Name: Pseudomonas aeruginosa lésion pulmonaire induite par modèle (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Apprenez à établir un modèle de lésion pulmonaire chez la souris par injection intratrachéale de Pseudomonas aeruginosa. Cette méthode permet d'étudier l'inflammation, la mort cellulaire et la réparation alvéolaire.

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Ce travail a été soutenu par les subventions HL105947-01 (YL), HL07829-16 (AM), HL090152 (AM) des National Institutes of Health.

Les expériences sur les animaux ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et des comités institutionnels sur la biosécurité de l&#39;Université de l&#39;Illinois à Chicago. NOTE: Toutes les procédures impliquant des pseudomonas doivent être effectuées avec le niveau de biosécurité 2 (BSL2) pratiques, qui comprennent, mais ne sont pas limités à: masque, protection oculaire, blouse ou combinaison, gants et doubles. Travailler dans le cabinet de biosécurité certifié. Traiter les instruments en contact avec des bactéries avec l&#39;eau de Javel ou de dioxyde de chlore désinfectant à base. Utilisez une boîte étanche pour transporter les échantillons. 1. P. aeruginosa Culture et de croissance <ol><li> Magasin P. aeruginosa PA103 comme un stock de bactéries dans un bouchon à vis cryovial à -80 ° C. </li><li> Placer le flacon dans un rack dans une boîte avec 70% d&#39;éthanol mouillé des serviettes en papier et prendre au laboratoire de biosécurité de niveau 2 (niveau L2). </li><li> Streak les bactéries sur des plaques de gélose au sang de mouton et se développent à 37 ° C pendant environ 15 heures dans un incubateur. </li&gt; <li> Dans une hotte BSL2, rayer les bactéries de la plaque avec des bactéries boucle et remettre en suspension dans 5 ml de PBS. </li><li> Conservez le stock à 4 ° C pendant 3 mois. Toutefois, déterminer le titre toutes les 2 semaines. </li><li> Diluer en série les bactéries dans du PBS (en général de 01:10 à 01:10 4 7) et la plaque à la dilution connue sur des plaques de gélose au sang de mouton. </li><li> Incuber les plaques pour ~ 15 heures. Compter les colonies et calculer unités formant colonie (UFC) pour déterminer la concentration de bactéries. </li><li> Remettre en suspension les concentrations appropriées (~ 5 x 10 3 UFC / ul) dans 0,5 ml de PBS dans des cryotubes de 1,5 ml à bouchon à vis stériles. Sceller les cryotubes et les placer dans un rack cryovial sur des serviettes en papier chargés désinfectant dans une boîte de couvercle à pression. </li><li> Transporter la boîte à l&#39;animalerie BSL2. Une fois là, ouvrir la boîte dans l&#39;armoire de BSL2. </li></ol> 2. P. aeruginosa instillation <ol><li> Effectuer la chirurgie de survie de façon aseptique (gants stériles, des instruments stérileset les techniques aseptiques). Utilisez un champ stérile pour fournir une surface de travail pour (autoclave) instruments chirurgicaux stériles. Stériliser les instruments à l&#39;aide d&#39;un stérilisateur de perles chaud entre chaque instillation trachéale procédure. </li><li> Peser souris avant l&#39;anesthésie. Anesthésier les souris avec de la kétamine (100 mg / kg), de xylazine (5 mg / kg), en 0.1 - 0.2 ml de PBS par voie intrapéritonéale (ip). Déterminer l&#39;efficacité de l&#39;anesthésique par des non-réactivité de pincement de l&#39;orteil. Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. </li><li> Retenez souris sur un bord chirurgicale dans BSL2 armoire. </li><li> Identifier la zone de la coupe vers le bas. Rasez ce domaine et préparer la peau à l&#39;aide alternance alcool et povidone prélèvements d&#39;iode 3 fois. </li><li> Traiter la zone d&#39;incision avec un anesthésique local (lidocaïne) que cette anesthésie est suffisante pour une chirurgie mineure comme une incision de la peau pour accéder à la trachée. </li><li> Faire une petite incision (environ 5 mm) sur la ligne médiane du cou, et utiliser émoussé forceps de se déplacer doucement sur le muscle pour l&#39;accès à la trachée. Exposer la trachée par dissection chirurgicale. </li><li> Dessinez solution de bactéries dans une seringue de 1 ml à usage unique avec aiguille 27 G. Pour chaque souris, l&#39;administration de 20 à 30 pl de bactéries à la concentration appropriée (jusqu&#39;à 10 5 CFU chaque souris). </li><li> Insérer l&#39;aiguille dans la trachée. Injecter la solution lentement dans la trachée. </li><li> Veiller à ce que les halètements des animaux, ce qui indique généralement que la solution a atteint dans les poumons. </li><li> Fermer la plaie avec des sutures stériles (6-0 monofilament) dans des conditions aseptiques. </li><li> Utilisez 0,1 mg / kg de buprénorphine par injection sous-cutanée post-op analgésie pour contrôler la douleur post-chirurgicale. </li><li> Assurez-vous que le temps nécessaire à l&#39;induction de l&#39;anesthésie initiale de fermeture de l&#39;incision est inférieure à 15 min. </li><li> Après l&#39;injection, jeter les seringues et aiguilles dans un container approprié approprié. </li><li> Traiter les instruments chirurgicaux avec Disi base de dioxyde de chlorenfectant pendant 15 minutes, rincer et retourner au laboratoire pour la stérilisation et de réutiliser au besoin. </li><li> Maison des souris individuellement dans des cages propres au cadre chaleureux. </li><li> Vérifiez sur l&#39;animal toutes les 30 min jusqu&#39;à ce qu&#39;elle reprenne conscience et commence à se déplacer; et plus tard, à des intervalles de 12 h pour les 3 premiers jours après la chirurgie. </li><li> Conserver les souris dans le centre de BSL2 animal tout au long de l&#39;expérience. Assurez-vous que seul tissu contenu dans la boîte scellée de quitter l&#39;établissement BSL2 animale. Si les souris expriment l&#39;un des comportements moribonds (définie comme la détresse respiratoire, léthargie, absence de déambuler en réponse à une stimulation douce) à tout moment de l&#39;étude, euthanasier les souris par inhalation de CO 2 provenant d&#39;une source en bouteille suivie par dislocation cervicale. </li><li> Euthanasier le sujet expérimental par exsanguination sous anesthésie. <ol><li> Recueillir les tissus pulmonaires de souris euthanasiées. Effectuer ces procédures dans une hotte de BSL2. Si nécessaire, transférer l&#39;échantillon en utilisant des tubes étanches placées dans un rack sur des serviettes en papier chargés désinfectant dans une boîte de couvercle à pression pour plus de processus. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le poumon de la souris modèle de lésion Pseudomonas que nous décrivons ici imite l&#39;ensemble du processus de l&#39;inflammation, des lésions pulmonaires, la réparation, et la résolution qui se produisent suite à une lésion pulmonaire aiguë ou la pneumonie. Il a des avantages uniques comparaison avec plusieurs autres modèles de lésion en ce qu&#39;il est cliniquement pertinent et relativement sûr et facile à manipuler. L&#39;étape critique dans la procédure est que l&#39;injection de la so...

Poumons sont exposés à des agents pathogènes environnementaux et sont sensibles à l&#39;inflammation et les lésions 1-3. Dans des conditions pathologiques telles que la pneumonie ou syndrome de détresse respiratoire adulte (SDRA), les agents pathogènes ainsi que les facteurs inflammatoires libérés par les leucocytes provoquent des blessures et la mort des cellules alvéolaires 1-3. Il est important de développer des modèles animaux de lésion pulmonaire aiguë de faciliter l&#39;étude de la pathologie de la blessure ainsi que le mécanisme de réparation. Actuellement, la plupart des gens utilisent des modèles de lésions pulmonaires hyperoxie et la bléomycine souris induit 4. Cependant, les mécanismes d&#39;hyperoxie blessures causées ne sont pas les mêmes que la plupart des lésions pulmonaires courantes qui se produisent au cours de la pneumonie ou de l&#39;ARDS 5. La bléomycine blessure aiguë induite est rare dans un contexte clinique 4. Nous rapportons ici un modèle de lésion pulmonaire de la souris par injection intra-trachéale de P. aeruginosa 6,7. Ce modèle est cliniquement pertinente, et imite la processus qui se produisent suite à une pneumonie 8. Comme, un pathogène nosocomial opportuniste des individus immunodéprimés, P. aeruginosa infecte habituellement les voies pulmonaires, des voies urinaires, des brûlures, des plaies, et provoque également d&#39;autres infections du sang 6. La bactérie produit virulence facteur exotoxine A, se multiplient et déclenchent des réactions immunitaires 6. L&#39;administration intra-trachael de P. aeruginosa correspond à la situation dans l&#39;exposition des humains à des bactéries qui provoquent la pneumonie et à la pathologie est susceptible d&#39;être différente de la grippe H1N1 du virus de la grippe pulmonaire induite modèle de lésion récemment rapporté 9. Depuis P. aeruginosa est un agent pathogène opportuniste, il est relativement sûr à manipuler par rapport à certains des agents pathogènes les plus virulentes. Ici, nous avons utilisé l&#39;injection intra-trachéale à administrer les bactéries, car nous avons constaté que cette méthode introduit plus de bactéries dans la région distale alvéoles du poumon par rapport àd&#39;autres procédures telles que l&#39;utilisation d&#39;un cathéter par la bouche. Comparé à d&#39;autres modèles de lésion pulmonaire aiguë, le P. aeruginosa modèle décrit ici est adapté à l&#39;étude des lésions pulmonaires induites par les bactéries et par une inflammation excessive. Contrairement à d&#39;autres modèles animaux qui utilisent P. aeruginosa pour induire une septicémie 10,11, ici nous utilisons injection intra-trachéale de ces bactéries à induire des lésions pulmonaires aiguës localisées.

<table><tbody><tr><td>Anesthésique : Kétamine, xylazine, lidocaïne, buprénorphine</td><td></td><td></td><td>Calibre pharmaceutique</td></tr><tr><td>27 G Aiguille</td><td></td><td>Fisher 1482648</td><td></td></tr><tr><td>seringue</td><td>Fisher</td><td>14823434</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>ciseaux</td><td>Outils de science</td><td></td><td></td>fine</tr><tr><td>Pince</td><td>Outils de science</td><td></td><td></td>fine</tr><tr><td>Suture&nbsp ;</td><td>Fisher</td><td>19-037-526</td><td></td></tr><tr><td>Jauge oculaire, gant, blouse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Désinfectant <td></td><td></td><td>à base de dioxyde de chlore</td><td>Clidox</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques de gélose au sang de mouton Clidox&nbsp ;</td><td>Alimentation Medex</td><td>HL-1160</td><td></td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa lésion pulmonaire induite par modèle

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Afin d&#39;étudier les lésions pulmonaires aiguës humaine et la pneumonie, il est important de développer des modèles animaux pour imiter différentes caractéristiques pathologiques de cette maladie. Ici, nous avons développé un modèle de lésion pulmonaire de la souris par injection intra-trachéale de bactéries Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa ou PA). En utilisant ce modèle, nous avons pu montrer une inflammation des poumons à la phase précoce de la lésion. En outre, alvéolaire perméabilité de la barrière epitheliale a été observée par analyse de lavage broncho-alvéolaire (BAL); et la mort cellulaire alvéolaire a été observé par essai TUNEL en utilisant un tissu préparé à partir de poumons blessés. Lors d&#39;une étape ultérieure après la lésion, on a observé une prolifération cellulaire requis pour le processus de réparation. La blessure a été résolue 7 jours à compter de l&#39;ouverture de P. injection aeruginosa. Ce modèle imite le parcours séquentiel de l&#39;inflammation pulmonaire, une lésion et de réparation pendant une pneumonie. Ce modèle animal cliniquement pertinente est adapté pour l&#39;étude de la pathologie, le mécanisme de réparation, fuite une lésion pulmonaire aiguë, et peut également être utilisé pour tester des agents thérapeutiques potentiels pour cette maladie.

A partir de 24 à 72 heures après P. injection aeruginosa, cellularité accrue a été observée dans les coupes pulmonaires (figure 1A-D). Le poumon a commencé à récupérer à partir de 96 h après la lésion (figure 1E). 7 jours après P. aeruginosa, morphologie alvéoles normale a été en grande partie restaurée (figure 1F). Sections à l'aide du poumon tunnel de coloration préparés à 24 heures après P. aeruginosa a montré la mort cellulaire da...

Nous avons développé un modèle de lésions pulmonaires chez la souris par injection intra-trachéale de la bactérie Pseudomonas aeruginosa. Ce modèle imite les lésions pulmonaires lors d’une pneumonie et est cliniquement pertinent.

Pseudomonas aeruginosa lésion pulmonaire induite par modèle

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

L’objectif global de cette procédure est d’imiter la pneumonie, les lésions pulmonaires chez la souris par l’administration de pseudomonas aerogen. Pour ce faire, il faut d’abord préparer les pseudomonas à la concentration appropriée pour l’injection. Dans un deuxième temps, la trachée de souris est soigneusement exposée, puis les bactéries sont administrées aux poumons par injection intratrachéale.Dans la dernière étape, la progression de la maladie chez la souris est surveillée attentivement. En fin de compte, l’inflammation pulmonaire, les changements de mort cellulaire dans la barrière alvéolaire et la réparation pulmonaire peuvent être étudiés dans le poumon de souris injecté de pseudomonas aerogen. Les implications de cette technique s’étendent au traitement des lésions pulmonaires aiguës causées par la pneumonie.Comme ce modèle imite les processus suivant une pneumonie Pour créer des quantités de p Aerogen, PA 1 0 3 pour l’installation, commencez par transporter une fiole cryogénique des bactéries de moins 80 degrés Celsius, stockage au laboratoire de niveau de biosécurité deux ou BSL deux dans un rack dans une boîte doublée d’essuie-tout mouillés à 70 % d’éthanol. Ensuite, sous une traînée BSL à deux capuchons, le P aerogen PA 1 0 3 colonies bactériennes sur des plaques de gélose au sang de mouton, et fait pousser les colonies dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Après environ 15 heures, utilisez une boucle bactérienne pour transférer les colonies dans cinq millilitres de PBS.Ensuite, diluez en série les bactéries dans plus de PBS à un à 10, à quatre, à un à 10 à sept concentrations sur des plaques de gélose au sang de mouton frais. Ensuite, après environ 15 heures d’incubation, calculez les unités formant colonie pour chaque plaque afin de déterminer la concentration de bactéries. Ensuite, Eloqua la quantité appropriée de bactéries dans 0,5 millilitre de PBS dans 1,5 millilitre, des flacons cryogéniques stériles à bouchon à vis, puis placez les flacons scellés dans un support de flacons cryogéniques sur des serviettes en papier chargées de désinfectant dans une boîte à couvercle amovible dans une armoire BSL deux, couvrez doucement les yeux de l’animal avec une pommade de veto efficace.Rasez rapidement l’incision et nettoyez la peau en utilisant trois fois des écouvillons alternés d’alcool et de povidone iodée et confirmez la sédation par l’orteil. Pincez, retenez la souris sur une planche chirurgicale après avoir traité la peau avec un anesthésique local. Ensuite, faites une petite incision de cinq millimètres sur la ligne médiane du cou de l’animal et utilisez des pinces émoussées pour déplacer doucement le muscle afin d’accéder à la trachée.Lorsque la trachée a été exposée, aspirez jusqu’à une fois 10 à cinq unités formant colonie de la bactérie dans 20 à 30 microlitres de PBS dans une seringue jetable d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 27. Insérez ensuite l’aiguille dans la trachée et injectez lentement la solution. Assurez-vous que l’animal halète, ce qui indique généralement que la solution a atteint les poumons.Maintenant, fermez aseptiquement la plaie avec six sutures stériles à zéro monofilament et administrez l’analgésie postopératoire. Ensuite, jetez les seringues et les aiguilles dans le contenant approprié pour objets tranchants et tranchants présentant un risque biologique après l’injection de chaque animal. Comment les myers se sentent-ils seuls dans des cages propres dans un environnement chaud ?Vérifier les animaux toutes les 30 minutes jusqu’à ce qu’ils reprennent conscience et commencent à bouger. Traitez les instruments chirurgicaux avec un désinfectant au dioxyde de chlore pendant 15 minutes. Ensuite, rincez et retournez les outils au laboratoire pour une stérilisation supplémentaire si nécessaire.Hébergez les souris dans l’installation pour animaux BSL two tout au long de l’expérience, puis, après l’exsanguination sous anesthésie, collectez le tissu pulmonaire de chaque animal sous une cagoule BSL two. Enfin, si un traitement supplémentaire est souhaité, transférez les échantillons dans des tubes scellés placés sur un support sur des essuie-tout chargés de désinfectant dans une boîte à couvercle à pression vers l’installation de traitement appropriée. Dans cette expérience représentative, 24 à 72 heures après l’injection d’aérogène P, une augmentation de la cellularité peut être observée dans les sections pulmonaires.Au bout de 96 heures, le poumon a commencé à se rétablir et au bout de sept jours, la morphologie normale des alvéoles est en grande partie rétablie. La coloration en tunnel de sections pulmonaires préparée 24 heures après l’installation de l’aérogène P montre la mort cellulaire dans les cellules alvéoles pour étudier le processus de réparation. Dans cette lésion, le modèle BRDU peut être injecté dans les souris trois jours après l’administration de p aerogen.Comme nous l’avons illustré, les animaux traités par l’aérogène p présentent une hyperprolifération dans le tissu pulmonaire par rapport aux animaux témoins traités. Pour étudier les changements de barrière, de perméabilité et d’inflammation après une blessure, le lavage broncho-alvéolaire ou le liquide intestinal peuvent être collectés à différents points temporels. Après l’injection d’aérogène p, par exemple, la concentration de protéines dans l’intestin est significativement augmentée 48 heures après l’installation bactérienne, ce qui indique une fuite de la barrière épithéliale du nombre de cellules.L’intestin augmente également de manière significative à ce moment-là, ce qui suggère une réponse inflammatoire quatre à cinq jours après l’injection de l’aérogène P, le niveau de protéines intestinales et le nombre de cellules commencent à diminuer, ce qui suggère une récupération. De plus, le taux de protéine inflammatoire des macrophages deux, une cytokine impliquée dans l’attraction des neutrophiles, augmente significativement à 48 heures, puis revient à des niveaux basaux à 96 heures. Dans les lysats pulmonaires sans p aérogène, seul un petit nombre de monocytes est observé dans le liquide intestinal.En revanche, un grand nombre de neutrophiles sont présents dans l’intestin, isolés 48 heures après l’injection. Au bout de 96 heures, la composition cellulaire de l’intestin revient à des niveaux de contrôle Après cette procédure. D’autres méthodes telles que l’histologie, la section ou le prélèvement de lavage broncho-alvéolaire peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que : quelles cellules ou quels facteurs sont impliqués dans l’inflammation et la réparation après une lésion pulmonaire aiguë ?

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous décrivons la méthode agar-perles d'établir une infection persistante chronique des voies respiratoires à Pseudomonas aeruginosa à long terme dans le modèle de la souris.

Chronique à long terme<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infection des voies respiratoires chez les souris

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Méthodes pour détecter les cytotoxiques amyloïdes suivant Infection de pulmonaire cellules endothéliales par Pseudomonas aeruginosa

Présenté ici est une procédure étape par étape pour induire des dommages aigus de poumon chez les souris par l'instillation intratracheal directe de lipopolysaccharide et pour effectuer l'analyse FACS des échantillons de sang, du fluide de lavage bronchoalveolar, et du tissu de poumon. L'invasivité minimale, la manipulation simple, la bonne reproductibilité, et la titration de la sévérité de la maladie sont des avantages de cette approche.

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Nous décrivons un protocole retardé d’inoculation pour produire des infections chroniques de blessure dans les souris immunocompétentes.

Un modèle d’inoculation retardée de pseudomonas chronique infection de blessure d’aeruginosa

Ce manuscrit décrit l’établissement d’un modèle infectieux de pneumonie chez la souris et la caractérisation respective de la résolution des lésions ainsi que les méthodes de croissance bactérienne et d’instillation intratrachéale. Une nouvelle approche utilisant la cytométrie en flux de grande dimension pour évaluer le paysage immunitaire est également décrite.

Modèle expérimental pour évaluer la résolution de la pneumonie

Il existe actuellement un manque de modèles in vivo permettant le dépistage de médicaments contre les infections bactériennes chroniques. Ici, nous décrivons un protocole d’infection de la plaie par un isolat clinique de Pseudomonas aeruginosa pour générer une infection persistante chez les larves de poisson-zèbre.

Modélisation de l’infection persistante à Pseudomonas aeruginosa chez les larves de poisson-zèbre blessées

Dans cette étude, une technique d’instillation endotrachéale non invasive a démontré le développement d’AL chez les rats à l’aide d’un laryngoscope basique pour garantir une livraison précise de LPS aux poumons. Le LPS est injecté via un tube endotrachéal à l’aide d’un laryngoscope. L’ampleur de la lésion pulmonaire est évaluée à plusieurs moments.

Administration endotrachéale non invasive de lipopolysaccharide pour induire une lésion pulmonaire aiguë chez les rongeurs

Apprenez à établir un modèle de lésion pulmonaire chez la souris par injection intratrachéale de Pseudomonas aeruginosa. Cette méthode permet d'étudier l'inflammation, la mort cellulaire et la réparation alvéolaire.

Pseudomonas aeruginosa lésion pulmonaire induite par modèle

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