individuelles en mouvement sur ​​la base de cargaison microtubules avec le type et la quantité de protéines motrices associées par rapport à des neurones vivants. Auparavant, la composition totale du moteur de cargaisons vésiculaires axonales a été dosée sur des populations hétérogènes de vésicules et des organites 9,15 biochimiquement purifiée. Cependant, la composition de moteur ...

Le transport intracellulaire est essentiel dans tous les types de cellules pour la délivrance de protéines, les membranes, les organelles et les molécules de signalisation cellulaire à divers domaines 1. Les neurones sont des cellules spécialisées avec très longues, projections polarisés qui dépendent de façon critique sur le transport intracellulaire des cargaisons essentielles pour leur livraison sur de longues distances à différents microdomaines axonales. Ce transport est médiée par kinésines et dynéines - deux grandes familles de protéines motrices moléculaires - qui se lient à des cargaisons et de suivre le long des microtubules polarisés en antérograde et rétrograde directions, respectivement. Alors que le mouvement rétrograde est principalement médiée par la dynéine, le mouvement dans le sens antérograde est facilitée par une grande famille, la diversité fonctionnelle de moteurs de kinésine. Par conséquent, le transport antérograde des cargaisons axonales pourrait être médiée par divers membres de la famille de la superfamille kinésine 1-5. Bien que certaines cargaisons se déplacent constamment dans les deux sens, ma plupart des cargaisons se déplacent de manière bidirectionnelle et inversent souvent sur ​​leur chemin vers leurs destinations finales 1,5-13. En outre, il a été démontré que les moteurs d&#39;opposition à directivité associé simultanément à cargaisons, ce qui soulève la question de savoir comment le mouvement réglementé de cargaisons est coordonné par des moteurs de polarité opposée 5-7. Ensemble, le transport de cargaisons axonales est un processus concerté qui est réglementée par la composition de moteurs et de leurs activités biochimiques spécifiques, qui sont à leur tour dépendent de divers adaptateurs et partenaires de liaison de réglementation 14. Pour décrire fidèlement le mécanisme de transport axonal pour une marchandise spécifique et à découvrir la réglementation sous-jacente de ce transport, il est primordial de déterminer la composition des protéines de moteur et de leurs partenaires de liaison réglementaires inhérents aux cargaisons individuelles lors de leur transport direct. D&#39;autres méthodes, par exemple des approches biochimiques, fournissent des estimations de mot moyenneou compositions sur les populations de vésicules hétérogènes purifiés, mais ces estimations ne révèlent pas le type ou la quantité de moteurs associés à des vésicules mobiles simples. En outre, la reconstitution de transport le long des microtubules vésicule préassemblés in vitro a permis de mesurer la quantité d&#39;un type de moteur à un niveau de 15 vésicule unique. Toutefois, ces expériences ne sont pas corrélés directement la quantité de moteurs avec des caractéristiques de transport de ces vésicules, et le transport mesurées en l&#39;absence de facteurs de régulation cellulaire. Un protocole est présentée ici, qui détermine la composition de moteur (type et la quantité relative des moteurs) de vésicules mobiles individuels à partir d&#39;immunofluorescence (IF) des données de mesure de manière endogène exprimé protéines motrices, et en corrélation de ces paramètres pour le transport direct des mêmes vésicules exactes dans les neurones 16. Cette méthode implique une cartographie précise des données SI-à-vivre mouvement de la cargaison. Ceci est accompli en growing neurones de l&#39;hippocampe de souris dans des dispositifs microfluidiques qui suit les protocoles établis, 17-19. Ces dispositifs permettent l&#39;identification et la corrélation (&quot;mapping&quot;) des axones et des cargaisons mobiles simples dans les modalités fixes et vivantes microscopie de lumière (Figure 1). Des neurones en culture sont transfectées avec des protéines par fluorescence de fret marqués dont le transport est imagée à une résolution spatiale et temporelle pour obtenir des informations détaillées mouvement qui est tracée dans kymographs. Au cours de l&#39;imagerie, les neurones sont fixées avec du paraformaldéhyde, et ensuite colorées avec des anticorps dirigés contre des protéines endogènes à moteur. Images de fret et moteurs fixes sont superposées sur kymographs de déplacement en live à la «carte» (colocalisent) les à la cargaison vivante mouvement trajectoires 16. Pour corréler le mouvement des cargaisons en direct avec l&#39;association de protéines motrices, colocalisation est analysée en utilisant un logiciel MATLAB sur mesure appelé «MoTor colocalisation &quot;16,20. Cargaisons et les moteurs marqués par fluorescence génèrent caractéristiques ponctuées limitée par la diffraction qui peuvent se chevaucher partiellement. Pour résoudre la position de chevauchement points lacrymaux, le logiciel adapte automatiquement la première gaussiennes pour chaque fonction d&#39;étalement de point, représentant puncta fluorescent individu, afin de déterminer leur position précise sous-pixel de coordonnées XY et l&#39;intensité des amplitudes de 21-23. Les positions des moteurs et des cargaisons par la suite par rapport à l&#39;autre afin de déterminer la colocalisation 16,20. Par conséquent, cette méthode attribue plus précisément entre les points lacrymaux colocalisation fluorescente par rapport à d&#39;autres méthodes 24. La force de cette méthode est la capacité d&#39;évaluer la colocalisation des moteurs à cargaison individuelle dans des cellules fixées, pour qui les trajectoires de mouvement vivants (par exemple, la direction dans laquelle ils se déplaçaient au moment de la fixation) ont été recorded. Avec cette méthode, les kinésines et dynéines ont été trouvés à la fois pour associer les vésicules qui transportent la protéine prion normale (PrPc -cellular), une cargaison enrichi neuronale qui se déplace de façon bidirectionnelle ou reste stationnaire dans les axones 16. Cette analyse a permis l&#39;élaboration d&#39;un modèle de travail pour la réglementation de la PrP C mouvement des vésicules dans lequel antérograde (kinésine) et (dynéine) moteurs rétrogrades coordonnent leurs activités afin de passer les vésicules dans les deux sens ou rester stationnaire pendant associée à la cargaison . Un autre point fort de cette méthode est son large potentiel d&#39;application pour la caractérisation de colocalisation / association de nombreuses marchandises marquées par fluorescence qui se déplacent dans pratiquement n&#39;importe quel type de cellule, avec toute autre protéine (s) d&#39;intérêt. Ainsi, la corrélation en temps réel / fixe pourrait potentiellement permettre la détection d&#39;interactions protéine-cargo transitoires, comme beaucoup individu marqué par fluorescence des particules en mouvement peut être analysé sur une p désiréeériode de temps. Compte tenu de la large applicabilité et le type de questions que cette méthode peut résoudre, ce protocole sera d&#39;intérêt pour un large public de biologistes cellulaires, y compris ceux qui étudient le trafic et le transport dans les neurones ou dans d&#39;autres types de cellules.

<table><tbody><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P5899-20mg</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM (Dulbecco' s Eagle Medium modifié) Glycémie élevée, avec L-Glutamine, sans Pyruvate de sodium (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Sérum de Bovin Fœtal)</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplément Sans Sérum Life Technologies</td><td></td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX I Supplement (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x) (Hank' Life Technologies</td><td></td> <td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco' s Solution saline tamponnée au phosphate, sans magnésium, sans calcium (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Corning cellgro Eau pour la culture cellulaire&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT46000CM</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>USB Corporation</td><td>19925</td><td></td></tr><tr><td>DL-cystéine HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9768</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albumine sérique bovine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I grade II</td><td>Roche Applied Sciences</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp ; </td><td></td>11668027</tr><tr><td>Solution de formaldéhyde 16 % EM Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>50980487</td><td>Attention : Nocif par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion. Irritant pour les yeux, le système respiratoire et la peau. Éliminez conformément aux réglementations officielles.</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H-3375</td><td></td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-0121</td><td></td></tr><tr><td>BSA sans acides gras et IgG Jackson</td><td>Immuno Research</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2403-4</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>Réactif anti-décoloration ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Verre de couverture 1 1/2. 24 x 40 mm</td><td>Corning</td><td>2980-244</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif microfluidique d’axe, 450 &micro ; m</td><td>Millipore</td><td>AX450</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U&nbsp ;</td><td>Appareil photo Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coolsnap HQ&nbsp ;</td>Antenne de culture cellulaire <td>Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-95</td><td></td></tr><tr><td>Antenne de culture cellulaire Fisher Scientific 150 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-100</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps utilisés :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chaîne légère anti-kinésine, V-17</td><td>Santa Cruz&nbsp ;</td><td>Spécificité sc-13362</td><td>vérifiée à l’aide de neurones KLC1-/- (Réf. 16), dilution recommandée 1:100.</td></tr><tr><td>Chaîne lourde anti-dynéine 1, R-325</td><td>Santa Cruz&nbsp ;</td><td>spécificité sc-9115</td><td>vérifiée à l’aide de shRNA contre DYN1HC1 (Réf. 16), dilution recommandée 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A10042</td><td>&nbsp ; dilution recommandée 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td>&nbsp ; dilution recommandée 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Anticorps IgG Anticorps Life</td><td>Technologies</td><td>A11057</td><td>&nbsp ; dilution recommandée 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A21447</td><td>&nbsp ; dilution recommandée 1:200.</td></tr><tr><td colspan="4">Plugins et Macros</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td><a href="http://imagej.nih.gov/ij/index.html">&nbsp ; http://imagej.nih.gov/ij/index.html.&nbsp ; </a></td></tr><tr><td>ImageJ Kymograph Plugin</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html">http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.</a></td></tr></tbody></table>

caractériser la composition de moteurs moléculaires sur les moyens axonale cargo utilisation de l&#39;analyse &quot;cargo mapping&quot;

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Comprendre les mécanismes par lesquels les moteurs moléculaires coordonnent leurs activités pour le transport de cargaisons vésiculaires dans les neurones nécessite l&#39;analyse quantitative des associations moteur / de fret au niveau de la vésicule unique. Le but de ce protocole est d&#39;utiliser la microscopie quantitative de fluorescence à corréler («carte»), la position et la directionnalité du mouvement de fret direct aux montants de composition et relatives des moteurs associés avec la même cargaison. &quot;Cartographie Cargo» se compose de l&#39;imagerie en direct de cargaisons marquées par fluorescence mobiles dans les axones cultivées sur des dispositifs microfluidiques, suivie par la fixation chimique lors de l&#39;enregistrement de mouvement direct, et immunofluorescence ultérieure (IF) des mêmes régions axonales exactes avec des anticorps contre les moteurs. Colocalisation entre cargaisons et leurs moteurs est évaluée en affectant la position sous-pixel de coordonnées de canaux de moteur et de fret, par gaussiennes de montage à la diffraction-lifonctions d&#39;étalement de point mited représentant sources ponctuelles fluorescentes individuelles. Images de fret et moteur fixe sont ensuite superposées à des parcelles de mouvement de la cargaison, à la «carte» à leurs trajectoires suivies. La force de ce protocole est la combinaison de vivre et si les données à enregistrer à la fois le transport de cargaisons vésiculaires dans des cellules vivantes et de déterminer les moteurs associés à ces mêmes vésicules exactes. Cette technique permet de surmonter les problèmes antérieurs qui utilisent des méthodes biochimiques pour déterminer la composition moyenne du moteur de populations purifiées de vésicules en vrac hétérogènes, car ces méthodes ne révèlent pas des compositions sur des cargaisons de mobiles simples. Par ailleurs, ce protocole peut être adapté à l&#39;analyse d&#39;autres voies de transport et / ou de traite dans d&#39;autres types de cellules à mettre en corrélation le mouvement des structures intracellulaires individuels avec leur composition en protéines. Limitations de ce protocole sont le débit relativement faible en raison des faibles efficacités de transfection de cultureneurones primaires et un champ de vision limité disponible pour l&#39;imagerie haute résolution. Les applications futures pourraient inclure des méthodes pour augmenter le nombre de neurones exprimant cargaisons marquées par fluorescence.

La figure 1 montre une vue d'ensemble du dispositif microfluidique utilisé pour la culture des neurones de l'hippocampe (figure 1A, B). Les neurones sont étalées dans le réservoir 1. La taille des micro-canaux empêche la diffusion de corps cellulaires (soma) dans le compartiment axonal tandis que la longueur des canaux d'éviter les projections dendritiques de traverser tout le chemin vers le compartiment axonal. Après ~ 2-3 jours de culture, les neurones commencent à étendre leurs axone...

Le transport intracellulaire des cargaisons, telles que les vésicules ou les organites, est effectué par des protéines motrices moléculaires qui suivent les microtubules polarisés. Ce protocole décrit la corrélation entre la directionnalité du transport des particules de cargaison individuelles se déplaçant à l’intérieur des neurones et la quantité relative et le type de protéines motrices associées.

Caractériser la composition de moteurs moléculaires sur les moyens axonale Cargo Utilisation de l&#39;analyse &quot;Cargo Mapping&quot;

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

L’objectif général de la cartographie du fret est de déterminer la quantité relative et le type de protéines motrices moléculaires qui s’associent et déplacent les cargaisons vésiculaires, et de corréler cette composition de moteurs avec une directionnalité du mouvement du fret en direct. Ceci est accompli en cultivant d’abord des neurones primaires de l’hippocampe de souris dans des dispositifs microfluidiques afin que les axones se développent relativement droits et en enregistrant le mouvement intracellulaire en direct des protéines cargo marquées par fluorescence dans les axones des neurones transfectés transitoirement. La deuxième étape consiste à fixer les neurones au cours de l’imagerie du cargo vivant, puis à colorer les axones avec des anticorps contre les protéines motrices moléculaires telles que la kinésine et les dines, suivie d’une imagerie par microscopie d’immunofluorescence.Ensuite, les images fixes de la cargaison et du moteur sont alignées sur les tracés du mouvement de la cargaison au fil du temps, également appelés krafts, afin de corréler le mouvement de la cargaison en direct avec les moteurs associés colorés, tels que déterminés par la coloration immunofluor

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Navettes moléculaires constitués de microtubules fonctionnalisés glissant sur la surface collée protéines motrices kinésine peut servir de système de transport nanométrique. Ici, le montage d'un système de navette typique est décrit.

Chargement du fret sur la kinésine Powered navettes moléculaires

Ici, un protocole est présenté pour identifier Kinesin-1 cargaisons. Un mutant sans moteur du Kinesin-1 chaîne lourde (KIF5B) agrège dans le cytoplasme et induit une agrégation de ses cargaisons. Les deux granulats sont détectés au microscope à fluorescence. Une stratégie similaire peut être utilisée pour identifier d'autres protéines cargos à moteur.

Identification des Kinesin-1 Cargos utilisant microscopie à fluorescence

L'objectif de ce protocole est de former des ensembles de moteurs moléculaires sur les nanostructures d'origami d'ADN et d'observer la motilité d'ensemble en utilisant la microscopie interne totale de fluorescence de réflexion.

Production d'ensembles moteurs d'adn et de kinésine sur des nanostructures d'origami d'ADN pour l'observation d'une seule molécule

Le transport mitochondrial altéré et la morphologie sont impliqués dans diverses maladies neurodegenerative. Le protocole présenté utilise des neurones de cerveaux avant dérivés de cellules souches pluripotentes induits pour évaluer le transport mitochondrial et la morphologie dans la paraplégie spastique héréditaire. Ce protocole permet la caractérisation du trafic mitochondrial le long des axones et l’analyse de leur morphologie, ce qui facilitera l’étude des maladies neurodégénératives.

Analyse du transport mitochondrial et de la morphologie dans les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans la paraplégie spastique héréditaire

Le transport axonal est un mécanisme crucial pour la santé des neurones moteurs. Dans ce protocole, nous fournissons une méthode détaillée pour suivre le transport axonal des compartiments acides et des mitochondries dans les axones des neurones moteurs à l’aide de chambres microfluidiques.

Transport axonal des Organlles dans les cultures de neurones moteurs à l’aide du système de chambres microfluidiques

Nous décrivons des méthodes de photoactivation de fluorescence pour analyser le transport axonal des neurofilaments dans les axones myélinis simples des nerfs périphériques des souris transgéniques qui expriment une protéine de neurofilament photoactivatable.

Imagerie et analyse du transport neurofilament dans le nerf tibial de souris excisée

La kinésine mitotique bidirectionnelle-5 Cin8 s’accumule en grappes qui se divisent et fusionnent au cours de leur motilité. L’accumulation en amas modifie également la vitesse et la directionnalité de Cin8. Ici, un protocole pour les tests de motilité avec Cin8-GFP purifié et l’analyse des propriétés mobiles de molécules uniques et de grappes de Cin8 est décrit.

Motilité de molécules uniques et d’amas de kinésine-5 Cin8 bidirectionnelle purifiée à partir de cellules de S. cerevisiae

À l’aide de souris fluorescentes transgéniques, des protocoles détaillés sont décrits pour évaluer le transport axonal in vivo des endosomes de signalisation et des mitochondries dans les axones moteurs et sensoriels du nerf sciatique intact chez les animaux vivants.

Élargir la boîte à outils pour l’imagerie in vivo du transport axonal

Cette étude détaille la purification de KIF1A (1-393LZ), un membre de la famille des kinésines-3, à l’aide du système d’expression du baculovirus Sf9. L’analyse in vitro de glissement monomoléculaire et multimoteur de ces moteurs purifiés a montré des propriétés de motilité robustes comparables à celles des moteurs du lysat de cellules de mammifères. Ainsi, le système Sf9-baculovirus est susceptible d’exprimer et de purifier la protéine motrice d’intérêt.

Analyse à molécule unique de moteurs de la famille Sf9 superprocessive kinésine-3 purifiée

L’article décrit l’optimisation des paramètres d’acquisition de la microscopie à fluorescence pour visualiser le transport axonal de cargaisons endogènes marquées à une résolution de neurone unique chez un nématode vivant.

Optimisation de la visualisation du transport axonal de la cargaison endogène par microscopie à fluorescence chez Caenorhabditis elegans vivant

Découvrez la cartographie de cargaisons pour caractériser les moteurs moléculaires sur les axones de neurones hippocampiques de souris. Cette méthode corréle la composition des protéines motrices avec la directionnalité du transport vésiculaire.

Caractériser la composition de moteurs moléculaires sur les moyens axonale Cargo Utilisation de l'analyse "Cargo Mapping"

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