L'échantillonnage du sol et isolement de nématodes entomopathogènes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

L’objectif de cette procédure est de démontrer les méthodes et techniques couramment utilisées pour l’échantillonnage du sol et l’isolement des nématodes entéropathogènes. Pour ce faire, on recueille d’abord des échantillons de sol par transect ou, comme il est démontré, par échantillonnage aléatoire. Ensuite, les échantillons de sol ont été abattus par des insectes pour récupérer sélectivement les nématodes entéropathogènes.

La dernière étape consiste à recueillir les nématodes des insectes infectés à l’aide d’un piège blanc modifié. En fin de compte, ces techniques représentent des étapes clés pour l’établissement réussi de cultures de nématodes entéropathogènes en laboratoire et constituent la base des essais biologiques en aval. L’avantage de la technique d’échantillonnage du sol est que nous pouvons aller sur le terrain et collecter des nématodes pathogènes aux stades matures.

Je préfère prélever des échantillons d’insectes infectés par ces nématodes, que l’on rencontre rarement. La stratégie d’échantillonnage aléatoire que nous employons est couramment utilisée pour évaluer la diversité des nématodes pathogènes d’une grande région géographique ou d’une grande zone. Cette technique a été décrite pour la première fois par betting in Accur en 1975.

Il s’agit d’une procédure sélective basée sur le principe que les stades de vie libre seront attirés par les insectes hôtes et les parasiteront. Rue Orozco, étudiant diplômé, et Ming Mingle, technicien de recherche dans mon laboratoire. Laboratoire. Le site de collecte d’échantillons doit avoir une superficie minimale de deux mètres carrés et, si possible, être supérieure à quatre mètres carrés.

Pour chaque échantillon de sol, prélever au moins trois sous-échantillons plus petits dans la zone d’échantillonnage DM a C. Les sous-échantillons peuvent être combinés s’ils répondent aux objectifs de l’étude. Prélevez les échantillons de sol à une profondeur de zéro à 15 centimètres.

Chaque échantillon doit peser de 250 grammes à un kilogramme. À l’aide de coras de sol, de pelles à main ou d’outils semblables, et prélevez des échantillons à au moins cinq sites au hasard dans chaque zone d’échantillonnage choisie. Chaque échantillon doit être emballé dans un double sac et étiqueté avec un marqueur imperméable.

L’étiquette doit contenir des renseignements sur le site, l’emplacement, l’altitude, la date et des variables environnementales telles que la description de l’habitat avec la végétation associée et la température sur le site. Notez les insectes locaux et autres espèces d’invertébrés. Prélevez les espèces qui ne peuvent pas être identifiées immédiatement pour une identification ultérieure en laboratoire entre les sites de collecte, lavez soigneusement les outils de collecte avec de l’eau, puis désinfectez-les avec de l’éthanol à 70 % ou de l’eau de Javel à 0,5 %.

Conservez les échantillons de sol dans une glacière à une température de huit à 15 degrés Celsius pour le transport. Le CES sépare une partie de l’échantillon pour analyser les caractéristiques brutes du sol telles que sa composition, sa texture, sa conductivité, etc. De chaque échantillon de sol, retirez les débris qui pourraient entraîner une contamination par les microbes sismiques.

Ensuite, humidifiez le sol avec de l’eau pour que les nématodes qui s’y trouvent puissent facilement se déplacer. Chargez 200 à 250 grammes de sol humide dans un récipient en plastique avec un couvercle. Ajoutez ensuite des appâts à insectes.

Cinq à 10 insectes suffiront. Fixez le couvercle, retournez le récipient et mettez-le dans l’obscurité. À température ambiante tous les deux à trois jours, retirez les insectes morts et, au besoin, remplacez-les par des insectes sains pour un poids supplémentaire.

Si le cadavre de l’insecte est brun ou ocre, cela suggère que Stein et Nema parasitent le parit. Alors que si le cadavre est rouge brique à violet foncé, anticipez hétéro. Utilisez un piège blanc modifié pour recueillir les nématodes qui ont parasité les appâts à insectes.

Tout d’abord, placez le couvercle d’une boîte de Pétri de 50 ou 60 millimètres dans la base d’une boîte de 100 millimètres. Placez ensuite une feuille de watman circulaire. Numéro un papier filtre dans le plus petit plat.

Rincez les cadavres d’insectes avec de l’eau stérilisée et transférez-les sur le papier filtre. Étalez-vous de manière à ce qu’ils ne soient pas en contact les uns avec les autres. Remplissez uniquement le plus grand plat avec environ 20 millilitres d’eau distillée et couvrez l’ensemble avec les plus grands plats. Couvercle.

Étiquetez les plats avec le nom du nématode, la date d’appâtage des insectes et la date. Le piège est mis en place. Gardez les pièges à température ambiante et surveillez les nématodes juvéniles infectieux ou les IJ qui émergent des cadavres d’insectes.

Cela peut prendre de 10 à 25 jours et dépend de la température et du niveau d’humidité de l’endroit où le piège est conservé. Si le niveau d’eau dans le siphon s’est évaporé, assurez-vous de le remplir sur des plaques avec des IJ. Récoltez l’eau du plus grand bol, qui doit contenir des nématodes.

Laissez les nématodes couler pendant quelques minutes, puis décantez lentement l’eau. Une fois que les nématodes restent dans un petit volume d’eau, rincez-les encore quelques fois en ajoutant de l’eau, puis en la versant soigneusement. Effectuez ensuite des dilutions en série pour estimer la population de nématodes.

Dans une fiole de culture de 250 millilitres, ajustez la concentration du nématode entre un et 3000 nématodes par millilitre. Stockez cette suspension entre 10 et 20 degrés Celsius. Généralement dans la nature, les chances de trouver des insectes parasités par des nématodes entéropathogènes sont très faibles.

Ainsi, le protocole décrit utilisant des larves de mélanome G comme appât a été utilisé pour isoler ces nématodes à un rythme beaucoup plus efficace. Après cinq jours, les insectes étaient infectés et avaient une coloration rouge. Des pièges blancs modifiés ont montré des traînées de nématodes.

Après 15 jours de ces pièges, les nématodes collectés dans l’eau avaient une apparence propre et étaient exempts de tissus d’insectes. Un seul cycle d’extraction à l’aide de larves de gallium Melania peut être insuffisant pour récupérer tous les nématodes pathogènes d’Oma présents dans un échantillon de sol. Nous vous recommandons donc de le faire plusieurs fois.

De plus, nous conseillons aux utilisateurs de considérer d’autres insectes plutôt que Galleria, ce qui augmentera également les chances de guérison. Le débat d’échantillons de sol avec des insectes est une technique qui peut également être envisagée pour isoler d’autres insectes pathogènes tels que les bactéries ou les champignons.