Stimulation optogenetic du nerf auditif

L’objectif global de cette procédure est de stimuler optiquement le nerf auditif d’animaux avec des neurones ganglionnaires spiraux modifiés optogénétiquement. Pour ce faire, il suffit de préparer d’abord soit un stimulateur micro LED bleu, soit une fibre optique couplée à un laser bleu. L’étape suivante de la procédure consiste à évaluer la cochlée à l’aide d’une approche microchirurgicale rétro-auriculaire.

La troisième étape consiste à positionner le stimulateur optique pour enregistrer les réponses du tronc cérébral évoquées optiquement. La dernière étape consiste à accéder à la colus inférieure pour enregistrer l’activité évoquée optiquement. En fin de compte, les résultats peuvent montrer une stimulation réussie du système auditif par l’enregistrement des réponses auditives du tronc cérébral et des potentiels de champ locaux.

Dans le colliculus inférieur Stimulation optogénétique du nerf auditeur. En tant qu’alternative à l’électrique, les implants cochléaires promettent une meilleure résolution de fréquence et d’intensité. Ceci est d’un grand intérêt pour la recherche des auditeurs, mais les implications de cette technique s’étendent à une meilleure restauration de l’audition chez les sourds.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la recherche auditive, telles que le rôle de l’activité des motifs dans le raffinement du développement orthopédique, la nécessité d’une intégration spectrale dans la localisation cellulaire et l’étendue de l’interaction entre les projections de trames spécifiques à la fréquence. Dans le système auditif central, la démonstration visuelle de la procédure est essentielle car le positionnement et l’orientation appropriés de la micro LED ou de la fibre optique sont difficiles à apprendre. Le stimulateur micro LED utilise une LED bleue avec une surface active de 200 microns carrés qui soude d’abord les fils à la micro LED.

Ensuite, à l’aide d’une encapsulation époxy, la LED et sa connexion, laissez-la sécher pendant la nuit. Une fois durcis, faites passer les fils à travers un diamètre extérieur d’un millimètre. Emprunt capillaire en verre de silicate.

Le verre assure la stabilité mécanique et l’isolation électrique. Scellez la jonction du capillaire et de la LED recouverte d’époxy avec plus d’époxy, positionnez le capillaire de manière à ce qu’il puisse être monté sur un manipulateur. Vérifiez maintenant les connexions électriques.

Tout d’abord, préparez trois fils de cuivre. Trempez une extrémité de chacun dans un bain de chlorure de sodium à 0,9 %. Connectez ensuite leurs autres extrémités à un amplificateur A BR.

Surveillez le signal à l’aide d’un oscilloscope. Ensuite, connectez la micro LED au stimulateur sur mesure pour le test. Plongez le stimulateur micro LED connecté dans le bain et alimentez la LED pendant au moins 20 minutes.

Tout en stimulant la LED, surveillez l’oscilloscope pour les artefacts. Jetez toutes les LED défectueuses. Anesthésie une souris de quatre à 10 semaines.

Cette souris exprime le canal opsine deux sous la cuisse 1.2 promoteur 10 minutes. Après avoir injecté les anesthésiques, vérifiez le réflexe de sevrage de l’animal pour confirmer un plan chirurgical d’anesthésie. Appliquez ensuite une pommade sur les yeux et commencez la chirurgie.

Tout d’abord, rasez soigneusement la zone rétro-auriculaire pour vous approcher du bullah, la cavité de l’oreille moyenne remplie d’air. Placez la souris sur un coussin chauffant du côté chirurgical à l’aide d’une micro-pince. Disséquez soigneusement les muscles du cou, à savoir le platysma, le sternocléidomastoïdien et les scalènes.

Exposez maintenant la bulle. Il s’agit d’une structure osseuse sphérique avec un anneau à la surface où se trouve la membrane tympanique. À l’aide d’une aiguille à insuline, percez un trou juste en dessous de l’anneau à partir du trou.

Retirez l’os qui recouvre la bulle. Utilisez des Rons fins et des micro-pinces exposant l’auditorium professionnel de la cochlée dans le processus. Ensuite, commencez la cochlée. Stomie.

Rasez d’abord la capsule osseuse sans perturber le labyrinthe membraneux. Ouvrez maintenant une petite fenêtre de 500 à 800 microns sur le deuxième tour cochléaire loin de l’artère staed et de l’ouverture de l’apex. L’apex pourrait rompre la cochlée et fracturer le modis.

Préparez-vous à mesurer les réponses auditives optogénétiques du tronc cérébral ou OABR. Tout d’abord, insérez des électrodes à aiguille aux endroits suivants sous le pavillon, sur le vertex et à l’arrière près des jambes avec les électrodes connectées à un amplificateur. Amplifiez le potentiel de différence entre le sommet et les aiguilles sous-cutanées mastoïdiennes.

Prélever un échantillon à 50 kilohertz et filtrer les réponses entre 1 et 10 000 hertz pour la stimulation transcochléaire. Montez une micro LED ou une fibre, couplée à la micro LED saisie par un manipulateur mécanique. Positionnez-le soigneusement en place.

Visualisez le potentiel de différence sur un oscilloscope. Placez-le près de la configuration d’enregistrement afin qu’il soit facile d’optimiser la position du stimulateur optique. Utilisez la moyenne du signal et stockez les données sur un ordinateur pour une analyse hors ligne.

Optimisez maintenant la position et l’orientation de la micro-LED en utilisant des réponses à des impulsions de courant de trois à 10 millisecondes à un à cinq hertz. Une autre option est la stimulation laser par un laser à ondes continues de 473 nanomètres attaché à une fibre optique de 250 micromètres. Cela nécessite un contrôle analogique rapide de la puissance laser ou un dispositif optique al.

Avec un obturateur rapide, positionnez la fibre à l’aide d’un micro-manipulateur directement sur la stomie de la cochlée et fixez-la avec du ciment dentaire pour une stimulation intra-cochléaire. Insérez la fibre à travers la fenêtre ronde dans le s Scala.Tempe. Optimisez la position et l’orientation de la fibre en suscitant des réponses avec des impulsions de trois à 10 millisecondes de 10 à 30 milliwatts à un à cinq hertz.

Le positionnement du stimulateur est l’étape la plus critique du protocole. Le micro ED ou la fibre optique doit être patiemment déplacé jusqu’à ce que l’OABR soit évident. Une fois que de bonnes réponses optogénétiques et auditives du tronc cérébral sont faites, fixez la fibre avec de la colle cyanoacrylate ou du ciment dentaire.

Pour ce protocole, utilisez un cadre stéréotaxique et préparez une souris en ouvrant le crâne sur le col inférieur. À l’aide d’un microscope, placez une sonde d’enregistrement sur la colus inférieure et insérez-la de manière à ce que le canal le plus haut soit à peine visible à la surface. Maintenant, amplifiez la différence de potentiel entre les canaux individuels du réseau d’enregistrement et la vis de référence et l’os pariétal.

Utilisez une fréquence d’échantillonnage de 32 kilohertz, un filtre passe-bas de 300 hertz et enregistrez les données. Une stomie optimale de la cochlée est essentielle et augmente la probabilité de réussite de l’expérience. Cela signifie que la fenêtre est régulière, petite et qu’il n’y a pas de blessure des structures cochléaires internes.

Par exemple, un saignement indique une lésion du sis STR à l’aide du canal Rodin deux souris transgéniques. Le canal Rodin deux est exprimé dans les neurones du gang spiralé à l’intérieur de la cochlée L’éclairage de la lumière bleue soit par micro LED, soit par laser, suscite de grands BR optogénétiques A, qui diffèrent des BR acoustiques A en amplitude et en forme d’onde optogénétique. Un BR acoustique a des amplitudes plus grandes qu’un BR acoustique optogénétique.

Un BR est donc plus comparable à un BR A. Ils peuvent tous deux recruter plus de neurones du ganglion spiralé ou provoquer une activation plus synchronisée des neurones du ganglion spiral. La propagation de l’activité par la voie auditive a été vérifiée par des enregistrements extracellulaires dans le système auditif central. Par exemple, la stimulation optogénétique de la cochlée a déclenché une activité neuronale dans le mésencéphale auditif.

La stabilité mécanique et l’isolation électrique sûre des stimulateurs à micro-LED, ainsi que l’évitement d’un flux excessif de carbone sont tous des facteurs critiques pour une utilisation réussie de l’optogénétique de la cochlée. Lorsque vous essayez ce pro, il est important de se rappeler d’éviter de se blesser à l’artère secondaire dans Ebola. Une fois masterisés, les enregistrements à partir du colliculus inférieur peuvent être effectués en trois heures environ s’ils sont effectués correctement.

En suivant cette procédure, des méthodes telles que l’enregistrement d’une seule unité dans le colliculus inférieur peuvent être effectuées. La stimulation optogénétique de la voie auditive ouvrira la voie aux recherches en neurosciences auditives pour poser des questions qui ne pouvaient pas être abordées auparavant par une stimulation acoustique ou électrique. Nous espérons également que cette technique se traduira par une rééducation clinique des personnes malentendantes.