Une introduction à la neurobiologie du développement

An Introduction to Developmental Neurobiology

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Neuroscience

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An Introduction to Developmental Neurobiology

1.12: Neuronal Transfection Methods

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09:24 min

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April 30, 2023

Overview

L’étude du neurodéveloppement est un domaine qui explore la façon dont le système nerveux est formé, depuis les étapes embryonnaires précoces jusqu’à l’âge adulte. Bien qu’il soit connu que les cellules pro-génitrices neuronales suivent des étapes prévisibles de prolifération, différenciation, migration et maturation, les mécanismes contrôlant le passage d’une étape à l’autre ne sont pas totalement compris. L’étude du développement n’est pas seulement importante pour comprendre comment sont assemblées ces structures complexes, mais aussi de manière à caractériser et traiter des troubles du développement. Puisque les processus de réparation sont similaires à ceux qui ont lieu au cours du développement, ce domaine d’étude est aussi une source prometteuse de vue sur quand et comment les tissus du système nerveux se régénèrent.

Cette vidéo présente un bref aperçu du domaine de la neurobiologie du développement, incluant quelques expériences clés qui ont permis de faire avancer notre compréhension des mécanismes qui contrôlent la formation du tissu neural précoce et la spécialisation de ces cellules en différents sous-groupes de neurones. La présentation est axée sur les principales questions posées par les biologistes du développement et ensuite démontre quelques-unes des méthodes qu’ils utilisent pour répondre à ces questions. Enfin des applications de ces techniques vous sont présentées afin de vous montrer ce que cela implique d’être un neuroscientifique du développement aujourd’hui. Parmi les expérimentations présentées se trouve la manipulation génétique de cerveaux embryonnaires intacts, la différenciation ciblée de cellules souches dans les cellules du système nerveux, et des techniques de marquage qui permettent la quantification d’évènements spécifiques au cours du développement, comme la formation de nouvelles connexions entre les neurones.

Procedure

La neurobiologie développementale étudie la manière donto quelques cellules embryonnaires précoces peuvent être à l’origine d’un système nerveux complexe et organisé qui contrôle tout l’organisme.

Les scientifiques de ce domaine s’intéressent à la manière dont les cellules se différencient, migrent vers des régions spécifiques, et se connectent pour former un système fonctionnel. Ces processus sont importants pour comprendre la façon dont le système nerveux fonctionne, ainsi que pour traiter de nombreuses maladies neurologiques induites par un développement anormal.

Cette vidéo vous fera parcourir l’histoire de la neurobiologie développementale, soulèvera les questions clés de ce domaine et explorera les méthodes utilisées pour répondre à ces questions. Enfin, nous verrons des exemples d’applications pratiques de la recherche sur le développement neuronal.

Commençons par quelques principales découvertes de l’histoire de la neurobiologie développementale.

Les premières recherches sur le neurodéveloppement datent du 19ème siècle. En 1880 Wilhelm His a mis au point l’étude de l’histogenèse, ou de l’origine embryonnaire des tissus. Il a été l’un des premiers à observer le développement des extensions neuronales comme les axones et les dendrites.

En 1924, les embryologistes Hans Spemann and Hilde Mangold ont étudié la fonction d’un regroupement cellulaire appelé organisateur de Spemann. Ils ont montré que la transplantation d’un organisateur à un autre embryon induit la formation d’un tissu neuronal secondaire.

Ensuite, dans les années 1950, Rita Levi-Montalcini et Stanley Cohen ont observé que la transplantation de parties de tumeurs dans des embryons de poulet en développement induit une croissance rapide des neurones. Ils ont supposé que la tumeur sécrète une substance responsable de cette croissance, et identifièrent cette protéine comme étant le facteur de croissance neuronale ou NGF, qui est essentiel à la survie neuronale.

Dans une autre étude de transplantation, Nicole Le Douarin a remplacé des parties d’embryons de poussin avec celles de cailles. En traçant les cellules de caille pendant le développement, elle a montré qu’un groupe de cellules fortement migratoires, appelé la crête neuronale, génère des nerfs périphériques matures.

Quelques années plus tard, Pasko Rakic a étudié comment les cellules du système nerveux central s’organisent en structures hautement ordonnées lors du développement. Rakic a marqué les cellules en division dans des fœtus avec des nucléotides radioactifs, ce qui a permis de déterminer quand les cellules du cerveau naissent et leur destination finale dans le cerveau mature.

Pendant la fin du 20ème siècle, une nouvelle ère de recherche apparait et s’intéresse aux cellules et signaux moléculaires qui mènent au développement du système nerveux.

Par exemple, au milieu des années 90, Tom Jessell a montré que certains facteurs de transcription, ou protéines du contrôle de l’expression génique, influençaient le développement d’un unique sous-type de neurones dans la moelle épinière de l’embryon de souris. A la suite de ce travail, les chercheurs d’aujourd’hui identifient toujours de nouveaux gènes qui contrôlent le développement neuronal.

Maintenant que vous avez vu quelques notions d’histoire, abordons quelques questions clés de la neurobiologie développementale moderne.

Beaucoup de chercheurs étudient le modelage et la spécialisation des cellules du système nerveux. Par exemple, ils s’intéressent à la programmation génétique qui oriente la différenciation des cellules souches précoces en neurones ou en cellules gliales, qui sont les cellules de support du système nerveux. Ils s’intéressent aussi à la sécrétion de signaux influençant la spécialisation au sein d’un groupe de cellules ou en fonction de leur localisation.

Une autre approche étudie la manière dont les neurones et les cellules gliales en développement sont capables de s’organiser au sein du système nerveux mature. Des chercheurs étudient la dynamique du cytosquelette des cellules migrant de leur point d’origine jusqu’au site ou elles assurent leur fonction. D’autres s’intéressent à l’influence des signaux émis par l’environnement extracellulaire sur le comportement migratoire.

Les scientifiques du neurodéveloppement évaluent également la formation et l’optimisation des cellules au cours du développement. Certaines études sont consacrées au rôle des récepteurs de guidage axonal, qui sont des protéines de surface cellulaire qui détectent les queues externes et guident les axones en développement, ou neurites, vers les cellules cibles. Une autre approche concerne l’étude des connections physiques et chimiques impliquées dans la synaptogénèse, qui est la formation de nouveaux points de transmission de signal, ou synapses, entre les cellules.

Maintenant, voyons quelques méthodes importantes utilisées pour répondre à certaines de ces questions sur le neurodéveloppement.

Pour étudier le contrôle génétique de l’identité cellulaire et la structuration du système nerveux, on peut manipuler l’expression de gènes spécifiques dans l’embryon en développement. L’électroporation in utero est une méthode très utilisée, dans laquelle de l’ADN exogène est apporté au cerveau de rongeurs en développement. En y exposant l’utérus d’une souris enceinte et anesthésiée, de l’ADN peut être injecté dans le cerveau embryonnaire et l’application d’un courant force l’entrée de l’ADN dans les cellules alentours. Suivant l’expérience, le matériel électroporé peut servir soit à induire, soit à inhiber l’expression du gène, ce qui permet aux chercheurs d’étudier l’impact d’une protéine sur le développement du cerveau.

Du tissu explanté du système nerveux central est souvent utilisé pour étudier la migration cellulaire au cours du développement. Cette technique implique la dissection de fragments du cerveau ou de la moelle épinière et leur culture in vitro. L’avantage principal de cette approche est l’accessibilité du tissu qui permet d’observer les mouvements cellulaires par vidéomicroscopie.

De plus, les effets de molécules spécifiques sur la migration peuvent être étudiés facilement à partir d’explants si on ajoute des facteurs de croissance ou des inhibiteurs pharmacologiques au milieu de culture.

Pour étudier les molécules impliquées dans la formation du réseau neuronal, on peut utiliser l’immunohistochimie. Cette technique utilise la spécificité des anticorps à marquer l’emplacement de protéines spécifiques dans les cellules et les tissus. La localisation visuelle des protéines en microscopie par fluorescence, peut aider les chercheurs à émettre des hypothèses, notamment sur la façon dont ces molécules influencent la formation et le fonctionnement de structures comme les synapses.

Maintenant que vous êtes familiarisés avec quelques approches d’étude du développement neuronal, voyons certaines applications de ces études en laboratoire aujourd’hui.

Un objectif principal de l’étude du neurodéveloppement est de comprendre comment l’identité et la morphologie cellulaires sont déterminées. Afin d’étudier le contrôle génétique du développement neuronal, ces chercheurs livrèrent du matériel limitant l’expression génétique au système nerveux de poulet en développement, par électroporation. Les neurones électroporés du tube neural furent aussi marqués par l’injection d’un colorant, de manière à ce que la morphologie de l’axone puisse être comparée entre des cellules contrôles et celles génétiquement altérées.

Pour étudier les connections neuronales, ces chercheurs cultivent des neurones extraits de jeunes rats. Après plusieurs jours de culture, les cellules sont fixées et marquées avec des anticorps spécifiques aux protéines synaptiques, permettant de quantifier la formation de synapses dans différentes conditions expérimentales, comme la surexpression d’un gène, ou la culture dans un milieu de culture modifié.

En utilisant leurs connaissances des processus du neurodéveloppement, les chercheurs actuels peuvent forcer des cellules embryonnaires précoces, comme les cellules souches, à suivre une voie de différenciation spécifique in vitro. Ces chercheurs traitent des cellules souches humaines avec un dérivé de la vitamine A, l’acide rétinoïque, ce qui entraine une diminution de l’expression de facteurs de transcription qui maintiennent l’identité des cellules souches, et favorise l’expression de marqueurs neuronaux. Cette technique fournit aux chercheurs une source précieuse de neurones humains pour étudier les mécanismes à l’origine de maladies neurologiques.

Vous venez de regarder l’introduction à la neurobiologie développementale de JoVE. Cette vidéo a passé en revue les découvertes historiques, les questions clés posées par les neuroscientifiques en développement et certaines des techniques qu’ils utilisent. Merci de nous avoir regardés!

Transcript

Developmental neurobiology explores how a few early embryonic cells can transform into an intricately organized nervous system that controls an entire organism.

Scientists in this field are interested in how cells take on specific identities, migrate to defined regions, and connect to form a functional system. These processes are important for understanding how the nervous system functions as well as the diagnosis and treatment of a broad range of neurological diseases rooted in abnormal development.

This video will take you on a brief tour of the history of developmental neurobiology, outline key questions in the field, and explore prominent methods used to answer those questions. Finally, we’ll have a look at some practical applications of neurodevelopmental research.

Let’s begin with some landmark studies from the history of developmental neurobiology.

Early neurodevelopmental research dates back to the 19th century. In the 1880s, Wilhelm His established the study of histogenesis, or the embryonic origins of tissue. He was one of the first people to watch developing neurons extend processes like axons and dendrites.

In 1924, embryologists Hans Spemann and Hilde Mangold studied the function of a cluster of cells known as the Spemann organizer. They found that the transplantation of the organizer to another embryo induced the formation of secondary neural tissue.

Then in the 1950’s, Rita Levi-Montalcini and Stanley Cohen observed that transplanting pieces of tumors onto developing chicken embryos led to rapid neuron growth. They speculated that the tumor secreted a substance that caused this growth, and soon identified that protein as nerve growth factor, or NGF, which is essential to neuron survival.

In another transplant study, Nicole Le Douarin replaced parts of chick embryos with those from quails. By tracking the quail cells through development, she showed that a highly migratory group of cells, known as the neural crest, gives rise to mature peripheral nerves.

A few years later, Pasko Rakic studied how cells of the central nervous system arrange themselves into highly ordered structures during development. Rakic labeled dividing cells in developing fetuses with radioactive nucleotides, allowing him to determine when brain cells were born and where their final destination was in the mature brain.

During the last decades of the 20th century, a new era of research emerged that focused on the cell and molecular signals guiding nervous system development.

For example, in the mid ‘90s, Tom Jessell showed that certain transcription factors, or proteins that help control gene expression, influenced the development of unique subtypes of neurons in the developing mouse spinal cord. Following on this work, today’s researchers are still identifying new genes that control neural development.

Now that you’ve seen a few historical highlights, let’s go over some key questions in modern developmental neurobiology.

Many researchers study patterning and fate specification of nervous system cells. For example, they are interested in the genetic programming that guides early stem cells to differentiate into either neurons or glia, which are the support cells of the nervous system. They may also investigate secreted signals that influence more specialized identities within a class of cells or in specific locations.

Another major focus is how developing neurons and glia are able to organize themselves and assemble into the mature nervous system. Some researchers study cytoskeletal dynamics of cells migrating from their origin to the site at which they function. Others are interested in how signals from the extracellular environment influence migratory behavior.

Developmental neuroscientists also evaluate how connections between cells are formed and refined over the course of development. Some studies focus on the function of axon guidance receptors, which are cell surface proteins that detect external cues and guide developing axons, or neurites, to their target cells. Another focus is the study of the physical and chemical connections involved in synaptogenesis, which is the formation of new signaling connections, or synapses, between cells.

Now, let’s look at a few prominent methods used to answer some of these neurodevelopmental questions.

To study the genetic control of cell identity and nervous system patterning, it is helpful to manipulate the expression of specific genes in developing embryos. One popular method is in utero electroporation, in which exogenous DNA is delivered into the brain of developing rodents. By exposing the uterus of an anesthetized, pregnant mouse DNA can be injected into the embryonic brains and current applied to force the DNA into surrounding cells. Depending on the experiment, electroporated material can be used to either promote gene expression or prevent it, allowing researchers to examine the impact of individual proteins on brain development.

Explanted central nervous system tissue is commonly used to study cell migration during development. This technique involves dissecting small pieces of brain or spinal cord and culturing them in vitro. A major advantage to this approach is that the tissue is highly accessible for capturing cell movements via time-lapse imaging. Additionally, the effects of specific molecules on migration can easily be studied in explants through application of growth factors or pharmacological inhibitors to the culture media.

To study the molecules that are essential to the formation of neuronal networks, immunohistochemistry can be used. This technique takes advantage of the specificity of antibodies to mark the location of specific proteins in cells and tissues. Visualization of protein localization using fluorescent microscopy can help researchers make hypotheses regarding how these molecules influence the formation and function of structures like the synapse.

Now that you’re familiar with some approaches to studying developmental neuroscience let’s look at applications of this research in labs today.

A major goal of the study of neurodevelopment is to figure out how cell identity and morphology are determined. To study the genetic control of neuron development, these researchers delivered gene knockdown constructs into the developing chick nervous system via electroporation. Electroporated neurons within the neural tube were also labeled by dye injection, so that axon morphology could be compared between control and genetically altered cells.

To study how neurons establish connections, these researchers cultured neurons extracted from young rat pups. After several days in culture, cells were fixed and stained with antibodies specific to synaptic proteins, allowing for quantification of synapse formation under multiple experimental conditions, such as gene overexpression, or culture in modified growth medium.

Using their knowledge of the program driving neural development, today’s researchers can now force early embryonic cells, like stem cells, down specific differentiation pathways in vitro. These researchers treated human stem cells with the vitamin A derivative, retinoic acid, which resulted in reduced expression of transcription factors that maintain stem cell identity and enhanced expression of neuronal markers. This technique provides researchers with a valuable source of human neurons for investigating the mechanisms behind neurological disease.

You’ve just watched JoVE’s introduction to developmental neuroscience. This video reviewed historical highlights, key questions asked by developmental neuroscientists and some of the techniques they use.

Thanks for watching!

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