Name: Lutilisation de MALDI-TOF spectrométrie de masse et une base de données personnalisée pour caractériser les bactéries indigènes à un environnement unique Cave (Kartchner, AZ, USA) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Découvrez l'identification bactérienne par spectrométrie de masse MALDI-TOF MS. Cette méthode utilise l'analyse de clusters et le matching de pics pour caractériser les bactéries indigènes d'une grotte unique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par le New College of Interdisciplinary Arts and Sciences de l’Université d’État de l’Arizona, Applied Maths NV, et par la National Science Foundation (ROA Supplement to Award No. MCB0604300). Les opinions, les constatations, les conclusions ou les recommandations exprimées dans ce document sont celles de l’auteur ou des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les opinions de la National Science Foundation.

Attention: les bactéries non identifiés de ne importe quel environnement peuvent être pathogènes et doivent être manipulés avec prudence en utilisant des protocoles de biosécurité appropriées. Travailler avec des cultures vivantes doit être effectuée dans une armoire de biosécurité de classe II en utilisant de sécurité biologique de niveau 2 (BSL-2) procédures. Plus d&#39;informations sur BSL-2 procédures est disponible dans le manuel CDC / NIH intitulé «prévention des risques biotechnologiques en laboratoires microbiologiques et biomédicaux», pages 33-38. Le document est disponible en ligne à <a href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf</a> . Équipement de protection individuelle (EPI), y compris les sarraus de laboratoire / robes, des lunettes de sécurité et des gants en nitrile ou en latex, doit être porté. Pratiques et précautions microbiologiques standards doivent être respectées, et des déchets biologiques dangereux doivent être éliminés de façon appropriée. Bactéries utilisées dans cette démonstration ont été isolés à partir Kartchner,AZ, États-Unis, à partir de quatre environnements, y compris spéléothème sèche, la pierre de flux, spéléothème humide et stalactite goutte à goutte (tableau 1). Tous les isolats ont été identifiés par séquençage de l&#39;ADNr 16S et conservés à -80 ° C dans 25% de glycérol-R milieu 2B. Toutes les expériences ont été réalisées à température ambiante. Note: Nous vous recommandons d&#39;utiliser la même méthode de préparation d&#39;échantillon d&#39;acquérir des spectres de masse pour la construction de base de données et les spectres de masse d&#39;inconnues. Méthode de préparation des échantillons a été montré précédemment affecter la qualité du spectre et la reproductibilité 3. En utilisant une méthode de préparation d&#39;échantillon différent peut provoquer une mauvaise identification d&#39;inconnus, surtout quand résolution taxonomique plus élevé (par exemple, au niveau de la souche) est souhaitée. 1. dépôt sur la cible MALDI Attention: Plusieurs protocoles d&#39;obtenir des extraits de protéines nécessitent l&#39;utilisation d&#39;acides et de solvants organiques qui doivent être utilisé conformément aux guidElines et informations contenues dans leurs fiches respectives de données de sécurité des matériaux (MSDS). EPI approprié doit être porté et variera en fonction des type et le volume des produits chimiques utilisés (par exemple, sarraus de laboratoire / robes, des gants, des lunettes de sécurité, et la protection respiratoire doit être utilisée lorsque vous travaillez avec des quantités importantes de solvants toxiques et inflammables, tels que l&#39;acétonitrile, et des acides corrosifs, tels que les acides formique et trifluoroacétique). <ol><li> Dépôt de 1 pi d&#39;extrait de protéine ne contenant pas de cellules viables (obtenues à l&#39;aide de protocoles appropriés, décrits précédemment 11 à 13) sur une plaque de cible MALDI en acier inoxydable et le laisser sécher. Superposer l&#39;extrait protéinique séchée avec une solution de matrice ul (α-cyano-4-hydroxy-cinnamique solution d&#39;acide), et laisser sécher. </li><li> Pour chaque répétition biologique, repérer un nombre approprié de répétitions techniques (5-20 réplicats techniques). Ici, repérer 10 répétitions techniques pour chaque répétition biologique et trois répétitions biologiques were préparé. Note: Nous recommandons d&#39;utiliser un MALDI plaque cible en acier poli en utilisant la méthode de préparation des échantillons d&#39;extraction de protéines. Utilisation des plaques cibles de masse d&#39;acier peut provoquer une contamination accidentelle et la propagation des différents échantillons à l&#39;extérieur du puits d&#39;échantillon individuels. </li><li> Dépôt 1 ul norme d&#39;étalonnage sur la plaque cible et laisser sécher. Superposition avec une solution de matrice de pi et laisser sécher. </li><li> Dépôt solution de 2 ul de matrice sur la plaque cible en tant que témoin négatif. </li></ol> 2. Acquisition spectres de masse <ol><li> Utilisez un spectromètre de masse MALDI-TOF équipé d&#39;un laser d&#39;azote (λ = 337 nm) et exploité en utilisant un logiciel Bruker FlexControl. </li><li> Recueillir chaque spectre de masse en mode linéaire positive par l&#39;accumulation de 500 tirs laser par incréments de 100 tir. Régler la tension source d&#39;ions 1 à 20 kV; tension de la source d&#39;ions 2 18,15 kV; et la tension de la lentille à 9,05 kV. A noter que ces paramètres sont instrument spécific et pourrait nécessiter un ajustement sur d&#39;autres instruments pour obtenir des résultats optimaux. </li><li> Définissez la plage de masse-charge pour l&#39;évaluation automatisée du spectre 2-20 kDa par charge. Utiliser l&#39;algorithme de détection de pic centroïde. Réglez le seuil minimum de la résolution à 100 Da. Réglez le rapport signal sur bruit (S: N) seuil à 2. Réglez le seuil d&#39;intensité minimum à 100. </li></ol> 3. Base de données Construction <ol><li> la conception de base de données <ol><li> Créer une nouvelle base de données dans BioNumerics 7.1 utilisant le &quot;Nouvel assistant de base de données&quot;. </li><li> Créer un type d&#39;expérimentation du spectre, par exemple, Maldi, en utilisant les commandes dans le panneau &quot;Types de Experiment&quot;. </li><li> Créez les niveaux en utilisant le &quot;panneau de conception de base de données&quot;. Ajouter de nouveaux niveaux en utilisant le &quot;Niveau&gt; Ajouter nouveau niveau ...&quot; commande dans le menu &quot;Base de données&quot;. Ici, créer des &quot;espèces&quot; niveau &quot;, réplique biologique&quot; niveau &quot;et&quot; répétition technique &quot;niveau, respectivEly. </li></ol></li><li> Importation et prétraitement des spectres de masse brute <ol><li> Exporter les spectres de masse brute sous forme de fichiers .txt utilisant Flexanalysis en cliquant sur le &quot;Exporter&gt; Spectre de masse&quot; dans le menu &quot;Fichier&quot;. </li><li> Importez les spectres de masse brute (fichiers .txt) dans la base de données dans le niveau des répétitions techniques. </li><li> Prétraiter les spectres de masse brute. <ol><li> Importation et rééchantillonnage (en utilisant un algorithme d&#39;ajustement quadratique). </li><li> Effectuer une soustraction de ligne de base (avec un disque de roulement avec une taille de 50 points). </li><li> Calculer le bruit [transformation en ondelettes continue (CWT)], lisse (Kaiser Fenêtre avec une taille de fenêtre de 20 points et bêta de 10 points), et effectuer une seconde soustraction de base (laminage disque avec la taille de 200 points). </li><li> Détecter des pics [CWT avec un signal minimum sur bruit (S: N) 10]. </li></ol></li><li> Après prétraitement, mémoriser les motifs caractéristiques de chaque spectre de masse, tels que les listes de pointe contenant pictailles, des intensités de pointe, S: N, etc., dans la base de données. </li></ol></li><li> Création spectre de masse composite <ol><li> Créer spectres composite à partir des spectres prétraités à l&#39;aide de la commande &quot;Résumer ...&quot; dans le menu &quot;Analyse&quot;. Choisissez l&#39;option &quot;répétition biologique» comme niveau cible. </li><li> Ici, combiner les spectres de masse de 10 répétitions techniques de la même colonie pour obtenir un spectre de masse composite pour cette colonie, résultant en trois spectres de masse composite pour que isolat au niveau &quot;répliqué biologique&quot;. </li><li> Ici, résumer les trois spectres composite pour créer une spectre composite pour qui isolent au niveau «espèces». Remarque: Le spectre composite est la moyenne de point par point des répétitions techniques. Réplique d&#39;une similitude (de corrélation de Pearson) à la moyenne inférieure à 95% (réglage par défaut) sont exclus du composite. Les pics sur le spectre composite sont appelés seulement se ils sont présents dans 75% (réglage par défaut) des répétitions incluses. Pour les répétitions biologiques, ces paramètres étaient de 90 et 60%, respectivement. </li></ol></li></ol> Analyse 4. Spectre de masse de données <ol><li> Sélectionnez les entrées dans la base de données et de créer une comparaison en cliquant sur la commande &quot;Créer un nouveau rapport&quot; dans le panneau &quot;comparaisons&quot;. </li><li> Ici, utiliser les spectres de masse à la &quot;répétition technique&quot; et / ou les niveaux &quot;répétés biologique&quot; pour montrer des comparaisons et des analyses. </li><li> Analyse de cluster basé similarité et l&#39;analyse multidimensionnelle (MDS) <ol><li> Créer des groupes avec des couleurs. Sélectionnez les trois biologique spectre de masse composite et cliquez sur &quot;Créer un nouveau groupe de la sélection&quot; commande dans le menu &quot;Groupes&quot; pour créer un groupe pour l&#39;isolat correspondante. Désigner une couleur automatiquement utilisé pour ces trois spectres de masse. </li><li> Alternativement, définir des états de terrain avec des couleurs correspondantes en utilisant les commandes dans le &quot;Base de données entrées panel &quot;de telle sorte que tout groupement basée sur ce champ défini utilise la même couleur définie pour ce groupe. </li><li> Effectuer une analyse cluster. Cliquez sur la commande &quot;Calculer l&#39;analyse de cluster» dans le menu «Clustering». Sur la comparaison des paramètres Page 1, sélectionnez le «corrélation de Pearson&quot; et laissez les autres paramètres par défaut. À la page 2, sélectionnez &quot;UPGMA&quot;. Puis cliquez sur &quot;Terminer&quot;. </li><li> Obtenir un complot MDS utilisant la &quot;mise à l&#39;échelle multidimensionnelle ...&quot; commande dans le menu &quot;Statistiques&quot;. </li></ol></li><li> Appariement pic <ol><li> Cliquez sur le type de spectre &quot;Maldi&quot; dans le panneau &quot;expériences&quot;. Ensuite, sélectionnez &quot;Mise en page&gt; Voir l&#39;image&quot;. Spectra sont présentés comme des bandes de gel. </li><li> Effectuer une comparaison pic en utilisant la commande &quot;faire de la correspondance pic&quot; dans le menu &quot;Spectra&quot;. </li></ol></li><li> Identification des classes de pointe <ol><li> Effectuer l&#39;analyse en composantes principales (ACP). Mettez en surbrillance le &quot;Maldi &quot;type de l&#39;expérience dans le&quot; expérimentale &quot;panneau et utiliser le&quot; Analyse en Composantes Principales ... &quot;dans le menu&quot; statistique &quot;pour effectuer PCA. </li><li> Effectuer regroupement dans les deux sens. Cliquez sur le &quot;Statistiques&gt; minière Matrix&quot; ... dans la fenêtre &quot;Comparaison&quot;. L&#39;intensité des pics appariés aux classes de pointe est représenté en utilisant des couleurs différentes (carte de chaleur). </li></ol></li></ol> 5. Les bactéries d&#39;identification avec une base de données personnalisée <ol><li> Méthode fondée sur la similarité coefficient- <ol><li> Créer une comparaison et de générer un dendrogramme basé sur des spectres de masse au niveau &quot;répliqué technique&quot; tel que décrit à l&#39;étape 4.3.3. Enregistrez le dendrogramme de comparaison de similitude. </li><li> Sélectionnez un spectre de masse inconnue, et cliquez sur le &quot;Analyse&gt; Identifier entrées sélectionnées&quot;. La boîte de dialogue d&#39;identification apparaît. </li><li> Sélectionnez le &quot;Comparaison basée&quot; type de classificateur (ou un classif stockéeIER) et cliquez sur &quot;suivant&quot;. Sur la page suivante, choisissez le dendrogramme enregistré comme une comparaison de référence, puis cliquez sur &quot;Suivant&quot;. </li><li> Choisissez l&#39;option &quot;similitude de base&quot; comme une méthode d&#39;identification et puis cliquez sur &quot;Suivant&quot;. </li><li> Choisissez l&#39;option &quot;similitude maximale» comme méthode de notation. Tapez les valeurs de seuil appropriées et valeurs de différence minimum pour chaque paramètre, puis cliquez sur &quot;Suivant&quot;. </li><li> Une fois les calculs sont terminés, la fenêtre d&#39;identification apparaît. Dans le panneau &quot;Résultats&quot;, les membres de la base de données qui correspondent le mieux l&#39;inconnu sont répertoriés. </li><li> Enregistrez le projet d&#39;identification et valider l&#39;identification en utilisant le &quot;analyse de validation croisée&quot; dans le panneau &quot;projet d&#39;identification&quot;. </li></ol></li><li> Méthode basée sur les biomarqueurs potentiel <ol><li> Définir des classes de pointe. Dans la fenêtre «Matrix Mining&quot;, sélectionner des ensembles de pics des caractéristiques communes et de définir ces pics que spéciles classes fic de pointe (biomarqueurs potentiels) en utilisant &quot;Spectra&gt; Gérer les types de classe de pointe ...&quot; dans la fenêtre &quot;Comparaison&quot;. </li><li> Ici, définir des classes de pointe spécifiques pour chaque isolent pour tous les 15 isolats. </li><li> Sélectionner les spectres de masse d&#39;inconnues et faire correspondre les sommets de ces spectres pour les classes de pointe définis comme précédemment décrit. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review.</a> Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).</li>
<li>Siegrist, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+and+characterization+of+environmental+strains+of+Escherichia+coli+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry+%28MALDI-TOF-MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Meth%22%5BJournal%5D)">Discrimination and characterization of environmental strains of Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS).</a> J Microbiol Meth. 68 (3), 554-562 (2007).</li>
<li>Goldstein, J. E., Zhang, L., Borror, C. M., Rago, J. V., Sandrin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+conditions+and+sample+preparation+methods+affect+spectrum+quality+and+reproducibility+during+profiling+of+Staphylococcus+aureus+with+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Culture conditions and sample preparation methods affect spectrum quality and reproducibility during profiling of Staphylococcus aureus with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Lett Appl Microbiol. 57 (2), 144-150 (2013).</li>
<li>Benagli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+MALDI-TOF+MS+identification+database+at+genospecies+level+for+clinical+and+environmental+Aeromonas+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A rapid MALDI-TOF MS identification database at genospecies level for clinical and environmental Aeromonas strains.</a> Plos One. 7 (10), (2012).</li>
<li>Sauer, S., Kliem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+tools+for+the+classification+and+identification+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (1), 74-82 (2010).</li>
<li>Bohme, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpectraBank%3A+An+open+access+tool+for+rapid+microbial+identification+by+MALDI-TOF+MS+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">SpectraBank: An open access tool for rapid microbial identification by MALDI-TOF MS fingerprinting.</a> Electrophoresis. 33 (14), 2138-2142 (2012).</li>
<li>Walker, J., Fox, A. J., Edwards-Jones, V., Gordon, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+cell+mass+spectrometry+%28ICMS%29+used+to+type+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%3A+media+effects+and+inter-laboratory+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Meth%22%5BJournal%5D)">Intact cell mass spectrometry (ICMS) used to type methicillin-resistant Staphylococcus aureus: media effects and inter-laboratory reproducibility.</a> J Microbiol Meth. 48 (2-3), 117-126 (2002).</li>
<li>Ruelle, V., El Moualij, B., Zorzi, W., Ledent, P., De Pauw, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+environmental+bacterial+strains+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of environmental bacterial strains by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Sp. 18 (18), 2013-2019 (2004).</li>
<li>Sedo, O., Sedlacek, I., Zdrahal, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Preparation+Methods+for+Maldi-MS+Profiling+of+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Sample Preparation Methods for Maldi-MS Profiling of Bacteria.</a> Mass Spectrom Rev. 30 (3), 417-434 (2011).</li>
<li>Swatkoski, S., Russell, S., Edwards, N., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+a+model+virus+using+residue-specific+chemical+cleavage+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of a model virus using residue-specific chemical cleavage and MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Anal Chem. 79 (2), 654-658 (2007).</li>
<li>Freiwald, A., Sauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+classification+and+identification+of+bacteria+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 4 (5), 732-742 (2009).</li>
<li>Drevinek, M., Dresler, J., Klimentova, J., Pisa, L., Hubalek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+MALDI-TOF+MS+identification+of+highly+dangerous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS identification of highly dangerous bacteria.</a> Lett Appl Microbiol. 55 (1), 40-46 (2012).</li>
<li>Lasch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+mass+spectrometry+compatible+inactivation+method+for+highly+pathogenic+microbial+cells+and+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF mass spectrometry compatible inactivation method for highly pathogenic microbial cells and spores.</a> Anal Chem. 80 (6), 2026-2034 (2008).</li>
<li>Usbeck, J. C., Kern, C. C., Vogel, R. F., Behr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+experimental+and+modelling+parameters+for+the+differentiation+of+beverage+spoiling+yeasts+by+Matrix-Assisted-Laser-Desorption%2FIonization+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry+%28MALDI-TOF+MS%29+in+response+to+varying+growth+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimization of experimental and modelling parameters for the differentiation of beverage spoiling yeasts by Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) in response to varying growth conditions.</a> Food Microbiol. 36 (2), 379-387 (2013).</li>
<li>Del Chierico, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+MS+proteomic+phenotyping+of+filamentous+and+other+fungi+from+clinical+origin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF MS proteomic phenotyping of filamentous and other fungi from clinical origin.</a> J Proteomics. 75 (11), 3314-3330 (2012).</li>
<li>Vitale, R., Roine, E., Bamford, D. H., Corcelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+fingerprints+of+intact+viruses+by+MALDI-TOF%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bba-Mol+Cell+Biol+L%22%5BJournal%5D)">Lipid fingerprints of intact viruses by MALDI-TOF/mass spectrometry.</a> Bba-Mol Cell Biol L. 1831 (4), 872-879 (2013).</li>
<li>Zhang, L., Borror, C. M., Sandrin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+designed+experiments+approach+to+optimization+of+automated+data+acquisition+during+characterization+of+bacteria+with+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A designed experiments approach to optimization of automated data acquisition during characterization of bacteria with MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Plos One. 9 (3), (2014).</li>
<li>Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+bacteria+from+positive+blood+culture+bottles+by+use+of+matrix-assisted+laser+desorption-ionization+time+of+flight+mass+spectrometry+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22J+ClinMicrobiol%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting.</a> J ClinMicrobiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs Vranckx et Janssens sont des employés d’Applied Maths NV, le fabricant du logiciel d’analyse de données utilisé dans cette vidéo. Applied Maths NV a fourni certains modules logiciels mis en évidence dans cette vidéo ainsi qu’une partie des coûts de publication associés à cette vidéo.

Cette démonstration a montré des procédures détaillées de caractérisation et d&#39;identification des bactéries utilisant MALDI-TOF MS et une base de données personnalisée. En comparaison avec les méthodes moléculaires classiques, par exemple, les méthodes d&#39;empreintes digitales MS-séquençage de l&#39;ADNr 16S, MALDI-TOF de faciliter une identification plus rapide des diverses bactéries. En raison de sa robustesse, cette technique est largement utilisée pour caractériser les bactéries, les virus, les champignons et ...

La spectrométrie de masse (MS) par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF) s’est avérée être un outil rapide et fiable pour l’identification des bactéries au genre, à l’espèce et, dans certains cas, aux niveaux de souche1 à 4. MALDI-TOF MS ionise des molécules biologiques (généralement des protéines) qui proviennent de surfaces cellulaires, de membranes intracellulaires et de ribosomes à partir de cellules entières bactériennes ou d’extraits de protéines1,5. Les pics qui en résultent forment des motifs caractéristiques ou des « empreintes digitales » des bactéries analysées1. L’identification des bactéries repose sur ces « empreintes digitales » de la masse à la charge. 
Deux des stratégies d’identification les plus couramment utilisées sont les stratégies basées sur la bibliothèque et les stratégies basées sur la bio-informatique1. Les approches basées sur des bibliothèques consistent à comparer les spectres de masse d’inconnues aux spectres de masse de bactéries connues précédemment collectés dans des bases de données/bibliothèques à des fins d’identification. Des logiciels disponibles dans le commerce, tels que les progiciels BioNumerics, Biotyper et SARAMIS, ainsi que des outils logiciels open source, tels que SpectraBank6, sont disponibles pour faciliter la comparaison et la quantification de la similitude entre les spectres de masse des inconnues et les bactéries de référence. Les approches bioinformatiques reposent généralement sur des génomes de bactéries entièrement séquencés pour l’identification. Contrairement aux approches basées sur des banques qui n’impliquent pas l’identification de la nature biologique de pics particuliers, les approches basées sur la bio-informatique impliquent l’identification de protéines1. 
La majorité des études récentes basées sur les empreintes digitales MALDI ont utilisé des approches basées sur des banques pour identifier les bactéries1. Les approches basées sur des bibliothèques nécessitent la construction de bases de données et la comparaison de la similitude entre les spectres de masse. Des études montrent que de nombreuses procédures expérimentales, telles que le milieu3,7, le temps de culture8, la méthode de préparation d’échantillon3 et la matrice utilisée9, affectent les spectres de masse obtenus. De plus, certaines espèces et souches étroitement apparentées génèrent des spectres avec seulement des différences subtiles. Ainsi, les approches basées sur des bibliothèques nécessitent des procédures rigoureusement normalisées pour générer des spectres de masse hautement reproductibles entre les répétitions. Des variations mineures dans les protocoles peuvent compromettre l’efficacité de l’identification, en particulier aux niveaux1, 3 et 10 de la sous-espèce et de la souche. Cependant, ni les bases de données de référence fournies par le fabricant ni les bases de données personnalisées signalées n’incluent de procédures documentées visuellement pour la construction et/ou l’application d’un pipeline d’analyse de données. Pour cette raison, l’objectif de ce travail était de développer, d’appliquer et de démontrer une procédure complète et détaillée pour l’identification bactérienne basée sur une bibliothèque à l’aide de MALDI-TOF MS. 
Dans cette démonstration, les spectres de masse de 15 bactéries isolées d’un environnement karstique (Kartchner Cavern, AZ, USA) ont été collectés et importés dans un logiciel pour construire une base de données de modèles. Le traitement des données et le pipeline d’analyse ont été détaillés à l’aide de la base de données du modèle. Enfin, des spectres de masse de bactéries codées à l’aveugle qui ont été sélectionnées au hasard parmi ces 15 bactéries ont été collectés à nouveau et comparés aux spectres de référence dans la base de données du modèle à des fins d’identification. Les résultats montrent que les bactéries peuvent être correctement identifiées, soit sur la base de coefficients de similarité, soit sur la base de biomarqueurs/classes de pics potentiels.

<table><tbody><tr><td>Acide &alpha ;-cyano-4-hydroxy-cinnamique</td><td>ACROS Organics</td><td>163440050</td><td>&ge ; 97 %, CAS 28168-41-8</td></tr><tr><td>Logiciel Bruker FlexControl</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>version 3.0</td></tr><tr><td>Logiciel Bruker FlexAnalysis</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>version 3.0</td></tr><tr><td>Logiciel de bionumérique Applied</td><td>Maths</td><td></td><td>version 7.1</td></tr></tbody></table>

l&#39;utilisation de maldi-tof spectrométrie de masse et une base de données personnalisée pour caractériser les bactéries indigènes à un environnement unique cave (kartchner, az, usa)

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment (Kartchner Caverns, AZ, USA)

La spectrométrie de masse MALDI-TOF s’est avérée être un outil rapide et fiable pour l’identification des bactéries au niveau du genre et de l’espèce, et dans certains cas, des niveaux de souche. Des outils logiciels disponibles dans le commerce et open source ont été mis au point pour faciliter l’identification ; Cependant, aucun pipeline d’analyse de données universel/standardisé n’a été décrit dans la littérature. Nous proposons ici une démonstration complète et détaillée des procédures d’identification bactérienne à l’aide d’un spectromètre de masse MALDI-TOF. Des spectres de masse ont été collectés à partir de 15 bactéries diverses isolées dans les cavernes de Kartchner, en Arizona, aux États-Unis, et identifiées par séquençage de l’ADNr 16S. Les bases de données ont été construites dans BioNumerics 7.1. Des analyses de suivi des spectres de masse ont été effectuées, y compris des analyses en grappes, l’appariement des pics et des analyses statistiques. L’identification a été effectuée à l’aide d’échantillons codés à l’aveugle et choisis au hasard parmi ces 15 bactéries. Deux méthodes d’identification sont présentées : les méthodes basées sur les coefficients de similarité et les méthodes basées sur les biomarqueurs. Les résultats montrent que les deux méthodes d’identification permettent d’identifier la bactérie au niveau de l’espèce.

Les bases de données construites à cette manifestation avaient quatre niveaux, du plus haut au plus bas niveau, y compris "tous les niveaux", "répétition biologique" "Species" et "répétition technique", respectivement (figure 1A). La "répétition technique" niveau contenait tous les spectres prétraitée de répétitions techniques. La "répétition biologique" et les niveaux «espèce» contenaient le composite (résumé) spectres. "Tous les niveaux" contenaient tous les spectres répliqué technique ainsi que tous ...

Ce travail détaille les procédures d’identification rapide des bactéries à l’aide de MALDI-TOF MS. Les procédures d’identification comprennent l’acquisition du spectre, la construction de bases de données et les analyses de suivi. Deux méthodes d’identification, basées sur les coefficients de similarité et les méthodes basées sur les biomarqueurs, sont présentées.

L&#39;utilisation de MALDI-TOF spectrométrie de masse et une base de données personnalisée pour caractériser les bactéries indigènes à un environnement unique Cave (Kartchner, AZ, USA)

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, ...

L’objectif global de cette procédure est de développer, d’appliquer et de démontrer une procédure détaillée pour l’identification bactérienne basée sur une banque à l’aide de MALDI à la spectrométrie de masse. Pour ce faire, il faut d’abord acquérir des spectres de masse de bactéries à l’aide d’un spectromètre de masse Maloff. Dans cette étude, les spectres de masse de 15 bactéries isolées d’un environnement caustique sont collectés, la forme des pics résultants, les motifs caractéristiques ou les empreintes digitales des bactéries analysées.Ces spectres de masse sont ensuite importés dans le logiciel et une base de données de modèles est construite. Ensuite, les spectres de masse de référence dans la base de données de modèles sont traités et analysés à l’aide de l’analyse de clusters, de l’appariement des pics et de l’analyse statistique. Enfin, les spectres de masse des bactéries codées à l’aveugle, qui sont sélectionnées au hasard parmi ces 15 bactéries, sont à nouveau collectés et, comparés aux spectres de référence dans la base de données du modèle pour les résultats d’identification, montrent que les bactéries peuvent être correctement identifiées, soit sur la base de coefficients de similarité, soit sur la base de biomarqueurs potentiels et de classes de pics.Commencez cette procédure par le dépôt d’un microlitre d’extrait de protéine ne contenant aucune cellule viable sur une plaque cible en acier inoxydable et laissez-la sécher. Reposez ensuite l’extrait de protéine séché avec un microlitre de solution matricielle et laissez-le sécher. Déposez ensuite un microlitre d’étalon CBR sur la plaque cible après séchage, recouvrez le CBR d’un microlitre de solution matricielle et laissez-le sécher.Enfin, déposez deux microlitres de solution matricielle sur la plaque cible comme témoin négatif. Utilisez le spectromètre multi à masse équipé du laser à azote et fonctionnant à l’aide du logiciel de contrôle flexible Bruker. Collectez chaque spectre de masse en mode linéaire positif en accumulant 500 tirs laser par incréments de 100 tirs.Réglez la source d’ions une tension sur 20, les kilovolts sur la source d’ions, deux tensions sur 18,15 kilovolts et la tension de la lentille sur 9,05 kilovolts. Ces paramètres sont spécifiques à l’instrument et peuvent nécessiter une optimisation. Réglez la plage de masse à charge pour l’évaluation automatique du spectre de deux à 20 kilodaltons par charge.Réglez ensuite le seuil de résolution minimum sur 100. Sélectionnez l’algorithme de détection des pics d’OID. Réglez le seuil de rapport signal/bruit sur deux et le seuil d’intensité minimale sur 100.Enfin, définissez l’accumulation maximale à 500 pour la conception de la base de données. Créez une nouvelle base de données dans bio numerics 7.1 à l’aide de l’assistant de création de base de données. Créez ensuite un type d’expérience de spectre tel que maldi, à l’aide des commandes du panneau des types d’expérience.Ensuite, créez les niveaux à l’aide du panneau de conception de base de données, accédez au menu de la base de données et ajoutez de nouveaux niveaux à l’aide de la commande d’ajout de niveau ici. Créer au niveau de l’espèce, au niveau de la réplication biologique et au niveau technique. Pour importer les spectres de masse bruts.Tout d’abord, exportez les spectres de masse bruts sous forme de fichiers texte à l’aide de l’analyse flexible en naviguant dans le menu Fichier et en cliquant sur la commande Exporter le spectre de masse. Importez ensuite les spectres de masse bruts dans la base de données au niveau des réplicats techniques. Prétraitez les spectres de masse brute en les important et en les rééchantillonnant à l’aide d’un algorithme d’ajustement quadratique.Ensuite, effectuez une soustraction de ligne de base à l’aide d’un disque roulant d’une taille de 50 points, calculez le bruit à l’aide de la transformation en ondelettes continues ou CWT. Lissez les spectres à l’aide d’une fenêtre de Kaiser avec une taille de fenêtre de 20 points et une bêta de 10 points. Effectuez ensuite une deuxième soustraction de la ligne de base à l’aide d’un disque roulant d’une taille de 200 points.Enfin, détectez les pics à l’aide du CWT avec un rapport signal/bruit minimum de 10 après prétraitement des modèles caractéristiques de sécurité de chaque spectre de masse, tels que des listes de pics, contenant des tailles de pics, des intensités de pics et un rapport signal/bruit. Dans l’étape suivante, créez des spectres de masse composites à partir de spectres prétraités à l’aide de la commande résumée dans le menu d’analyse. Choisissez la réplication biologique comme niveau cible. Ici.Combinez les spectres de masse de 10 répétitions techniques de la même colonie pour obtenir un spectre de masse composite pour cette colonie, ce qui donne trois spectres de masse composites pour cet isolat au niveau de la répétition biologique. Enfin, résumez les trois spectres composites pour créer un spectre composite pour cet isolat au niveau de l’espèce. Pour effectuer une analyse de cluster basée sur la similarité et une mise à l’échelle multidimensionnelle, créez des groupes avec des couleurs.Tout d’abord, sélectionnez les trois spectres de masse composites biologiques et cliquez sur la commande Créer un nouveau groupe à partir de la sélection dans le menu du groupe pour créer un groupe pour l’isolat correspondant. Ensuite, concevez une couleur utilisée automatiquement pour ces trois spectres de masse. Effectuez une analyse de cluster en naviguant dans le menu de clustering et en cliquant sur la commande calculer l’analyse de cluster.Dans les paramètres de comparaison, à la première page, sélectionnez la corrélation de Pearson et laissez les autres paramètres par défaut. À la page deux, sélectionnez la méthode de groupe de paires non pondérées avec une moyenne arithmétique. Cliquez ensuite sur Terminer.Obtenez un graphique de mise à l’échelle multidimensionnelle à l’aide de la commande de mise à l’échelle multidimensionnelle dans le menu des statistiques pour effectuer l’appariement des pics. Cliquez sur le type de spectre maldi dans le panneau des expériences. Sélectionnez ensuite la mise en page.Afficher l’image, les pics individuels des spectres sont affichés. Effectuez ensuite l’appariement des pics à l’aide de la commande do peak matching dans le menu des spectres pour identifier les classes de pics, effectuez un clustering bidirectionnel en cliquant sur la matrice de statistiques. Minier. L’intensité des pics appariés aux classes de pics est représentée sous forme de carte thermique pour identifier les bactéries à l’aide de la méthode basée sur le coefficient de similarité, créer une comparaison et générer un rogramme basé sur des spectres de masse au niveau de la réplication technique comme effectué pour l’analyse en grappes, enregistrer le rogramme pour la comparaison de similarité.Sélectionnez un spectre de masse inconnu et cliquez sur l’analyse. Identifiez les entrées sélectionnées. La boîte de dialogue d’identification s’affiche.Sélectionnez le type de classifieur basé sur la comparaison, puis cliquez sur Suivant. Sur la page suivante, choisissez le gramme enregistré comme comparaison de référence, puis cliquez sur Suivant. Choisissez la similarité de base comme méthode d’identification, puis cliquez à nouveau sur Suivant, choisissez la similarité maximale comme méthode de notation.Saisissez les valeurs de seuil et les valeurs de différence minimale appropriées pour chaque paramètre, puis cliquez sur Suivant. Une fois les calculs terminés, la fenêtre d’identification apparaît dans le panneau des résultats. Les membres de la base de données qui correspondent le mieux à l’inconnu sont répertoriés.Un rogramme basé sur l’analyse de clustering montre une similitude entre chaque isolat de la base de données. L’ensemble de données contient des spectres de 15 espèces différentes avec trois spectres composites pour chaque espèce. L’analyse de grappes bidirectionnelle peut aider les chercheurs à identifier des biomarqueurs potentiels pour une espèce ou des souches au sein d’une espèce.Ici, l’intensité maximale est représentée par des couleurs, le vert signifiant une faible intensité et le rouge signifiant une intensité élevée. Enfin, sur la base de ces analyses, le spectre de masse d’un inconnu peut être comparé au gramme et une identification basée sur le coefficient de similarité est obtenue.

use-maldi-tof-mass-spectrometry-custom-database-to-characterize

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

L'application de laser désorption / ionisation de temps assistée par matrice de vol (MALDI-TOF), la spectrométrie de masse (MS) directement à un bouillon de culture de sang accélère l'identification de bactéries. La méthode présentée est une méthode rapide et fiable pour l'identification des bactéries à Gram négatif directement à partir de bouillon de culture de sang.

Identification rapide des bactéries à Gram négatif de sang Bouillon de culture à l&#39;aide MALDI-TOF spectrométrie de masse

La spectrométrie de masse à temps de vol laser assistée par matrice (MALDI-TOF MS) et les techniques moléculaires (séquençage du gène de l’ARNr 16S) permettent d’identifier des pathogènes bactériens rares dans les diagnostics de routine. L’objectif de ce protocole réside dans la combinaison des deux techniques qui permet d’obtenir des données plus précises et plus fiables.

Identification des bactéries pathogènes rares par 16S ARNr Gene Séquençage et MALDI-TOF MS

IDBac est un pipeline bioinformatique à base de spectrométrie de masse open source qui intègre des données provenant à la fois de protéines intactes et de spectres de métabolites spécialisés, recueillis sur des matériaux cellulaires extraits de colonies bactériennes. Le pipeline permet aux chercheurs d'organiser rapidement des centaines à des milliers de colonies bactériennes en groupes taxonomiques putatifs, et de les différencier davantage en fonction de la production spécialisée de...

Utilisation du pipeline Open-Source MALDI TOF-MS IDBac pour l'analyse des protéines microbiennes et des données spécialisées sur les métabolites

Un protocole d’extraction du génome guidé par spectrométrie de masse est établi et décrit ici. Il est basé sur l’information sur la séquence génomique et l’analyse LC-MS/MS et vise à faciliter l’identification des molécules à partir d’extraits microbiens et végétaux complexes.

L’extraction du génome guidée par spectrométrie de masse comme outil pour découvrir de nouveaux produits naturels

Nous présentons ici un protocole pour l’identification rapide des protéines produites par des bactéries pathogènes séquencées génomiquement en utilisant la spectrométrie de masse en tandem MALDI-TOF-TOF et l’analyse protéomique descendante avec un logiciel développé en interne. Les ions protéiques métastables se fragmentent en raison de l’effet acide aspartique et cette spécificité est exploitée pour l’identification des protéines.

Identification des protéines d’immunité antibactérienne chez Escherichia coli à l’aide de MALDI-TOF-TOF-MS/MS et d’une analyse protéomique descendante

Une nouvelle méthode de préparation d’échantillons est démontrée pour l’analyse de macrocolonies bactériennes à base d’agar par spectrométrie de masse par imagerie par désorption/ionisation laser assistée par matrice.

Étude de la coopération microbienne par imagerie par spectrométrie de masse Analyse de colonies bactériennes cultivées sur gélose et dans les tissus pendant l’infection

Ce protocole permet une évaluation rapide et rentable de la composition microbienne des produits laitiers en combinant la culturomique avec la SM MALDI-TOF. Il fournit des résultats de taxonomie comparables au séquençage de l’ARNr 16S avec un délai d’exécution plus court que les méthodes de culture traditionnelles.

Évaluation de l’innocuité microbienne des laiteries à l’aide du profilage protéomique bactérien via l’approche MALDI

Cette vidéo montre la préparation d'un ultra-mince de matrice / analyte couche pour analyser des peptides et des protéines par Matrix-Assisted Laser Désorption Ionisation Mass Spectrometry (MALDI-MS).

Préparation des échantillons MALDI: la méthode de la couche ultra mince

Expression réduite / absent du PMS2 et / ou ERCC1 dans des cryptes entière est un événement fréquent dans les 10 cm de chaque côté d'adénocarcinomes du côlon, probablement la base d'une anomalie du champ avec la mutabilité élevée et la progression vers le cancer. La carence en Ku86 ou CCOI est beaucoup moins fréquent dans ces anomalies du champ.

PMS2 insuffisantes, ERCC1, Ku86, CCOI des défauts sur le terrain pendant la progression du cancer du colon

Normes des isotopes stables et capture par anticorps anti-peptide (SISCAPA) l'enrichissement affinités couples de peptides avec des isotopes stables de dilution spectrométrie de masse (MRM-MS) pour fournir une mesure quantitative des peptides comme substituts pour leurs protéines respectives. Nous décrivons ici le protocole en utilisant des particules magnétiques dans un format partiellement automatisés.

La quantification des protéines à l&#39;aide d&#39;enrichissement d&#39;immunoaffinité peptide couplé à la spectrométrie de masse

Découvrez l'identification bactérienne par spectrométrie de masse MALDI-TOF MS. Cette méthode utilise l'analyse de clusters et le matching de pics pour caractériser les bactéries indigènes d'une grotte unique.

Lutilisation de MALDI-TOF spectrométrie de masse et une base de données personnalisée pour caractériser les bactéries indigènes à un environnement unique Cave (Kartchner, AZ, USA) (Vidéo) | JoVE Journal

L'utilisation de MALDI-TOF spectrométrie de masse et une base de données personnalisée pour caractériser les bactéries indigènes à un environnement unique Cave (Kartchner, AZ, USA)

Explorer plus de vidéos