Utilisation plusTipTracker Software mesurer microtubules Dynamics Xenopus laevis Cônes de croissance
7 septembre 2014
L', logiciel basé sur MATLAB open source, plusTipTracker, peut être utilisé pour analyser une série d'images de fluorescence marqué + conseils pour quantifier la dynamique des microtubules.
L’objectif de cette procédure est d’obtenir des informations quantitatives sur la dynamique des protéines de suivi des microtubules et des pointes et des cônes de croissance vivants à l’aide du progiciel et du suivi des pointes. Nous décrivons ici les étapes d’analyse des images de la dynamique de la GFP EB one et des cônes de croissance XUS lavis cultivés, mais un protocole similaire peut être utilisé pour d’autres types de cellules suite à l’acquisition d’images en direct haute résolution de cônes de croissance embryonnaire EB marqués et cultivés. La première étape de la procédure consiste à utiliser la commande plus tip, à obtenir des pistes pour détecter les comètes GFP EB one, à relier les comètes à des pistes et à déterminer les paramètres de la dynamique des microtubules.
La deuxième étape consiste à utiliser la commande plus les traces de l’astuce C pour visualiser les traces de microtubules superposées aux images des cônes de croissance. La dernière étape consiste à utiliser l’analyse de groupe de pointes plus pour analyser et comparer les paramètres de piste des microtubules de groupes de films. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’utilisation du suivi des mains pour analyser les traces individuelles et les pointes, est qu’elle permet une détection, un suivi, une visualisation et une analyse rapides et automatisés.
La première étape de l’analyse d’images consiste à détecter les comètes GFP EB one, à relier les comètes en pistes et à déterminer les paramètres de la dynamique des microtubules. Ceci est obtenu avec la commande plus tip. Obtenez des traces avant l’analyse de l’image.
Convertissez chaque film time-lapse en une séquence de fichiers d’image TIFF et enregistrez chaque série dans son propre dossier appelé images. Notez que les images sont sensibles à la casse. Pour commencer l’analyse, ouvrez l’application MATLAB et tapez plus tip get tracks dans la fenêtre de commande.
Cela provoquera l’apparition d’une nouvelle boîte de dialogue. Cliquez sur, configurez de nouveaux projets et sélectionnez une ou plusieurs des séries d’images TIFF précédentes en sélectionnant le dossier d’images approprié. Une fois cette étape terminée, un répertoire de fichiers sera créé.
Cliquez sur, d’accord. Une fois la première image affichée, utilisez la souris pour cliquer et créer un polygone. Englobe alors l’intégralité du cône de croissance.
Double-cliquez sur la souris pour fermer le polygone. Une boîte de dialogue apparaîtra si l’image a un autre cône de croissance. Pour analyser, sélectionnez oui.
Sinon, sélectionnez non. L’étape suivante consiste à sélectionner les projets qui seront immédiatement analysés. Cliquez sur sélectionner des projets et sélectionnez le dossier.
Pour analyser une liste, sélectionnez l’écran gluant qui apparaîtra. Sélectionnez les projets sur le côté gauche de l’écran et déplacez-les sur le côté droit. Cliquez sur, d’accord.
Choisissez un emplacement pour enregistrer la liste des projets et cliquez sur enregistrer, sélectionnez détection, suivi et post-traitement. Une fois ces sélections effectuées, le côté droit de la boîte de dialogue deviendra configurable. Remplissez les paramètres de post-traitement.
En fonction des paramètres d’acquisition d’image spécifiques souhaités, cliquez sur démarrer. Le logiciel exécutera ensuite les étapes qui ont été saisies. La fenêtre de commande affiche le temps restant estimé pour chaque fonction et indique quand l’exécution de l’étape est terminée.
Maintenant que les traces microtubiales ont été définies, la fonction plus les traces C est utilisée pour la visualisation des traces et pour afficher les traces microtubulaires superposées aux images des cônes de croissance. Ceci est obtenu avec la commande plus tip C tracks tapez plus tip C tracks dans la fenêtre de commande. Une fois la boîte de dialogue chargée, cliquez sur sélectionner un projet.
Sélectionnez le répertoire parent contenant le projet à visualiser et cliquez sur sélectionner le dossier. Une fois la fenêtre affichée, choisissez le fichier à visualiser et cliquez dessus. D’accord, ensuite, cliquez sur sélectionner le retour sur investissement enregistré, accédez au même dossier de région d’intérêt que celui sélectionné à l’étape précédente et sélectionnez le fichier nommé R-O-I-Y-X.
Cliquez sur sélectionner le répertoire de sortie pour désigner l’endroit où MATLAB enregistrera les fichiers de visualisation de piste, puis sélectionnez Réaliser un film de piste. Un écran apparaîtra affichant toutes les pistes. Astuce Plus : obtenez des pistes calculées à partir des commentaires de l’astuce Plus.
L’étape enregistre la série chronologique de suivi dans un format vidéo. La fonction finale est utilisée pour créer des groupes de films pour l’analyse et la comparaison des paramètres de la piste microtubulaire. Ceci est obtenu avec la commande plus l’analyse de groupe de pointes.
Une fois que le conseil plus, obtenir des pistes a été exécuté pour plusieurs films et différents sous-ensembles de données sont prêts à être comparés. Tapez plus tip group analysis dans la fenêtre de commande Pour sélectionner manuellement les groupes à comparer en premier, désélectionnez le groupe automatique de la hiérarchie. Cliquez ensuite sur sélectionner les projets.
Accédez aux répertoires parents contenant tous les dossiers ROI. Pour analyser une liste, sélectionnez La fenêtre de l’interface graphique apparaîtra. Sélectionnez tous les projets à inclure dans les groupes sur le côté gauche de l’écran et déplacez-les sur le côté droit.
Cliquez sur, d’accord. Choisissez ensuite un emplacement pour enregistrer la liste des projets et cliquez sur enregistrer, une fenêtre apparaîtra. Cliquez sur.
D’accord, et la fenêtre gluante de sélection de liste s’affichera. Encore une fois, sélectionnez uniquement les fichiers qui correspondent au premier groupe qui doit être rassemblé et cliquez dessus. D’accord. Entrez le nom du groupe et cliquez sur, d’accord.
Une fenêtre apparaîtra, répondez en conséquence et continuez à sélectionner des groupes. Choisissez ensuite un emplacement pour enregistrer la liste des groupes et cliquez sur enregistrer. Cliquez sur sélectionner le répertoire de sortie pour choisir l’emplacement de stockage des dossiers de sortie.
Enfin, sélectionnez le type d’analyse de groupe à effectuer. Ici, nous sélectionnons les données du pool dans toutes les cellules et tous les groupes. Cliquez sur comparer les groupes.
Cette image affiche les paramètres de la dynamique microtubiale obtenus à partir de la fonction plus les traces git de pointe. Cette vidéo montre les traces de microtubules obtenues à partir de la fonction plus les traces de la pointe C. Enfin, cette image montre les paramètres des microtubules obtenus à partir de l’analyse de la fonction plus l’analyse du groupe de pointes.
À l’aide d’un tableur. Ces paramètres acquis à partir de différents groupes de films peuvent également être examinés sous forme de boîtes à moustaches à l’aide d’un programme de traitement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser plus tip tracker pour obtenir des informations quantitatives concernant la dynamique des microtubules plus tip et les cônes de croissance vivants en utilisant les fonctions plus tip git tracks plus tip C tracks, et plus tip Group analysis.
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Aperçu
Cet article décrit l'utilisation du logiciel basé sur MATLAB, plusTipTracker, pour analyser la dynamique des microtubules à l'aide de protéines +TIP marquées par fluorescence. La procédure fournit une approche systématique pour quantifier le comportement des protéines de suivi des extrémités plus des microtubules dans les cônes de croissance vivants.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Dynamique des microtubules
Contexte
- Les microtubules jouent un rôle crucial dans la structure et la fonction cellulaires.
- Les protéines +TIP interagissent avec les extrémités en croissance des microtubules.
- L'analyse quantitative de la dynamique des +TIP est essentielle pour comprendre les processus cellulaires.
- Les méthodes existantes de suivi des microtubules peuvent être longues et moins efficaces.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole détaillé pour analyser la dynamique des microtubules à l’aide de plusTipTracker.
- Approfondir la compréhension du comportement des +TIP dans les cellules vivantes.
- Mettre en évidence les avantages du suivi automatisé par rapport aux méthodes manuelles.
Méthodes utilisées
- Utilisation de la commande plusTip pour détecter les comètes EB1-GFP.
- Association des comètes en trajectoires afin de déterminer les paramètres de dynamique des microtubules.
- Visualisation des trajectoires des microtubules à l'aide de la commande plusTip C tracks.
- Analyse groupée des paramètres des trajectoires de microtubules à partir de plusieurs films.
Résultats principaux
- La détection et le suivi automatisés de la dynamique des microtubules ont été réalisés.
- Les techniques de visualisation ont permis d'obtenir des informations claires sur le comportement des microtubules.
- L'analyse par groupes a permis des études comparatives dans différentes conditions.
- La méthode s'est révélée plus rapide et plus efficace que les méthodes de suivi traditionnelles.
Conclusions
- plusTipTracker est un outil précieux pour l'étude de la dynamique des microtubules.
- L'approche automatisée améliore la précision et l'efficacité de l'analyse.
- Ce protocole peut être adapté à divers types cellulaires et conditions.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La quantification de la dynamique des microtubules dans les cônes de croissance neuronales fournit des éclairages mécanistiques sur le guidage axonal et la formation synaptique, des processus pertinents pour les modèles de troubles du neurodéveloppement. L'analyse automatisée des trajectoires des comètes +TIP permet un criblage à haut contenu de composés affectant la régulation du cytosquelette, soutenant la validation de cibles dans les pipelines de découverte en neurosciences. Cette approche réduit les biais analytiques et augmente le débit par rapport au suivi manuel, améliorant ainsi la confiance prédictive dans les études préliminaires d'engagement des cibles.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'étudier la dynamique de polymérisation des microtubules comme indicateur fonctionnel des cibles régulant la croissance ou la stabilité axonale.
- Valeur opérationnelle : Fournit des paramètres quantitatifs normalisés (vitesse de croissance, fréquence des pauses, taux de catastrophe) pour une évaluation cohérente du phénotype des cibles au sein de bibliothèques de composés.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des données reproductibles et multiparamétriques sur le comportement des microtubules, adaptées à la miniaturisation et à l'automatisation des tests dans des formats 96/384 puits.
- Valeur opérationnelle : Facilite la standardisation des tests entre laboratoires en définissant des critères clairs de sélection des régions d'intérêt, des paramètres de suivi et des seuils d'analyse par groupe.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Établit un lien entre les phénotypes dynamiques des microtubules in vitro et les mécanismes pertinents pour les maladies dans les modèles de développement ou de dégénérescence du système nerveux.
- Valeur opérationnelle : Permet une continuité allant des cultures primaires de neurones jusqu'à la validation sur tranches organotypiques ou in vivo, grâce à une méthodologie de suivi des +TIP conservée.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans la phase précoce de la découverte, où des phénotypes cytosquelettiques quantitatifs orientent le choix de la cible avant l'identification du composé leader et les tests d'efficacité préclinique.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses sur des cibles kinases, phosphatases ou protéines associées aux microtubules grâce à la mesure directe de la dynamique des comètes +TIP dans les cônes de croissance vivants.
- Triage : Fournit des résultats normalisés prêts à l'analyse (densité des comètes, longueur des trajectoires, distributions de vitesse) permettant le calcul du facteur Z' et la confirmation des résultats positifs.
- Analyse : Offre des comparaisons statistiques au niveau des groupes (moyenne, variance, décalages de distribution), essentielles pour évaluer les effets des composés sur des réplicats biologiques.
- Recherche translationnelle : Relie les phénotypes cytosquelettiques à des essais de croissance axonale ou de formation de synapses, en cohérence avec des critères fonctionnels précliniques.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place un cadre analytique centralisé basé sur MATLAB, applicable à divers types cellulaires (neurones, fibroblastes, lignées cancéreuses) exprimant des +TIP fluorescents.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la modulation de la cible en réduisant la variabilité inhérente au suivi manuel et en permettant la détection de légers changements dynamiques.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité grâce à la détection automatisée des comètes, à des algorithmes de suivi standardisés et au traitement par lots de séries en enregistrement temporel.
- Valeur stratégique : Renforce l'efficacité des décisions d'orientation (go/no-go) en fournissant plus tôt dans le processus de découverte des profils cytosquelettiques multiparamétriques.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles selon la gravité quantitative des phénotypes microtubulaires et l'ampleur du rétablissement induit par les composés.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en imagerie de cellules vivantes, environnement MATLAB et marquage par protéines fluorescentes (par exemple, EB1-GFP) dans des cultures primaires de neurones.
- Repose sur des systèmes d'acquisition en laps de temps à haute résolution et faible phototoxicité, capables de capturer la dynamique des comètes +TIP à des intervalles de 1 à 2 secondes.
- Implique une standardisation commune entre équipes concernant la définition des régions d’intérêt (périmètre du cône de croissance), des paramètres de suivi (distance de liaison, intervalle entre images) et des filtres de post-traitement.
- Implique des adaptations selon les morphologies cellulaires variables (par exemple, cônes de croissance versus troncs axonaux) et les niveaux d’expression des +TIP selon les modèles utilisés.
- Est limité par la nécessité de comètes +TIP détectables et persistantes ; peut ne pas s’appliquer à des conditions où les événements de polymérisation des microtubules sont très instables ou peu nombreux.
