Identifier les sites d'interaction protéine-protéine à l'aide de peptides tableaux

L’objectif global de cette procédure est de cartographier l’interaction entre deux protéines ou domaines protéiques. Dans ce cas, les domaines protéiques liés au cancer et CHFR sont encore étudiés. L’objectif global de cette procédure est de cartographier l’interaction entre deux protéines ou domaines protéiques.

Dans ce cas, les domaines protéiques liés au cancer et CHFR sont encore étudiés. La deuxième étape consiste à incuber le réseau de peptides CHFR avec son partenaire de liaison, la protéine immobile. Ensuite, la matrice est lavée et incubée avec de la peroxydase de raifort, un anticorps conjugué.

Le réseau est ensuite soumis à une détection de luminescence chimique pour détecter la liaison. La dernière étape consiste à analyser les résultats et à identifier les sites de liaison entre les protéines. Cette étude ouvre la voie à la conception d’inhibiteurs rationnels de la liaison encore CHFR, dont l’interaction incontrôlée peut conduire au développement d’un cancer.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la recherche sur l’interaction des protéines, telles que quelles sont les régions spécifiques qui méditent Une interaction entre deux protéines, Divisez la séquence de la protéine cible en 10 à 20 peptides résiduels. Cela se chevauche partiellement. La quantité de chevauchement peut varier, mais en principe, plus le chevauchement est long, mieux c’est.

Lors de la conception des peptides, prenez en compte les éléments de structure secondaires connus de la protéine qui peuvent être responsables de l’interaction. Le réseau de peptides conçu peut être commandé auprès de fournisseurs commerciaux. Pour cette expérience, les peptides des résidus du domaine CHFR 4 24 à 6 62 sont liés de manière covalente à la matrice par l’extrémité C-terminale.

Après avoir reçu le tableau conçu, préparez-le pour l’expérience en le bloquant d’abord pour empêcher une liaison non spécifique. Préparez une solution bloquante de 2,5 % en poids par volume. Lait écrémé en poudre dans une solution tampon tris contenant 0,05 % de Tween 20 ou TBST pour éviter une liaison non spécifique.

Immergez le réseau dans cinq millilitres de solution de blocage. Incuber le réseau pendant deux à quatre heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius sur un agitateur. Lavez d’abord le réseau avec cinq millilitres de solution bloquante pendant 30 secondes.

Ensuite, lavez le réseau deux fois avec cinq millilitres de TBST pendant cinq minutes sur un agitateur à température ambiante. Ensuite, incubez le réseau lavé avec cinq millilitres de solution protéique marquée polyhistidine contenant 2,5 % de poids par volume. Lait écrémé en poudre pour éviter les liaisons non spécifiques.

Ici, une solution de 4,5 micromolaires de résidus de protéines encore 500 à six 50 est utilisée. Ensuite, incubez le réseau dans la solution protéique pendant trois à huit heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après l’incubation dans la solution protéique.

Lavez le réseau avec cinq millilitres de TBST pendant 30 secondes sur un agitateur à température ambiante, suivi de deux lavages supplémentaires de cinq minutes. Maintenant, incubez la matrice lavée avec cinq millilitres d’anticorps conjugué à la peroxydase de raifort diluée dans un tampon d’incubation contenant les mêmes ingrédients aux mêmes concentrations que la solution bloquante pendant une heure sur un agitateur à température ambiante, l’anticorps peut se lier soit à la protéine cible, soit à l’étiquette, effectuez des expériences de contrôle, testez l’interaction de l’anticorps avec les peptides sur la puce en répétant le même protocole sur une matrice distincte glisser sans incuber avec la protéine avant de lire les matrices. Lavez-les comme précédemment avec cinq millilitres de TBST.

Réalisez le développement de la chimiluminescence avec un kit de substrat de western blot de chimiluminescence amélioré. Effectuez la détection à l’aide d’un analyseur d’images luminescentes tel qu’un appareil photo Fuji film LAS 3000. Analysez les résultats en vous assurant que les deux doublons du réseau affichent les mêmes signaux afin que les résultats soient fiables.

Si la structure du partenaire protéique est connue, recherchez la structure des peptides de liaison et recherchez les sites de liaison. Gardez à l’esprit que les peptides qui sont loin dans la séquence peuvent être ensemble dans la structure tertiaire et créer un site de liaison. Dans notre exemple, il s’agit toujours d’une protéine centrale très importante qui contrôle la division cellulaire normale et la prolifération cellulaire interagit toujours avec plusieurs protéines à travers sa région intrinsèquement désordonnée.

À l’aide du réseau de peptides conçu, les sites de liaison encore présents dans le suppresseur de tumeur CHFR ont été révélés. Chaque point noir dans le tableau représente un peptide dérivé A-C-H-F-R qui ne peut que noter que chaque peptide apparaît deux fois puisqu’il existe en double, ce qui vérifie la fiabilité des résultats. Le criblage des réseaux de peptides a révélé sept peptides dérivés du CHFR qui se liaient à la région encore intrinsèquement désordonnée des résidus 500 à six 50.

Ces résultats nous ont permis de cartographier le site de liaison de l’alambic sur CHFR. Malgré la distance de ces sept peptides sur la séquence primaire du CHFR. Ils créent un site de liaison bien défini pour l’alambic dans la structure tertiaire du CHFR.

Cette méthode est applicable pour caractériser chaque interaction protéique Suite à cette procédure. Des méthodes quantitatives telles que la fluorescence et l’isotope ou l’ITC doivent être utilisées afin de vérifier, dans la quantification, l’introduction de peptides.