L'utilisation de MALDI-TOF spectrométrie de masse et une base de données personnalisée pour caractériser les bactéries indigènes à un environnement unique Cave (Kartchner, AZ, USA)

L’objectif global de cette procédure est de développer, d’appliquer et de démontrer une procédure détaillée pour l’identification bactérienne basée sur une banque à l’aide de MALDI à la spectrométrie de masse. Pour ce faire, il faut d’abord acquérir des spectres de masse de bactéries à l’aide d’un spectromètre de masse Maloff. Dans cette étude, les spectres de masse de 15 bactéries isolées d’un environnement caustique sont collectés, la forme des pics résultants, les motifs caractéristiques ou les empreintes digitales des bactéries analysées.

Ces spectres de masse sont ensuite importés dans le logiciel et une base de données de modèles est construite. Ensuite, les spectres de masse de référence dans la base de données de modèles sont traités et analysés à l’aide de l’analyse de clusters, de l’appariement des pics et de l’analyse statistique. Enfin, les spectres de masse des bactéries codées à l’aveugle, qui sont sélectionnées au hasard parmi ces 15 bactéries, sont à nouveau collectés et, comparés aux spectres de référence dans la base de données du modèle pour les résultats d’identification, montrent que les bactéries peuvent être correctement identifiées, soit sur la base de coefficients de similarité, soit sur la base de biomarqueurs potentiels et de classes de pics.

Commencez cette procédure par le dépôt d’un microlitre d’extrait de protéine ne contenant aucune cellule viable sur une plaque cible en acier inoxydable et laissez-la sécher. Reposez ensuite l’extrait de protéine séché avec un microlitre de solution matricielle et laissez-le sécher. Déposez ensuite un microlitre d’étalon CBR sur la plaque cible après séchage, recouvrez le CBR d’un microlitre de solution matricielle et laissez-le sécher.

Enfin, déposez deux microlitres de solution matricielle sur la plaque cible comme témoin négatif. Utilisez le spectromètre multi à masse équipé du laser à azote et fonctionnant à l’aide du logiciel de contrôle flexible Bruker. Collectez chaque spectre de masse en mode linéaire positif en accumulant 500 tirs laser par incréments de 100 tirs.

Réglez la source d’ions une tension sur 20, les kilovolts sur la source d’ions, deux tensions sur 18,15 kilovolts et la tension de la lentille sur 9,05 kilovolts. Ces paramètres sont spécifiques à l’instrument et peuvent nécessiter une optimisation. Réglez la plage de masse à charge pour l’évaluation automatique du spectre de deux à 20 kilodaltons par charge.

Réglez ensuite le seuil de résolution minimum sur 100. Sélectionnez l’algorithme de détection des pics d’OID. Réglez le seuil de rapport signal/bruit sur deux et le seuil d’intensité minimale sur 100.

Enfin, définissez l’accumulation maximale à 500 pour la conception de la base de données. Créez une nouvelle base de données dans bio numerics 7.1 à l’aide de l’assistant de création de base de données. Créez ensuite un type d’expérience de spectre tel que maldi, à l’aide des commandes du panneau des types d’expérience.

Ensuite, créez les niveaux à l’aide du panneau de conception de base de données, accédez au menu de la base de données et ajoutez de nouveaux niveaux à l’aide de la commande d’ajout de niveau ici. Créer au niveau de l’espèce, au niveau de la réplication biologique et au niveau technique. Pour importer les spectres de masse bruts.

Tout d’abord, exportez les spectres de masse bruts sous forme de fichiers texte à l’aide de l’analyse flexible en naviguant dans le menu Fichier et en cliquant sur la commande Exporter le spectre de masse. Importez ensuite les spectres de masse bruts dans la base de données au niveau des réplicats techniques. Prétraitez les spectres de masse brute en les important et en les rééchantillonnant à l’aide d’un algorithme d’ajustement quadratique.

Ensuite, effectuez une soustraction de ligne de base à l’aide d’un disque roulant d’une taille de 50 points, calculez le bruit à l’aide de la transformation en ondelettes continues ou CWT. Lissez les spectres à l’aide d’une fenêtre de Kaiser avec une taille de fenêtre de 20 points et une bêta de 10 points. Effectuez ensuite une deuxième soustraction de la ligne de base à l’aide d’un disque roulant d’une taille de 200 points.

Enfin, détectez les pics à l’aide du CWT avec un rapport signal/bruit minimum de 10 après prétraitement des modèles caractéristiques de sécurité de chaque spectre de masse, tels que des listes de pics, contenant des tailles de pics, des intensités de pics et un rapport signal/bruit. Dans l’étape suivante, créez des spectres de masse composites à partir de spectres prétraités à l’aide de la commande résumée dans le menu d’analyse. Choisissez la réplication biologique comme niveau cible. Ici.

Combinez les spectres de masse de 10 répétitions techniques de la même colonie pour obtenir un spectre de masse composite pour cette colonie, ce qui donne trois spectres de masse composites pour cet isolat au niveau de la répétition biologique. Enfin, résumez les trois spectres composites pour créer un spectre composite pour cet isolat au niveau de l’espèce. Pour effectuer une analyse de cluster basée sur la similarité et une mise à l’échelle multidimensionnelle, créez des groupes avec des couleurs.

Tout d’abord, sélectionnez les trois spectres de masse composites biologiques et cliquez sur la commande Créer un nouveau groupe à partir de la sélection dans le menu du groupe pour créer un groupe pour l’isolat correspondant. Ensuite, concevez une couleur utilisée automatiquement pour ces trois spectres de masse. Effectuez une analyse de cluster en naviguant dans le menu de clustering et en cliquant sur la commande calculer l’analyse de cluster.

Dans les paramètres de comparaison, à la première page, sélectionnez la corrélation de Pearson et laissez les autres paramètres par défaut. À la page deux, sélectionnez la méthode de groupe de paires non pondérées avec une moyenne arithmétique. Cliquez ensuite sur Terminer.

Obtenez un graphique de mise à l’échelle multidimensionnelle à l’aide de la commande de mise à l’échelle multidimensionnelle dans le menu des statistiques pour effectuer l’appariement des pics. Cliquez sur le type de spectre maldi dans le panneau des expériences. Sélectionnez ensuite la mise en page.

Afficher l’image, les pics individuels des spectres sont affichés. Effectuez ensuite l’appariement des pics à l’aide de la commande do peak matching dans le menu des spectres pour identifier les classes de pics, effectuez un clustering bidirectionnel en cliquant sur la matrice de statistiques. Minier. L’intensité des pics appariés aux classes de pics est représentée sous forme de carte thermique pour identifier les bactéries à l’aide de la méthode basée sur le coefficient de similarité, créer une comparaison et générer un rogramme basé sur des spectres de masse au niveau de la réplication technique comme effectué pour l’analyse en grappes, enregistrer le rogramme pour la comparaison de similarité.

Sélectionnez un spectre de masse inconnu et cliquez sur l’analyse. Identifiez les entrées sélectionnées. La boîte de dialogue d’identification s’affiche.

Sélectionnez le type de classifieur basé sur la comparaison, puis cliquez sur Suivant. Sur la page suivante, choisissez le gramme enregistré comme comparaison de référence, puis cliquez sur Suivant. Choisissez la similarité de base comme méthode d’identification, puis cliquez à nouveau sur Suivant, choisissez la similarité maximale comme méthode de notation.

Saisissez les valeurs de seuil et les valeurs de différence minimale appropriées pour chaque paramètre, puis cliquez sur Suivant. Une fois les calculs terminés, la fenêtre d’identification apparaît dans le panneau des résultats. Les membres de la base de données qui correspondent le mieux à l’inconnu sont répertoriés.

Un rogramme basé sur l’analyse de clustering montre une similitude entre chaque isolat de la base de données. L’ensemble de données contient des spectres de 15 espèces différentes avec trois spectres composites pour chaque espèce. L’analyse de grappes bidirectionnelle peut aider les chercheurs à identifier des biomarqueurs potentiels pour une espèce ou des souches au sein d’une espèce.

Ici, l’intensité maximale est représentée par des couleurs, le vert signifiant une faible intensité et le rouge signifiant une intensité élevée. Enfin, sur la base de ces analyses, le spectre de masse d’un inconnu peut être comparé au gramme et une identification basée sur le coefficient de similarité est obtenue.