Live-imagerie de la Drosophila Nymphe yeux

L’objectif global de cette procédure est de démontrer une méthode efficace pour générer des films d’imagerie en direct du développement de l’œil pupille de la drosophile. Ceci est accompli en retirant d’abord la permanente O de la pupille et en déchirant le côté pour exposer le neuro-épithélium d’un œil. La deuxième étape consiste à assembler un appareil d’imagerie et à monter la chrysalide sur une petite perle de vaseline.

Ensuite, des coupes en série de l’épithélium neurologique dans la région de la ceinture d’adhésion sont acquises à l’aide d’un microscope à fluorescence standard. La dernière étape consiste à stabiliser les séquences et à effectuer des ajustements de couleur dans un logiciel de retouche d’image standard. En fin de compte, l’imagerie cellulaire vivante de l’épithélium neurologique de la drosophile est utilisée pour élucider les comportements cellulaires qui se profilent.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car il peut être difficile de disséquer partiellement une nymphe et de la monter correctement dans le banc d’imagerie, car les pupi sont plutôt fragiles à ce stade. De plus, l’orientation correcte de la chrysalide et le placement correct de la lamelle au-dessus de l’épithélium de l’œil sont essentiels pour une imagerie réussie. Mark Hellerman, de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Pour commencer l’expérience, sélectionnez du pré-puy blanc à partir de génotypes précédemment croisés et placez-les dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre. Ensuite, placez un morceau de tissu de 10 centimètres carrés trempé dans de l’eau distillée dans une boîte en plastique propre. Insérez les microtubes de centrifugation dans la boîte à pointes.

Le tissu humide empêchera la dessiccation de la pupie, puis incubera à 25 degrés Celsius pendant 17 à 25 heures. Après l’incubation, placez un morceau de ruban adhésif double face frais sur un plat de dissection de cigare noir. Positionnez la partie dorsale de la nymphe vers le haut sur le ruban et assurez-vous que la tête de la chrysalide est attachée au ruban adhésif double face sans adhérer aux régions thoracique et abdominale de la nymphe.

À l’aide d’une pince, soulevez et retirez délicatement la permanente A pour exposer la tête de la pupille. Ensuite, déchirez le côté de la pupille. Pour exposer la zone autour d’un œil, retirez délicatement la pupille du ruban adhésif.

Construisez le petit cadre de 15 millimètres carrés à partir de papier buvard et percez un trou de cinq millimètres au milieu. Plongez le cadre et l’eau distillée et placez-le au centre d’un microscope. Glisser avec une seringue de 30 cc.

Pressez un anneau uniforme de vaseline pour entourer le cadre en papier buvard. Ensuite, ajoutez une petite perle de vaseline directement sur la lame. Disposez soigneusement la chrysalide sur le côté et soutenez-la avec la perle de vaseline.

Placez une lamelle sur l’anneau de vaseline de manière à ce qu’il entre en contact avec l’épithélium au-dessus de l’œil. Comprimez doucement la préparation pour sceller la lamelle contre la vaseline et générer une petite surface de contact plane entre la région de la pupille et l’image de la lamelle, la préparation de la pupille. À l’aide d’un microscope fluorescent, capturer des coupes en série à travers le domaine AAL de l’œil, le neuroépithélium dans la région de la jonction d’adhérence toutes les sept minutes.

Utilisez un logiciel de déconvolution approprié pour réduire l’arrière-plan et améliorer le contraste des images de la section série pour chaque fichier Zack et le logiciel L-A-S-A-F. Accédez au panneau d’outils. Sélectionnez Déconvolution 3D et cliquez sur Appliquer.

Générez une projection maximale ou une image MP pour chaque fichier de pile alambiqué. Alignez chaque image MP pour mettre en évidence les comportements cellulaires individuels et réduire les distractions causées par la croissance de l’organisme. À l’aide des algorithmes intégrés dans Photoshop CS five à partir de l’onglet Fichier du menu principal, ouvrez les scripts et sélectionnez Charger les fichiers dans la pile.

Ensuite, importez les fichiers d’image MP dans le panneau de chargement des couches. Assurez-vous que l’option Tentative d’alignement automatique des images sources n’est pas sélectionnée. Sinon, les données de l’image peuvent être déformées.

Une fois que tous les fichiers MP ont été chargés dans le volet des calques, vérifiez que toutes les images sont dans l’ordre chronologique et que le point le plus ancien se trouve en haut du calque. Empilez-les, glissez-les et déposez-les jusqu’à ce qu’ils soient correctement ordonnés. Si nécessaire, sélectionnez l’alignement automatique des calques.

Choisissez Repositionner et cliquez sur OK. Hors focale, les régions d’une image MP initiale peuvent être corrigées pour produire un champ rétinien uniformément focalisé. Pour commencer le traitement de l’image, utilisez la fonction de recadrage dans LAS.

Saf restreint manuellement les tranches initiales et finales, de sorte qu’elles ne couvrent que la bande d’adhérence dans la zone initialement floue. Cliquez sur Appliquer pour générer un nouveau fichier de pile optimisé pour cette région. Ensuite, générez une nouvelle projection maximale pour la pile optimisée localement et exportez-la sous forme de fichier TIF dans Photoshop.

Ouvrez les scripts et sélectionnez Charger les fichiers dans la pile. Entrez ensuite le fichier MP initial et le fichier MP optimisé dans le panneau de chargement des couches. Encore une fois, assurez-vous que l’option Tentative d’alignement automatique des images sources n’est pas sélectionnée et sélectionnez OK.

Sélectionnez les deux calques et choisissez le mélange automatique des calques pour produire un champ rétinien uniformément net. Enregistrez cette image composite en tant que fichier TIF. À l’aide d’un outil de transformation, faites pivoter les images de sorte que l’axe ventral dorsal de la rétine soit aligné sur l’axe Y de l’image vidéo.

Utilisez le réglage du niveau de chaque cadre pour améliorer le contraste entre la membrane cellulaire et le corps cellulaire. Sélectionnez ensuite Créer des images à partir de calques pour convertir les images en film. Notez que les couches sont ajoutées au volet d’animation dans un ordre séquentiel en commençant par le bas de la pile.

Pour inverser l’ordre des piles, sélectionnez tous les cadres, puis Inversez les cadres. Sélectionnez le délai d’image de 0,8 seconde pour chaque image et choisissez QuickTime. Exportez et sélectionnez le format vidéo souhaité.

Enfin, sous Options de rendu, sélectionnez la fréquence d’images à personnaliser et entrez une fréquence d’images de 15. Cliquez ensuite sur rendu. Un gradient de développement prononcé a été observé à travers l’œil avec cette technique, ce qui a donné lieu à des descriptions détaillées des motifs oculaires.

Au cours de l’enveloppement primaire, deux cellules ont été recrutées en tant que cellules primaires, qui ont rapidement encerclé les faisceaux de photorécepteurs se connectant les uns aux autres pour former des jonctions stables. Les cellules internes indifférenciées gisaient selon un motif désorganisé lorsque les primaires s’enroulaient et se scellaient. Chaque faisceau de photorécepteurs réorganise les mouvements cellulaires locaux.

Les cellules initiales regroupées sur les côtés dorsal et ventral de chaque oma. L’intercalation intercellulaire a réarrangé les cellules de deux rangées en une seule rangée. Suite à l’intercalation, la compétition tertiaire a été capturée au microscope.

Les cellules concurrentes ont occupé la niche tertiaire pendant cinq à dix minutes avant d’être déplacées. Finalement, une seule cellule a établi la niche tertiaire stable. Lors de l’élagage final, une poussée d’apoptose a réduit le nombre d’ICS au minimum requis pour générer efficacement un réseau de cellules d’entrée dans le matériau à travers l’œil composé.

Une fois maîtrisée, l’imagerie des EPI peut être réalisée en quatre heures si elle est réalisée correctement. Le traitement ultérieur de l’image prend environ une heure.