Name: Fluorescence-trempe dun proche infrarouge fluorophore encapsulée dans des liposomes comme outil de In Vivo Imagerie optique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Découvrez la préparation de liposomes activables pour l'imagerie in vivo de l'inflammation avec une haute sensibilité. Cette méthode utilise un film lipidique hydraté avec un colorant fluorescent proche infrarouge encapsulé.

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Ce travail a été soutenu par les subventions Deutsche Forschungsgemeinschaft HI-698 / 10-1 et RU-1652 / 1-1. Nous remercions Doreen mai pour une excellente assistance technique et la société Dyomics GmbH, Jena pour leur soutien en nature.

NOTE: Toutes les procédures sont approuvées par le comité régional et des animaux conformément aux lignes directrices internationales sur l&#39;utilisation éthique des animaux. 1. Préparation des matériaux et instruments <ol><li> Préparation d&#39;une dispersion de vésicules formées spontanément (SFV) <ol><li> Dissoudre et préparer des solutions d&#39;achat d&#39;actions des phospholipides suivants: 214 mg / ml phosphatidylcholine d&#39;oeuf (EPC), 134 mg / ml de cholestérol, 122 mg / ml de 1,2-distearoyl- sn-glycéro-3-phosphoethanolamine- N - [méthoxy (polyéthylène glycol) -2000] (sel d&#39;ammonium) (mPEG 2000 -DSPE) et 2 mg / ml de 1,2-dioleoyl- sn-glycéro-3-phosphoethanolamine- N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4 yl) (sel d&#39;ammonium) (NBD-DOPE) dans le chloroforme et stocker dans des flacons de verre. </li><li> Fournir environ 3 ml de chloroforme dans un ballon à fond rond et de transférer le volume approprié de la solution mère de phospholipides dans le ballon à fond rond pour préparer des liposomes composés de EPC: Chol: mPEG 2000 -DSPE à un rapport molaire de 6,5: 3: 0,5. Pour le double marquage de fluorescence des liposomes ajouter 0,3% en moles NBD-DOPE à la solution de lipide. </li><li> On évapore le chloroforme de la solution de phospholipide organique sous pression réduite (300 mbar) à 55 ° C en utilisant un évaporateur rotatif. </li><li> Après un film de phospholipides homogène est formé, de réduire la pression à 10 mbar pendant 1-2 heures pour enlever le dépôt de chloroforme résiduel. </li><li> Bien que le chloroforme se évapore, on dissout DY-676-COOH (6,181 uM) dans du tampon Tris 10 mM pH 7,4 et remplir un vase de Dewar d&#39;azote liquide. Allumez un bain à ultrasons et réglé à 50 ° C. </li><li> Transférer un volume approprié (0,5 à 1 ml) de DY-676-COOH (6,181 uM) solution dans le ballon à fond rond pour hydrater le film de phospholipide sec et vortexer vigoureusement jusqu&#39;à une vésicule formée spontanément (SFV) forme de dispersion. Assurez-vous que tous les phospholipides sont dispersés pour éviter la perte de lipides. </li><li> Tra soigneusementnsfer le ballon à fond rond contenant la dispersion SFV dans l&#39;azote liquide et congeler la dispersion de 3-5 min. Placez le ballon dans un bain à ultrasons à 50 ° C pour dégeler la dispersion puis la dispersion vortex vigoureusement pendant 1-2 min. Répétez cette procédure six fois, soit un total de sept cycles gel et de dégel. </li></ol></li><li> Extrusion du sFv de former des vésicules de liposomes homogènes <ol><li> Transférer la dispersion SFV dans une seringue de 1 ml (seringue-a) et extruder la dispersion à travers une membrane de polycarbonate de 100 nm en utilisant une extrudeuse à LiposoFast-base-b dans la seringue. </li><li> Extruder la dispersion de la seringue-b, de retour dans la seringue-a, puis répéter le cycle dix fois. Du fait de l&#39;extrusion, la solution dans la seringue passe d&#39;un aspect trouble à une dispersion limpide avec le temps. Après dix cycles (vingt étapes simples d&#39;extrusion) retirer la seringue-b de l&#39;appareil et extruder la dispersion pour la dernière fois de la seringue-un directement dans un stérile1,5 ml du tube de réaction. </li></ol></li><li> Purification des liposomes encapsulés DY-676-COOH à partir de colorant libre <ol><li> Préparer une colonne de Chromatographie sur gel G25 en utilisant des perles trempées dans du Tris 10 mM de tampon pH 7,4 (colonne de longueur 28 cm, diamètre 0,8 cm). </li><li> Transférer 0,5 ml de dispersion de vésicules extrudé sur le lit de gel et de laisser l&#39;évacuation de l&#39;échantillon dans la matrice de gel. </li><li> Éluer les liposomes avec Tris 10 mM pH 7,4 (figure 1A) et laver la colonne jusqu&#39;à ce que les drains de colorant libre complètement hors de la colonne. Si besoin est, collecter et recycler le colorant libre par dessalage et de déshydratation selon les instructions du fabricant. </li><li> Concentrer les liposomes éluées par ultracentrifugation (200 000 x g, 2 heures à 8 ° C) puis de les disperser dans un volume adéquat de tampon stérile 10 mM de Tris pH 7,4. </li></ol></li><li> Quantification de la concentration encapsulé DY-676-COOH <ol><li> Préparer une courbe d&#39;étalonnage en dissolvant DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 nM) dans du tampon Tris 10 mM, pH 7,4 contenant 0,1% de Triton X100. </li><li> Dissoudre 2 pi (100 nmol de lipide finale de 50 mmol / L stock) des liposomes pendant 5 min à température ambiante dans du tampon Tris 100 pi contenant 1% de Triton X100 pour détruire les vésicules et la libération du colorant encapsulé. Puis diluer les échantillons avec du tampon Tris 10 mM, pH 7,4 jusqu&#39;à une concentration finale de Triton-X100 à 0,1% (v / v) faire un volume total de 1 ml. Préparer tous les échantillons en double. </li><li> Mesurer l&#39;absorption et l&#39;émission de tous les échantillons (libre DY-676-COOH et le Triton-X100 traitée liposomes) à une excitation λ = 645 nm et une émission λ = 700 nm. Établir et utiliser une courbe d&#39;étalonnage du colorant libre de déterminer la concentration de colorant encapsulé. </li></ol></li><li> Liposome caractérisation <ol><li> Déterminer la taille et le potentiel zêta de liposomes par diffusion dynamique de la lumière. Diluer les échantillons de liposomes avec filtre stérilisé (0,2 um) Tris 10 mM pH 7,4 à aconcentration de 100 à 300 pM (lipide). Transférer les échantillons dilués dans une cuvette jetable de faible volume et de mesurer l&#39;échantillon selon les instructions du fabricant. </li><li> Caractériser les liposomes par microscopie électronique à étayer la taille, l&#39;intégrité et l&#39;homogénéité des vésicules liposomiques selon des protocoles standards. </li></ol></li></ol> 2. Validation de la fluorescence-trempe et activation des liposomes préparés <ol><li> L&#39;analyse physico-chimique de la fluorescence et l&#39;activation <ol><li> Préparer deux tubes de 1,5 ml pour le Lip-Q et deux tubes pour la libre DY-676-COOH. Transfert 100 nmol lipides totaux (2,38 de pi d&#39;un / L Lip-Q solution stock de 42 mmol, contenant 138 pg / ml de la encapsulé DY-676-COOH) dans les tubes correspondants. Transfert Gratuit équivalent DY-676-COOH à la teneur en colorant de Lip-Q (0,38 pg qui résulte par exemple de 138 ug / 1000 pi x 2,38 pi Lip-Q utilisé). Incuber une baignoiree de chaque sonde à 4 ° C et congeler le second tube à -80 ° C pendant une nuit (16 h). </li><li> Chauffer un bloc chauffant à 30 ° C. Remplir une boîte de refroidissement avec de la glace pilée et équilibrer une aliquote de tampon Tris 10 mM pH 7,4 à température ambiante. </li><li> Retirer sondes de 4 ° C et équilibrer à température ambiante (enveloppé dans une feuille d&#39;aluminium pour le protéger de la lumière) et rapidement dégeler sondes de -80 ° C à 30 ° C pendant 5 min. Refroidir les sondes décongelés sur de la glace pendant 1 min avant de les transférer à la température ambiante (également enveloppé dans une feuille d&#39;aluminium pour le protéger de la lumière). </li><li> Ajouter tampon Tris 10 mM (pH 7,4) à chacune des sondes à 100 ul volume final et équilibrer toutes les sondes à la température ambiante pendant 10 min. </li><li> Pipette 80 ul de chaque sonde dans une cuvette de verre à faible volume et mesurer l&#39;absorption de chaque sonde de 400 à 900 nm sur un spectromètre. Retour à la sonde de leurs tubes correspondants. </li><li> Transférer 80 pi de chaque sonde dans une cuvette en verre appropriéet mesurer l&#39;émission de fluorescence sur un spectrofluorimètre en excitant les sondes à 674 nm et en mesurant la fluorescence de 694 à 800 nm. </li></ol></li><li> L&#39;absorption cellulaire et l&#39;activation de fluorescence <ol><li> Obtenez et la culture les lignées cellulaires suivantes dans leurs milieux de culture correspondante en fonction des conditions standard (37 ° C, 5% de CO 2 et 95% atmosphère humidifiée). Ici, en utilisant ce J774A.1 de la lignée cellulaire de macrophage murin (modifié par Dulbecco du milieu de Eagle additionné de 10% (en volume) de sérum / fœtal de veau), la lignée cellulaire de glioblastome humain U-118 mg (MEM contenant des vitamines essentielles et 10% (v / v) de sérum de veau foetal) et la lignée de cellules de fibrosarcome humain HT-1080 (RPMI avec 5% de FCS). </li><li> Manteau de 8 puits diapositives de chambre avec poly-L-lysine (ajouter 100 ul 0,001% de poly-L-lysine dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 10 min. Solution Aspirer et laisser les diapositives de la chambre à sécher pendant au moins quatre heure à température ambiante sur un établi stérile. Rincer les lames de la chambre 3fois avec la solution saline tamponnée 200 pi de Hank puis les sceller avec de la paraffine et de feuille d&#39;aluminium et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à l&#39;emploi. </li><li> Alors que les diapositives de la chambre se tarissent, filtre stériliser les liposomes et solution de colorant et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à l&#39;emploi. </li><li> Pour l&#39;analyse d&#39;absorption de sonde avec l&#39;ensemble du corps in vivo NIR Système d&#39;imagerie par fluorescence, 5 préparer de petits flacons de culture de chacun des trois lignées de cellules de test (15 flacons au total). Graine 2 x 10 6 J774A.1, U-118 mg et des cellules HT-1080 par flacon de culture avec 5 ml de milieu de culture respectif (dans quintuples) et poussent de 16 à 24 heures. Parallèlement aux flacons de culture, ensemencer 30 000 cellules de chaque lignée cellulaire (J774A.1 et HT-1080) ou 20 000 cellules (U-118 mg) à 2 puits de la glissière de la chambre respectivement, et croître dans un milieu de culture de 500 ul pendant 16 à 24 h . </li><li> Le lendemain, ajouter 100 nmol (montant de finale en lipides) de Lip-Q pour deux flacons par lignée cellulaire et à un puits de chaque ligne de cellules sur la lame de la chambre.Immédiatement transférer 1 flacon par ligne cellulaire à 4 ° C et le second flacon revenir à l&#39;incubateur. REMARQUE: Le volume des sondes ajouté dans les flacons et les diapositives de la chambre sont les mêmes, ce qui rend la concentration sur des lames de la chambre 10 fois plus élevé (5 ml est de 500 pi de milieu de culture). Cela est nécessaire parce que la détection microscopique est moins sensible que le système d&#39;imagerie par fluorescence NIR où culots cellulaires dans les fioles sont imagés. </li><li> Ajouter la libre DY-676-COOH à une concentration équivalente à la teneur en colorant de Lip-Q pour les cellules dans deux flacons par lignée cellulaire et à un puits de chaque ligne de cellules sur la lame de la chambre, puis transférer immédiatement 1 flacon par ligne cellulaire à 4 ° C (d&#39;épuisement de l&#39;énergie) et l&#39;autre ballon avec le coulisseau de la chambre arrière à l&#39;incubateur. Incuber les cellules pendant 24 heures dans les conditions correspondantes. Les cellules dans le ballon sans sonde de servir de témoin non traité. </li></ol></li><li> NIRF l&#39;imagerie et l&#39;analyse semi-quantitative <ol><li> Après 24 heures la durée d&#39;incubation, récolter les cellules dans des flacons en lavant les cellules deux fois avec une solution tamponnée de Hanks de sel (HBSS), puis racler les cellules dans 500 ul de HBSS et culot par centrifugation (5 min à 200 x g) dans 500 ul de tubes. </li><li> Placer les tubes avec les culots cellulaires (HBSS) et dans un imageur NIRF et image en utilisant des filtres pour excitation (615-665 nm) et d&#39;émission (coupe à&gt; 700 nm). </li><li> Déduire autofluorescence et d&#39;évaluer l&#39;intensité de la cible par rapport autofluorescence selon les instructions du fabricant. Cela vous donnera les niveaux semi-quantitatives de l&#39;intensité de fluorescence en signal moyen (compte échelle / sec), qui représente les niveaux de comptage après calibrage pour le temps de l&#39;exposition, gain de la caméra, binning et la profondeur de bits, de sorte que les mesures sont comparables entre eux. </li></ol></li><li> Analyse microscopique confocale <ol><li> Après 24 heures d&#39;incubation, récolter les cellules sur des lames de chambre en lavant deux fois avec 500 ul HBSS. </li><li> Fixer la CElls avec 200 ul de HBSS contenant 3,7% (v / v) de formaldehyde pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Alors que la fixation se passe, diluer la tache d&#39;ADN, Hoechst-33258 1:50 avec une solution de montage. </li><li> Après fixation, laver les cellules deux fois avec du HBSS puis séparer les chambres des lames de verre. Ajouter la solution de montage de 50 ul contenant l&#39;ADN-tache sur chaque spot correspondant aux puits des diapositives de la chambre. Couvrir les cellules avec des lamelles de verre, sceller les bords avec vernis à ongles transparent et sécher à l&#39;air pendant 10 min à température ambiante (foncé). </li><li> cellules image sur un microscope à fluorescence approprié ou microscope confocal. Utilisez les excitation et d&#39;émission paramètres suivants pour la visualisation des composants correspondants: noyaux (Hoechst-33258: excitation 405 nm, émission 420 à 480 nm). NBD-DOPE (lipide liposomique: excitation 488 nm, émission 530 nm). DY-676-COOH (NIR de colorant fluorescent: excitation 633-645 nm, émission 650 à 700 nm). NOTE: Assurez-vous que le microscope à fluorescence d&#39;unevailable est équipé de filtres appropriés qui permettent excitation et d&#39;émission de longueurs d&#39;onde supérieure à 630 nm. </li></ol></li></ol> Base-liposome 3. In Vivo imagerie par fluorescence de l&#39;inflammation <ol><li> Préparation des animaux et des matériaux <ol><li> Maison 8-12 semaines, âgé de souris NMRI mâles pesant environ 36 g dans des conditions standard avec de la nourriture et de l&#39;eau ad libitum. </li><li> Sept jours avant le début des expériences, donner toutes les souris d&#39;un régime alimentaire faible en phéophorbide afin de réduire l&#39;autofluorescence des tissus. </li><li> Vingt-quatre heures avant le début de chaque expérience, de se raser la souris à la zone souhaitée (par exemple, toute la zone arrière si l&#39;imagerie de la jambe arrière de l&#39;œdème est souhaitée). </li><li> Peser les animaux et de calculer la quantité de sonde doit être injecté par souris (Lip-Q et Lip-dQ à 10 pmol (concentration de lipides) par kg de poids et sans DY-676-COOH (équivalent à teindre contenu de Lip-Q utilisé) . </li><li> Image les animauxun corps de fluorescence NIR imageur avec les mêmes paramètres utilisés pour les culots cellulaires. Cette mesure fournit autofluorescence des animaux. </li><li> Dissoudre 10 mg de zymosan A dans 1 ml de solution saline isotonique et de stocker toute une nuit à 4 ° C. </li></ol></li><li> L&#39;induction de l&#39;inflammation in vivo et l&#39;imagerie NIRF <ol><li> Préparez 3 seringues par souris contenant les solutions suivantes. Remplir une seringue avec 50 ul de solution zymosan A (10 mg / ml) et de la seconde seringue avec 50 ul de solution saline isotonique. Remplissez la troisième seringue avec les sondes, lequel Lip-Q et Lip-DQ (10 pmol / kg de poids (lipides)) sont désignés pour les animaux d&#39;essai et d&#39;une connexion DY-676-COOH (concentration que dans Lip-Q) pour les animaux de contrôle. Assurez-vous que les sondes sont dilués avec HBSS stérile à 150 volume final ul. </li><li> Appliquer la crème des yeux sur les yeux des animaux pour éviter la sécheresse et anesthésier les animaux avec 2% d&#39;isoflurane jusqu&#39;à ce qu&#39;ils sont profondément endormis et ne réagit pas au toucher sur les pattes (cela prend environ 2 minutes). </li><li> Placez la souris sur une natte chaude (toujours sous anesthésie) et injecter le zymosan A voie sous-cutanée de la solution sur la patte arrière droite et la solution saline sur la patte arrière gauche. Injectez immédiatement la sonde par voie intraveineuse et de l&#39;image de l&#39;animal par la suite, puis un temps record d&#39;injection / mesure (que t = 0 h). Enregistrez les images résultantes que l&#39;image cubes et répéter les étapes ci-dessus pour tous les autres animaux et les sondes respectives. </li><li> Image les animaux tous les 2 h pour le post-injection de 10 h et post-injection puis à 24 h, en se assurant que le stade de la chambre de mesure est chaude (par exemple, en plaçant sous un tapis chaud), afin d&#39;éviter l&#39;hypothermie. Après chaque mesure, placer les animaux dans une cage avec de la nourriture et de l&#39;eau ad libitum et placer la cage dans une chambre animale tempéré. Euthanasier les animaux par les premier anesthésiant avec 2% d&#39;isoflurane jusqu&#39;à ce que les animaux ne réagissent plus à toucher, puis euthanasier avec du dioxyde de carbone pour 5 à 10 min, ce qui rendassurer que les animaux cessent de respirer complètement et la rigidité cadavérique. </li><li> Disséquer les souris selon des protocoles standards qui peuvent être évalués en ligne (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) et l&#39;image des organes. </li><li> Évaluer les résultats de mesure selon les instructions du fabricant d&#39;abord déduisant la fluorescence globale des animaux (démixage) puis des régions attribution d&#39;intérêt pour autofluorescence (de gauche patte arrière avec une solution saline) et la cible fluorescence de zone enflammée (de patte arrière droite avec zymosan-A). </li></ol></li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Étant donné que les liposomes peuvent également servir de systèmes de délivrance pour des colorants fluorescents, ils permettent l&#39;imagerie des maladies cibles. L&#39;encapsulation des concentrations élevées de colorants fluorescents tels que le colorant NIRF, DY676-COOH utilisé ici, conduit à un niveau élevé de l&#39;extinction de fluorescence du colorant piégé. Extinction de la fluorescence, un phénomène observé avec de nombreux fluorophores à forte concentration peut être exploitée dans plusieurs applications...

Les liposomes ont été intensivement étudiée et servir comme l&#39;un des systèmes les plus biocompatibles de délivrance de médicaments pour des applications biomédicales cliniques 1,2. Ils sont principalement constitués de phospholipides et de cholestérol, qui sont tous deux composés biocompatibles imitant des parties de membranes cellulaires naturelles. Considérant que les substances hydrophiles peuvent être piégés dans l&#39;intérieur aqueux, agents lipophiles peuvent être incorporés dans la bicouche liposomale trois phospholipides. L&#39;encapsulation de substances dans l&#39;intérieur aqueux des liposomes confère une protection contre la dégradation in vivo et empêche également le système hôte contre les effets toxiques des médicaments cytotoxiques utilisés pour la thérapie de maladies, par exemple des agents chimiothérapeutiques visant à détruire les cellules tumorales. La modification de la surface liposomique avec des polymères comme le polyethylene glycol (pégylation) se étend en outre le temps de circulation sanguine des liposomes in vivo en raison de la stabilisation stérique 4. Moreover, les liposomes peuvent séquestrer des concentrations élevées de plusieurs substances telles que les protéines, 5,6 substances hydrophiles 7,8 et 9 enzymes. Ils servent donc des outils thérapeutiques et diagnostiques cliniques fiables qui méritent leur approbation pour la livraison de médicaments cytotoxiques tels que la doxorubicine pour le traitement du cancer 4. En raison de leur souplesse, les liposomes peuvent également être chargées avec des fluorochromes à usage chirurgical et de diagnostic par imagerie. imagerie de fluorescence fournit un coût-efficace et non invasive outil de diagnostic in vivo qui, cependant, exige certaines exigences de base. Il pourrait être démontré que fluorochromes qui conviennent le mieux pour l&#39;imagerie in vivo ont absorption caractéristique et maxima d&#39;émission dans la gamme où la dispersion de la lumière et de diffusion ainsi que autofluorescence de tissu provenant de l&#39;eau et de l&#39;hémoglobine est faible. Ainsi, de telles sondes ont leurs maxima abs / em entre 650 et 10 900 nm.<html> En outre, la stabilité de fluorochromes la fois in vitro et in vivo est critique, opsonisation et le dédouanement rapide peuvent considérablement limiter leur application pour l&#39;imagerie in vivo 11. D&#39;autres effets tels que la mauvaise stabilité et une faible sensibilité ou des effets cytotoxiques sur les organes cibles comme on le voit avec le vert d&#39;indocyanine (ICG) 12-16, sont indésirables et doivent être pris en considération lors de la conception des sondes pour l&#39;imagerie in vivo. Ces observations ont conduit au développement actif de plusieurs fluorochromes NIR précliniques, des nanoparticules ainsi que de nouvelles techniques pour l&#39;imagerie in vivo de processus inflammatoires, le cancer et pour la chirurgie guidée par l&#39;image 17-20. En dépit de la stabilité de la plupart (fluorescence dans le proche infrarouge) NIRF colorants préclinique in vitro, leur perfusion rapide et de la clairance par le foie et les reins empêchent leur utilisation dans l&#39;imagerie optique in vivo de maladies et de processus inflammatoires. MÉNAGEMENT &quot;&gt; Nous présentons donc un protocole d&#39;encapsulation de fluorochromes tels que le bien caractérisé proche infrarouge colorant fluorescent DY-676-COOH, connu pour sa tendance à l&#39;auto-trempe à des concentrations relativement élevées 21 dans des liposomes. A des concentrations élevées H- la formation de dimères et / ou pi-empilement interactions entre les molécules de fluorophore situées dans la suite de rayon de Förster les uns des autres dans Förster transfert d&#39;énergie par résonance (FRET) entre les molécules de fluorochrome. A faible concentration de l&#39;espace entre les molécules de fluorophore augmente, empêchant de ce fait l&#39;interaction de pi-empilement et H-formation de dimères et aboutissant à forte émission de fluorescence. Le commutateur entre la concentration haute et basse et la fluorescence trempe accompagnement et l&#39;activation est une stratégie prometteuse qui peut être exploitée pour l&#39;imagerie optique 22. À cet égard, l&#39;encapsulation de fortes concentrations du colorant NIRF DY-676-COOH dans l&#39;intérieur aqueux de liposomes est plus favorable pour l&#39;imagerie in vivo que le colorant libre. Le défi de la méthode réside d&#39;abord dans la bonne encapsulation et d&#39;autre part, à la validation des avantages résultant de l&#39;encapsulation de fortes concentrations du colorant. En comparant les propriétés de formation d&#39;image pour traitement de liposomes avec celle du colorant libre et également avec une formulation non trempé liposome avec de faibles concentrations de colorant est indispensable. Nous montrons par un protocole simple, mais très efficace hydratation du film et extrusion combinée avec le gel et de dégel des cycles alternés que l&#39;encapsulation des concentrations de trempe de DY-676-COOH dans des liposomes est possible. D&#39;autres procédés utilisés pour préparer des liposomes, tels que le procédé d&#39;evaporation en phase inverse 23 ainsi que la méthode d&#39;injection d&#39;éthanol 24 permettent la préparation de liposomes avec des rendements élevés d&#39;encapsulation de nombreuses substances hydrophiles. Cependant, la nature de la substance à encapsuler peut influer sur l&#39;efficacité d&#39;encapsulation. En effet,l&#39;hydratation du film et de l&#39;extrusion protocole présenté ici a révélé la plus grande efficacité pour l&#39;encapsulation de DY-676-COOH. Pour illustrer les avantages de l&#39;encapsulation liposomale de DY-676-COOH, un modèle de l&#39;oedème induit par le zymosan, ce qui permet l&#39;étude des processus inflammatoires dans les quelques heures, a été utilisé. Ici, il est démontré que les liposomes avec des concentrations élevées de la DY-676-COOH encapsulés sont plus appropriés pour le corps entier en imagerie optique in vivo de processus inflammatoires que le colorant libre ou la formulation liposomale non trempé avec de faibles concentrations de colorant. Ainsi, le protocole sous-jacent fournit un procédé simple et rapide pour produire des liposomes fluorescents pour traitement et la validation de l&#39;activation et leur potentiel imagerie à la fois in vitro et in vivo.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Matériaux et équipements pour la préparation des liposomes</td></tr><tr><td>egg phospahtidylcholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840051P</td><td>Dissoudre dans du chloroforme et stocker dans des flacons en verre (214 mg/ml)</td></tr><tr><td>cholestérol</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td>Dissoudre dans du chloroforme et stocker dans des flacons en verre (134 mg/ml)</td></tr><tr><td>1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000] (sel d’ammonium)Avanti</td> <td>Polar Lipids</td><td>880120P</td><td>Dissoudre dans du chloroforme et stocker dans des flacons en verre (122 mg/ml)</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-(7-nitro-2-1, 3-benzoxadiazol-4-yl) (sel d’ammonium)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810145P</td><td>Dissoudre dans le chloroforme et stocker dans des flacons en verre (2 mg/ml)</td></tr><tr><td>Sartorius MC1 (d = 0,01 mg)</td><td>Sartorius AG</td><td>Research RC 210 P</td><td>utilisé pour peser les phospholipides</td></tr><tr><td>Rotavapor</td><td>B&uuml ; chi Labortechnik AG</td><td>R-114</td><td>utilisé pour l’hydratation du film phospholipidique</td></tr><tr><td>Bain</td><td>d’eau B&uuml ; chi Labortechnik AG</td><td>R-481</td><td>utilisé pour l’hydratation du film phospholipidique</td></tr><tr><td>Contrôleur de vide</td><td>B&uuml ; chi Labortechnik AG</td><td>B-720</td><td>utilisé pour l’hydratation du film phospholipidique</td></tr><tr><td>Vacobox</td><td>B&uuml ; chi Labortechnik AG</td><td>B-177</td><td>utilisé pour l’hydratation du film phospholipidique</td></tr><tr><td>Refroidisseur à circulation</td><td>LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG</td><td>WKL 230</td><td>utilisé pour l’hydratation du film phospholipidique</td></tr><tr><td>DY-676-COOH</td><td>Dyomics GmbH</td><td>676-00</td><td>Dissoudre dans 10 mM Tris et stocker le stock à -20&deg ; C</td></tr><tr><td>Tris-(Hydroxyméthyl)-aminomethan</td><td>Applichem</td><td>A1086</td><td>tampon 10 mM, pH 7,4</td></tr><tr><td>Trichlorméthane</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>Y015.2</td><td>utilisé pour la préparation des liposomes</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Merck Eurolab GmbH</td><td>USR 170 H</td><td>utilisé pour la préparation des liposomes</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, n° 146-3011-00)</td><td>Scientific Industries Inc.</td><td>SI-0256</td><td>utilisé pour la préparation des liposomes</td></tr><tr><td>Sephadex G25 medium&nbsp ;</td><td>GE Healthcare Europe GmbH</td><td>17-0033-01</td><td>utilisé pour la purification des liposomes</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Ferak Berlin GmbH</td><td>505002</td><td>utilisé pour la destruction des liposomes pour la quantification des colorants</td></tr><tr><td>LiposoFast-Basic</td><td>Avestin Inc.</td><td></td><td>utilisé pour l’extrusion de liposomes</td></tr><tr><td>Membrane filtrante en polycarbonate, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)</td><td>VWR</td><td></td><td>utilisé pour l’extrusion de liposomes via LiposoFast-Basic</td></tr><tr><td>Fluostar Optima</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>utilisé pour la quantification des colorants</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td></td><td>utilisé pour la détermination de la taille des liposomes et du zêtapotentiel</td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse&nbsp ;</td><td>Beckmann Coulter GmbH</td><td>XL 80</td><td>utilisé pour la concentration des échantillons</td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckmann Coulter GmbH</td><td>SW 55 TI</td><td>utilisé pour la concentration des échantillons</td></tr><tr><td colspan="4">Matériaux et équipements pour l’évaluation des liposomes et de l’imagerie optique</td></tr><tr><td>Zymosan-A de Saccharomyces cereviciae</td><td>Sigma</td><td>Z4250-250MG</td><td>utilisé pour l’induction de l’inflammation</td></tr><tr><td>Solution saline isotonique (0,9 %)</td><td>Fresenius GmbH</td><td>PZN-2159621</td><td>utilisé pour la dilution de Zymosan-A</td></tr><tr><td>Vaporisateur Isoflurane</td><td>Ohmeda Isotec 4</td><td></td><td>utilisé pour l’anesthésie des animaux</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Actavis GmbH&nbsp ;</td><td>PZN-7253744</td><td>anesthésie</td></tr><tr><td>Thermo Mat Pro 20 W</td><td>Lucky Reptile</td><td>61202-HTP-20</td><td>utilisé pour garder les animaux au chaud pendant l’anesthésie</td></tr><tr><td>Omnican-F (1 ml d’injection)&nbsp ;</td><td>Braun</td><td>PZN-3115465</td><td>utilisé pour l’application sous-cutanée et intraveineuse de sondes</td></tr><tr><td>Crème pour les yeux au panthénol</td><td>Jenapharm</td><td>PZN-3524531</td><td>utilisée pour prévenir la sécheresse oculaire des animaux pendant l’anesthésie Solution</td></tr><tr><td>saline tamponnée de Hanks</td><td>PAA Laboratories /Biochrom AG</td><td>L2045</td><td>sans Mg2+, Ca2+ et rouge de phénol. Pour la dilution des sondes et pour le lavage des cellules Les lames de</td></tr><tr><td>chambre à 8 puits</td><td>BD Biosciences</td><td>354108</td><td>utilisées pour la culture cellulaire suivie de la microscopie.</td></tr><tr><td>Fioles de culture cellulaire</td><td>Greiner BioOne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milieux de culture cellulaire</td><td>Gibco (life technologies GmbH)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal&nbsp ;</td>Solution de poly-L-lysine <td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(0,01 %, 50 % ml)</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td>utilisé pour revêtir les lames de chambre de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Mountant Permafluor</td><td>ThermoScientific&nbsp ;</td><td>S21022-3</td><td>Solution de montage pour la microscopie</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>AppliChem</td><td></td><td>Coloration d’ADN pour la microscopie</td></tr><tr><td>Hera-Safe Heraeus</td><td>Instruments</td><td></td><td>Banc de travail stérile utilisé pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>HERA cell</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td>Incubateur utilisé pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>LSM510-Meta</td><td>Zeiss</td> utilisé pour la <td></td><td>microscopie</td></tr> <tr><td>confocaleSystème d’imagerie par fluorescence in vivo Maestro-TM</td><td>CRi, Woburn</td><td></td><td>utilisé pour l’imagerie par fluorescence du corps entier de petits animaux</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre (Ultrospec 4300 pro UV)</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>utilisé pour la mesure de l’absorption</td></tr><tr><td>Spectrofluorimètre (Jasco FP-6200)</td><td>Jasco</td><td></td><td>utilisé pour la mesure de l’émission</td></tr><tr> de fluorescence<td colspan="4"><fort>Animaux</fort></td></tr><tr><td>Souris NMRI (8-12 semaines, mâle)</td><td>Elevage Janvier, France</td><td></td><td>utilisé pour des essais sur l’inflammation</td></tr></tbody></table>

fluorescence-trempe d'un proche infrarouge fluorophore encapsulée dans des liposomes comme outil de in vivo imagerie optique

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

L’imagerie optique offre un large éventail de modalités de diagnostic et a suscité beaucoup d’intérêt en tant qu’outil d’imagerie biomédicale. Malgré le grand nombre de techniques d’imagerie actuellement disponibles et les progrès de l’instrumentation, il reste nécessaire de disposer de sondes très sensibles adaptées à l’imagerie in vivo. L’un des problèmes typiques des sondes fluorescentes précliniques disponibles est leur clairance rapide in vivo, ce qui réduit leur sensibilité d’imagerie. Pour contourner la clairance rapide, augmenter le nombre de molécules de colorant sur le site cible, et ainsi réduire l’autofluorescence de fond, l’encapsulation du colorant fluorescent proche infrarouge, DY-676-COOH dans les liposomes et la vérification de son potentiel pour l’imagerie in vivo de l’inflammation ont été effectuées. Le DY-676 est connu pour sa capacité à s’auto-tremper à des concentrations élevées. Nous avons d’abord déterminé la concentration appropriée pour l’auto-trempe, puis encapsulé cette concentration dans l’intérieur aqueux des liposomes pégylés. Pour étayer le potentiel d’extinction et d’activation des liposomes, nous utilisons une méthode de congélation sévère qui entraîne des dommages aux membranes liposomiques sans affecter le colorant encapsulé. Les liposomes caractérisés par un niveau élevé d’extinction de la fluorescence ont été appelés Lip-Q. Nous montrons, par des expériences avec différentes lignées cellulaires, que l’absorption de Lip-Q se fait principalement par phagocytose, ce qui a permis de caractériser son potentiel en tant qu’outil d’imagerie in vivo de l’inflammation dans des modèles murins. De plus, nous utilisons un modèle d’œdème induit par le zymoran chez la souris pour étayer le potentiel de Lip-Q dans l’imagerie optique de l’inflammation in vivo. Compte tenu de l’absorption possible due à l’effet de perméabilité et de rétention accrues (EPR) induit par l’inflammation, une formulation de liposomes toujours active avec une faible concentration non éteinte de DY-676-COOH (appelée Lip-dQ) et de DY-676-COOH libre a été comparée à Lip-Q dans des essais sur des animaux.

L'encapsulation des concentrations élevées de colorants fluorescents tels que le colorant NIRF DY676-COOH utilisé ici dans l'intérieur aqueux des liposomes entraîne un niveau élevé de l'extinction de fluorescence. Extinction de la fluorescence, un phénomène observé avec de nombreux fluorophores à forte concentration, peut être exploitée dans plusieurs applications d'imagerie in vivo où une grande sensibilité et une détection fiable de la région cible sont demandés. L'utilisation de liposomes assure éga...

L’utilisation des fluorophores pour l’imagerie in vivo peut être considérablement limitée par l’opsonisation, la clairance rapide, la faible sensibilité de détection et les effets cytotoxiques sur l’hôte. L’encapsulation des fluorophores dans les liposomes par hydratation et extrusion du film conduit à l’extinction et à la protection de la fluorescence, ce qui permet une imagerie in vivo avec une sensibilité de détection élevée.

Fluorescence-trempe d'un proche infrarouge fluorophore encapsulée dans des liposomes comme outil de In Vivo Imagerie optique

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

L’objectif global de cette procédure est de préparer un liposome activat qui permet d’imager in vivo l’inflammation avec une sensibilité élevée. Ceci est accompli en préparant d’abord un film lipidique composé de phospholipides dans la deuxième étape. Les vésicules spontanées sont formées en hydratant le film phospholipidique avec une solution de concentration éteinte d’un colorant fluorescent proche infrarouge.Les vésicules formées spontanément ou SFV sont extrudés pour assurer l’homogénéité des vésicules liposomales, puis les liposomes sont purifiés à partir des molécules de colorant résiduelles non encapsulées. En fin de compte, des mesures spectrométriques de l’absorbance et de l’émission de fluorescence sont utilisées pour montrer l’état d’extinction du colorant encapsulé in vivo. L’imagerie par fluorescence dans le proche infrarouge est utilisée pour démontrer le potentiel des liposomes pour l’imagerie des processus inflammatoires.Le principal avantage de cette technologie par rapport aux autres technologies existantes est que nous pouvons déterminer le signal directement après l’internalisation de l’agent de contraste dans les cellules. Cela signifie qu’ils sont activés dans la cellule de sorte que le signal détecté provient exclusivement des cellules. L’implication de cette technique s’étend au diagnostic et au traitement du cancer.Étant donné que les phagocytes, tels que les macrophages associés aux tumeurs, peuvent absorber et dégrader les liposomes, libérant des médicaments thérapeutiques ou des sondes d’imagerie dans les tumeurs. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal parce que l’efficacité de l’encapsulation est influencée par les propriétés de l’utilisation du DAI et l’efficacité du processus d’hydratation. Pour initier une dispersion vésicale formée spontanément, commencez par ajouter environ trois millilitres de chloroforme dans une fiole à fond rond, suivie du volume approprié de solutions de tiges de phospholipides fraîchement préparées à un rapport molaire de 6,5 à trois à 0,5 pour un marquage fluorescent double des liposomes. Ensuite, ajoutez 0,3 % molaire N-B-D-D-D-O-P-E à la solution lipidique.Ensuite, utilisez un évaporateur rotatif pour évaporer le chloroforme de la solution de phospholipides organiques sous une pression réduite à 300 millibars et 55 degrés Celsius. Après la formation d’un film phospholipidique homogène, réduisez la pression à 10 millibars pendant une à deux heures pour éliminer tout dépôt résiduel de chloroforme pendant que le chloroforme s’évapore. Dissoudre le tampon d’intérêt de l’acide carboxylique de colorant fluorescent et remplir un récipient de dosage d’azote liquide.Allumez ensuite un bain à ultrasons réglé à 50 degrés Celsius. Transférez maintenant un volume approprié d’acide carboxylique dans le flacon à fond rond pour hydrater le film phospholipidique sec et agitez vigoureusement le flacon jusqu’à ce qu’une dispersion vésiculaire formée spontanément se forme, en vous assurant que tous les phospholipides sont dispersés pour éviter la perte de lipides. Congelez ensuite soigneusement la fiole à fond rond contenant la dispersion SFV dans l’azote liquide.Et après trois à cinq minutes, placez le ballon dans le bain à ultrasons pour décongeler la dispersion et agitez vigoureusement le ballon pendant encore une à deux minutes. Ensuite, pour faciliter la formation de vésicules homogènes, aspirez la dispersion SFV dans une seringue d’un millilitre, puis utilisez un extrudeur de base lipo sofas pour la faire passer à travers une membrane en polycarbonate de 100 nanomètres dans une deuxième seringue d’un millilitre. Extrudez la dispersion dans la première seringue, en répétant le transfert 10 fois.La solution doit passer d’un aspect brumeux à une dispersion claire. Après le 10e cycle d’extrusion, retirez la deuxième seringue et extrudez la dispersion pour la dernière fois directement dans un tube de réaction stérile de 1,5 millilitre. Transférez maintenant 0,5 millilitre de dispersion vésiculaire extrudée sur le lit de gel d’une colonne de chromatographie sur gel de 28 centimètres chargée de billes G 25 imbibées de tampon tris et laissez l’échantillon s’écouler dans la matrice de gel.Éluez les liposomes avec un tampon tris et collectez la fraction liposomique jusqu’à ce que le liposome s’écoule complètement. Ensuite, concentrez les liposomes éludés par ultracentrifugation et dispersez-les dans un volume adéquat de tampons tris stériles Les micrographies électroniques des liposomes devraient révéler une morphologie principalement inégale des vésicules liposomiques pour analyser les capacités d’extinction et d’activation de la fluorescence des liposomes. Ensuite, transférez un total de 100 nanomolaires des lipides appropriés dans deux microtubes à centrifuger de 1,5 millilitre.Transférez ensuite un acide di carboxylique libre équivalent à la teneur en colorant de la lèvre Q dans un autre tube de 1,5 millilitre et incubez un tube de chaque sonde à quatre degrés Celsius et le second à moins 80 degrés Celsius. Le lendemain matin, réglez sur le bloc chauffant à 30 degrés Celsius. Remplissez une glacière de glace pilée et équilibrez une aliquote de tampon tris à la température ambiante.Ensuite, décongelez rapidement les sondes du stockage négatif de 80 degrés Celsius à 30 degrés Celsius pendant cinq minutes tout en équilibrant les sondes de quatre degrés Celsius à la température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, refroidissez toutes les sondes sur de la glace pendant une minute avant de les remettre à température ambiante. Ajoutez maintenant un tampon tris à chacune des sondes jusqu’à un volume final de 100 microlitres.Et puis, après une autre incubation de 10 minutes à température ambiante, pipetez 80 microlitres de chaque sonde dans un vétérinaire en verre de faible volume et mesurez l’absorption de 400 à 900 nanomètres sur un spectromètre. Remettez les sondes dans leurs tubes correspondants, puis transférez 80 microlitres de chacune dans des cuvettes en verre appropriées. Mesurer les émissions de fluorescence sur un fluorimètre spectral en excitant les sondes à 674 nanomètres et en mesurant la fluorescence de 694 à 800 nanomètres.Pour évaluer les propriétés de détection de l’inflammation des liposomes, remplissez une seringue avec 50 microlitres de solution xin a, une avec 50 microlitres de solution saline isotonique et une avec la solution de sonde expérimentale, le tout dilué un HBSS à un volume final de 150 microlitres. Après avoir confirmé la sédation par pincement des orteils, appliquez une crème pour les yeux sur l’animal de laboratoire, puis placez la souris sur un tapis chaud. Injectez la solution de xon a par voie sous-cutanée sur la patte arrière droite de l’animal et la solution saline sur la patte arrière gauche.Ensuite, injectez immédiatement la sonde par voie intraveineuse et imagez l’animal par la suite. Enfin, enregistrez les images résultantes sous forme de cubes d’image. Imagerie des animaux toutes les deux heures pendant 10 heures après l’injection, puis à nouveau toutes les 24 heures.Les sondes liposomiques révèlent une absorption phagocytaire prédominante qui est inhibée par l’épuisement de l’énergie, comme on peut le voir via l’absorption de Q lip par des lignées cellulaires de microphages miroir hautement phagocytaires et des lignées cellulaires de glioblastome humain phagocytaire. Conformément à l’absorption phagocytaire observée dans les lignées cellulaires en culture, l’injection intraveineuse de LIP Q entraîne une augmentation de l’intensité de fluorescence de l’œdème en fonction du temps chez des modèles de souris avec une fluorescence de fond très faible et avec une intensité de fluorescence maximale détectée huit à dix heures après l’injection. En revanche, une fluorescence proche infrarouge relativement forte de l’ensemble de l’animal est observée après l’application de l’acide carboxylique libre ou du liposome DQ de la lèvre toujours allumé par rapport au Q de la lèvre.De plus, la lèvre liposomique non éteinte DQ révèle une fluorescence maximale de l’œdème dans les deux à quatre heures suivant l’injection, qui reste presque constante jusqu’à huit heures, puis diminue progressivement de la même manière que la lèvre éteinte. L’imagerie par fluorescence de l’œdème basée sur Q des organes de souris euthanasiées 24 heures après l’administration de la sonde révèle une légère fluorescence ex vivo du foie, de la vésicule biliaire et des reins, et une fluorescence très faible ou nulle de la rate, des poumons et du cœur, ce qui prouve l’élimination des sondes par la voie pathobiliaire. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser une forte concentration de colorant d’extinction du sens de la grippe et de disperser correctement les phospholipides.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer les liposomes activat pour l’imagerie in vivo de l’inflammation avec une sensibilité élevée. D’accord? N’oubliez pas que pour l’utilisation d’animaux dans la recherche, vous devez suivre les directives internationales, ce qui signifie que vous devez demander l’utilisation d’animaux dans des expériences. Vous avez besoin de l’approbation du comité d’éthique local.

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