Name: Utilisation plusTipTracker Software mesurer microtubules Dynamics Xenopus laevis Cônes de croissance (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Apprenez à utiliser plusTipTracker pour analyser la dynamique des microtubules dans les cônes de croissance de Xenopus laevis. Cette méthode automatisée permet une détection et une visualisation rapides des protéines EB1-GFP.

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Nous remercions le Dr Gaudenz Danuser et les membres de son laboratoire pour avoir créé le logiciel plusTipTracker et pour la discussion utile concernant l’utilisation du logiciel, en particulier Maria Bagonis et Sébastien Besson. Nous remercions tout particulièrement le Boston College Media Center pour son aide et son soutien dans la création et le montage de la vidéo. Nous remercions également les membres du Lowery Lab pour les discussions utiles et les critiques constructives, ainsi qu’Abigail Antoine pour la relecture du manuscrit. Ce travail a été financé par une bourse NIH R00 MH095768 à LAL.

Ce protocole et vidéo sont destinés à servir de compagnon à l&#39;article original décrivant le logiciel plus en détail 4, ainsi que le rapport technique qui vient avec le téléchargement de logiciels sur le site Web Danuser Lab. Les lecteurs sont encouragés à examiner attentivement ces documents s&#39;il ya des questions supplémentaires concernant l&#39;utilisation du logiciel. 1 Avant l&#39;analyse d&#39;image <ol><li> Convertir chaque film en time-lapse en une séquence de TIFF (Tagged Image File Format) Les fichiers d&#39;image. S&#39;il ya plusieurs cônes de croissance / cellules dans un film donné, première récolte chaque cône de croissance / cellule pour créer sa propre séquence d&#39;image. Remarque: Ce n&#39;est pas nécessaire, à titre individuel régions-de-intérêt (ROI) peuvent être sélectionnés dans plusTipTracker. Cependant, l&#39;utilisation de plus petites dimensions de l&#39;image augmente la vitesse du traitement de calcul, de sorte que cette étape est recommandée si l&#39;espace blanc significatif dans l&#39;image. </li><li> Enregistrez chaque série TIFF dans son propredossier &quot;images&quot; dans un chemin que MATLAB est réglé sur l&#39;accès (à noter que &quot;images&quot; est sensible à la casse). Pour ajouter un nouveau chemin, accédez au répertoire du fichier concerné dans la fenêtre &quot;Current Folder&quot;, faites un clic droit sur l&#39;icône du répertoire, et sélectionnez &quot;Ajouter à Chemin - Dossiers sélectionnés et sous-dossiers&quot;. Il est important que le dossier du logiciel plusTipTracker être ajoutée à la voie, ainsi. </li></ol> 2. plusTipGetTracks Note: La première étape de l&#39;analyse d&#39;image est de détecter les comètes EB1-GFP, le lien entre les comètes en pistes, et de déterminer les paramètres de la dynamique des microtubules. Ceci est obtenu avec la commande &quot;plusTipGetTracks&quot; 4. <ol><li> Pour commencer l&#39;analyse, l&#39;application de MATLAB ouvert et tapez &quot;plusTipGetTracks&quot; dans la fenêtre de commande. Cela entraînera une nouvelle boîte de dialogue apparaît. </li><li> Cliquez sur &quot;créer de nouveaux projets&quot; et choisir un (ou more) de l&#39;image TIFF série précédente en sélectionnant les &quot;images&quot; appropriées dossier (ou répertoires contenant des &quot;images&quot; dossiers). À l&#39;issue de cette étape, un répertoire de fichiers (roi_1) sera créé (dans le même dossier qui contient des &quot;images&quot;) qui contiendra les futurs fichiers de données. Remarque: l&#39;étape &quot;Installer de nouveaux projets» peut être complété à l&#39;avance, au cours d&#39;une session distincte. </li><li> Une nouvelle fenêtre apparaît: &quot;Sélectionner un polygone, faites un clic droit sur ce dernier point, et cliquez sur« Créer un masque &quot;. Cliquez sur &quot;OK&quot;. La première image de la série d&#39;images sélectionnée sera alors affiché. Utilisez la souris pour cliquer et de créer un polygone qui englobe l&#39;ensemble du cône de croissance. Double-cliquez sur la souris pour fermer le polygone. </li><li> Une fois le polygone a été fermé, une boîte de dialogue apparaît: «Voulez-vous sélectionner un autre retour sur investissement?&quot; Si l&#39;image a un autre cône de croissance à analyser, sélectionnez «Oui»; s autrementélu «Non». </li><li> Sélectionnez les projets qui seront immédiatement analysés. Cliquez sur &quot;Sélectionner projets&quot; et sélectionnez le dossier (roi_X) à analyser. </li><li> Un écran de listSelectGUI apparaît. Sélectionnez le projet (s) sur le côté gauche de l&#39;écran et de les déplacer sur le côté droit de l&#39;écran. Cliquez sur &quot;OK&quot;. Choisissez un emplacement pour enregistrer la liste de projets et cliquez sur &quot;Enregistrer&quot;. </li><li> Sélectionnez &quot;détection&quot;, &quot;Suivi&quot;, et &quot;post-traitement&quot;. Une fois ces sélections ont été effectuées, le côté droit de la boîte de dialogue sera configurable. Configurez chaque option. <ol><li> Ces paramètres sont utilisés pour relier les comètes détectées en pistes de MT. Détails pour le choix de ces paramètres de contrôle pour le suivi sont inclus sur les pages 9-10 du rapport technique PDF qui accompagne le téléchargement du logiciel; lire attentivement ce rapport en cas de problèmes. Aux fins de suivi des comètes EB1-GFP dans Xenopnous laevis cônes de croissance, utilisez les paramètres de suivi suivantes: un rayon de recherche Range (pixels) 5-12, la longueur minimale Sous-Track (frames) 3; Max Gap Longueur (cadres) 8; Max Factor retrait de 0,8, angle maximum avant 50, angle arrière Max 10, Fluctuation Rayon 2,5. Ces paramètres sont représentés sur la figure 1. </li></ol> Remarque: Facteur de retrait maximum est fixé à réduire le nombre de «lacunes détectées en retard», comme des «lacunes en arrière&quot; ne sont pas utiles à analyser dans le cadre de cônes de croissance, compte tenu des conditions de surpeuplement et des erreurs probables dans les liens de la piste. En outre, les deux angle Max Forward, ainsi que la fluctuation rayon sont définis relativement élevé, comme MT cône de croissance présentent de petites translocations fréquentes dans plus de croissances et des retraits, et l&#39;augmentation de ces paramètres de contrôle permet à ce mouvement augmenté au cours de l&#39;étape de liaison. <ol><li> Remplissez les paramètres de post-traitement en fonction des paramètres d&#39;acquisition d&#39;image spécifiques souhaitées. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Une fois que les paramètres ont été configurés, cliquez sur &quot;Démarrer&quot;. Le logiciel fonctionne selon les paramètres ont été sélectionnés. Cela peut prendre quelques minutes à quelques heures, en fonction du nombre de projets sélectionnés et de leurs tailles. La fenêtre de commande affiche le temps restant estimé pour chaque fonction. Lorsque l&#39;étape de plusTipGetTracks est terminée, la fenêtre de commande affiche &quot;Terminé!&quot; Remarque: Une longue liste de paramètres spécifiques de la dynamique MT ont été calculés par ce logiciel (voir référence 4 pour plus de détails), mais pour l&#39;analyse de la dynamique MT dans les cônes de croissance, les paramètres les plus utiles à examiner sont MT vitesse de voie de la croissance (en microns / minute), la voie de la croissance de vie (en secondes), et la longueur de la piste de croissance (en microns). </li></ol> 3. plusTipSeeTracks Note: Maintenant que les pistes de microtubules ont été définis, la fonction &quot;plustipSeeTracks» est utilisé pour la piste visualisation 4. Cette fonctionpeuvent fournir des multiples sorties pour la visualisation, y compris la dynamique de MT spatiales des cartes et des films de vitesse, mais ici, l&#39;accent est mis uniquement sur l&#39;utilisation «Track Films&quot; pour afficher les pistes MT superposées sur les images de cône de croissance. Alors que plusTipGetTracks peuvent analyser plusieurs films à la fois, plusTipSeeTracks ne peuvent analyser un film à la fois. <ol><li> Tapez &quot;plusTipSeeTracks&quot; dans la fenêtre de commande. </li><li> Après le chargement de la boîte de dialogue, cliquez sur &quot;Select Project&quot;. Sélectionnez le répertoire parent contenant le projet de visualiser et cliquez sur &quot;Sélectionner un dossier&quot;. Une nouvelle fenêtre apparaît: &quot;Sélectionnez le projet que vous souhaitez visualiser&quot;. Choisissez le fichier à visualiser et cliquez sur &quot;OK&quot;. </li><li> Ensuite, cliquez sur &quot;Select Saved ROI&quot;. Naviguez dans le même dossier roi_X que celle sélectionnée à l&#39;étape précédente et sélectionnez le fichier nommé &quot;roiYX&quot;. </li><li> Cliquez sur &quot;Sélectionner le répertoire de sortie&quot; pour désigner wici MATLAB enregistrer les fichiers de visualisation de la piste. Note: Nous vous recommandons d&#39;utiliser le même dossier qui contient le reste des données. </li><li> Sélectionnez &quot;Faire piste Movie&quot; et un écran apparaît affichant toutes les pistes plusTipGetTracks calculées à partir des comètes TIP +. Cette étape permet d&#39;économiser la série de temps suivis dans un format film, dans le fichier &quot;allTracks_X_X_X&quot;. Il ya une option pour enregistrer le film au format AVI, sinon le format par défaut est le fichier Quicktime.mov. </li></ol> 4. plusTipGroupAnalysis Remarque: Cette fonction finale est utilisée pour créer des groupes de films pour l&#39;analyse et la comparaison de leurs paramètres de piste de MT. <ol><li> Tapez &quot;plusTipGroupAnalysis&quot; dans la fenêtre de commande. Pour sélectionner manuellement les groupes à comparer, d&#39;abord de-sélectionner &quot;groupe Auto de la hiérarchie&quot;. Ensuite, cliquez sur &quot;Sélectionner des projets&quot;. Accédez aux répertoires parents contenant tous les dossiers roi_Xà analyser. </li><li> Un écran de listSelectGUI apparaît. Sélectionnez tous les projets à inclure dans les groupes à partir du côté gauche de l&#39;écran et de les déplacer sur le côté droit de l&#39;écran. Cliquez sur &quot;OK&quot;. Choisissez un emplacement pour enregistrer la liste de projets et cliquez sur &quot;Enregistrer&quot;. </li><li> Une fenêtre s&#39;affiche: &quot;S&#39;il vous plaît sélectionner premier groupe de la liste&quot;. Cliquez sur &quot;OK&quot;. La fenêtre listSelectGUI s&#39;affiche à nouveau. Cette fois-ci, sélectionner uniquement les fichiers qui correspondent au premier groupe qui devrait être mis en commun. Cliquez sur &quot;OK&quot;. </li><li> Ensuite, entrez le nom du groupe, puis cliquez sur &quot;OK&quot;. Une fenêtre s&#39;affiche: &quot;Choisissez un autre groupe?&quot; Réponse en conséquence et continuer à sélectionner des groupes. Une fenêtre s&#39;affiche: &quot;Choisissez un emplacement pour enregistrer votre liste de groupe&quot;. Accédez à l&#39;emplacement et cliquez sur &quot;Enregistrer&quot;. </li><li> Cliquez sur &quot;Sélectionner le répertoire de sortie&quot; pour choisir l&#39;endroit où les dossiers de sortie serontstocké. </li><li> Sélectionnez le type de l&#39;analyse du groupe de mener - si les pistes de MT devraient être mises en commun pour chaque groupe ou par l&#39;analyse cellulaire doit être effectuée. Les tests statistiques recommandées sont déjà désignés. Pour inclure toutes les pistes dans l&#39;analyse, dé-sélectionnez «Supprimer les pistes au début / fin de film&quot;. Sinon, ayant cette case sélectionnée supprime toutes les pistes de croissance de MT qui sont en processus que le film commence ou se termine. </li><li> Après la sélection Groupe d&#39;analyse est faite, sélectionnez «Comparer les groupes&quot;. </li></ol>

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<li>Schuyler, S. C., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+%27plus-end-tracking+proteins%27%3A+The+end+is+just+the+beginning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning.</a> Cell. 105, 421-424 (2001).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubule+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li>
<li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).</li>
<li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+plus-end+tracking+by+CLIP-170+requires+EB1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EB1+promotes+microtubule+dynamics+by+recruiting+Sentin+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells.</a> The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).</li>
<li>Maurer, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EB1+accelerates+two+conformational+transitions+important+for+microtubule+maturation+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics.</a> Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).</li>
<li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).</li>
<li>Lowery, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+development%22%5BJournal%5D)">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22(2013).</li>
<li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+%28XCLASP1%29+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

PlusTipTracker fournit une interface utilisateur simple, graphique pour détecter rapidement et automatiquement la quasi-totalité visibles comètes EB1-GFP dans un cône de croissance cellulaire ou, le lien entre les comètes en pistes, et calculer les paramètres MT. Autres publications ont rapporté la conception de types de logiciels similaires (par exemple, Marx et al. Analyse quantitative a également utilisé des dynamiques EB1 marqués dans les cônes de croissance 18). Mais, ce logiciel semble être uni...

Le but de cette méthode est d&#39;obtenir des informations quantitatives sur les microtubules (MT) plus fin de suivi dynamique dans la vie des cônes de croissance protéines (+ TIP). MT + TIP sont un groupe de protéines qui localisent les plus-extrémités de MT 9,10. Ils effectuent une vaste gamme de fonctions pour régler les paramètres de MT instabilité dynamique 11, y compris les taux de polymérisation, catastrophe, et de sauvetage. Une méthode très utilisée pour l&#39;analyse de la dynamique de la MT est de suivre le comportement du TIP EB1 +, qui se lie spécifiquement à la croissance de MT plus-ends 1,12. EB1 est connu pour recruter plusieurs autres protéines à la croissance de MT plus-ends 13,14, et a récemment été mis en place comme un facteur de maturation MT 15, la promotion de la croissance MT et la fréquence des catastrophes 15,16. De nombreuses études de la dynamique MT dans les cônes de croissance ont utilisé des méthodes de suivi de la main pour mesurer les changements dans la dynamique EB1-GFP au fil du temps 1-3, comme EB1 localizatià MT ainsi que les fins peuvent être utilisés en tant que marqueur pour la polymérisation MT. Un avantage clé de l&#39;examen de comètes EB1-GFP comme une approximation de la croissance MT est que la dynamique MT peuvent être mesurés même dans les régions de chevauchement significatif de MT. Bien que la méthode des comètes EB1-GFP suivi à la main a fourni des indications utiles sur les comportements MT 1-3, il est temps et peut être biaisée. En outre, la croissance aberrante comportements coniques sont probablement le résultat de changements minute à la dynamique du cytosquelette, en analysant seulement un petit sous-ensemble de MT (généralement nécessaire lorsque la main-tracking) peut manquer des informations importantes. Ainsi, nous mesurons la dynamique de MT mondiaux paramètres à l&#39;aide du logiciel, plusTipTracker 4, après l&#39;acquisition de haute résolution, les images en direct de EB1 marqué dans les cônes de croissance embryonnaires cultivées 5. Ce logiciel, développé dans le Danuser Lab, a été utilisé dans plusieurs études qui caractérisent la dynamique MT dans divers types de cellules 6-8. Il s&#39;agit d&#39;un open-source, nouser-amical, emballage à base de MATLAB qui inclut la détection automatique, le suivi, la visualisation et l&#39;analyse des films de + TIP marquées par fluorescence. Une longue liste de paramètres spécifiques de la dynamique MT sont calculées par ce logiciel (voir référence 4 pour plus de détails), mais pour l&#39;analyse de la dynamique MT dans les cônes de croissance, les paramètres les plus utiles sont MT vitesse de voie de la croissance (en microns / minute), chemin de la croissance durée de vie (en secondes), et la longueur de la piste de croissance (en microns). Le logiciel peut être téléchargé directement depuis le site Danuser Lab (sous «Logiciel»). Alors que le Danuser Lab prend actuellement en charge une interface nouvelle pour + analyse de suivi de TIP, qui est intégré dans un logiciel appelé u-piste 2.0, le logiciel d&#39;origine, autonome restera disponible. Les algorithmes sous-jacents entre les deux programmes sont les mêmes (au moins à partir de 2014), avec seulement une différence de l&#39;interface et d&#39;analyse des sorties. Pour l&#39;utilisateur novice avec peu de MATLAB et / ou l&#39;analyse computationnelle expérence, plusTipTracker a plus de fonctionnalités conviviales, y compris les sorties de paramètres statistiques automatisés. Ici, nous décrivons les étapes d&#39;analyse d&#39;images de la dynamique EB1-GFP en culture de Xenopus cônes de croissance laevis. Ce protocole a été utilisé dans une étude récente examinant la dynamique MT 17. Voir aussi Lowery et al. 2012 5 pour obtenir des instructions détaillées sur les cônes de croissance de la culture exprimant EB1-GFP. Bien que ce papier essentiellement porté sur l&#39;examen dynamique EB1-GFP dans les cônes de croissance, le même protocole peut être utilisé pour d&#39;autres types de cellules 17. Pour tous les types de cellules, l&#39;intervalle de temps entre les images doit être comprise entre 0,5-2 sec pour optimiser le suivi + TIP. Un intervalle d&#39;au plus 4 secondes de temps entre les images est possible, mais cette augmentation des résultats en temps d&#39;intervalle dans les erreurs de suivi supplémentaires.

<table><tbody><tr><td>plusTipTracker software</td><td>Danuser Lab</td><td><a href="http://lccb.hms.harvard.edu/software.html">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</a></td><td>Ce logiciel pourrait être hébergé par un autre site web à l’avenir.&nbsp ; Si le site répertorié n’existe pas, recherchez « Danuser Lab Software » sur un moteur de recherche Web pour trouver le site.</td></tr><tr><td>Logiciel MATLAB</td><td>Mathworks</td><td><a href="http://www.mathworks.com/products/matlab/">http://www.mathworks.com/products/matlab/</a></td><td></td></tr></tbody></table>

utilisation plustiptracker software mesurer microtubules dynamics xenopus laevis cônes de croissance

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubules (MT) plus-fin-suivi protéines (+ TIP) se localisent à la plus-extrémités croissantes de MT et régulent la dynamique MT 1,2. Un des conseils les plus connus et largement utilisés-+ pour analyser la dynamique de MT est la Fin-binding protein, EB1, qui lie tous les MT ainsi que les fins de croissance, et donc, c&#39;est un marqueur de MT polymérisation 1. De nombreuses études sur le comportement des EB1 dans les cônes de croissance ont utilisé beaucoup de temps et, les méthodes de suivi de la main assistée par ordinateur biaisées pour analyser individu MT 1-3. Notre approche consiste à quantifier les paramètres globaux de la dynamique MT en utilisant le logiciel, plusTipTracker 4, suite à l&#39;acquisition de haute résolution, les images en direct de EB1 marqué dans les cônes de croissance embryonnaires cultivées 5. Ce logiciel est un open-source package convivial basé sur MATLAB, qui allie la détection automatique, le suivi, la visualisation et l&#39;analyse des films de + TIP marquées par fluorescence. Ici, nous présentons le protocole d&#39;utilisation plusTipTRâtelier pour l&#39;analyse des comètes marquées par fluorescence TIP + en culture de Xenopus cônes de croissance laevis. Toutefois, ce logiciel peut également être utilisée pour caractériser la dynamique de MT dans divers types de cellules 8.6.

Grâce à ce logiciel, comme décrit ici fournira plusieurs fichiers d'informations qui permettent de quantifier la dynamique + TIP dans les cellules vivantes. La fonction plusTipGetTracks identifie les pistes (en utilisant par exemple les paramètres présentés dans la figure 1), puis fournit des paramètres concernant les pistes TIP +. Pour afficher les informations que le logiciel a obtenu, allez dans le répertoire roi_X qui a été créé à l'étape 2.2. Le dossier "feat" contient ...

L&#39;, logiciel basé sur MATLAB open source, plusTipTracker, peut être utilisé pour analyser une série d&#39;images de fluorescence marqué + conseils pour quantifier la dynamique des microtubules.

Utilisation plusTipTracker Software mesurer microtubules Dynamics Xenopus laevis Cônes de croissance

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

L’objectif de cette procédure est d’obtenir des informations quantitatives sur la dynamique des protéines de suivi des microtubules et des pointes et des cônes de croissance vivants à l’aide du progiciel et du suivi des pointes. Nous décrivons ici les étapes d’analyse des images de la dynamique de la GFP EB one et des cônes de croissance XUS lavis cultivés, mais un protocole similaire peut être utilisé pour d’autres types de cellules suite à l’acquisition d’images en direct haute résolution de cônes de croissance embryonnaire EB marqués et cultivés. La première étape de la procédure consiste à utiliser la commande plus tip, à obtenir des pistes pour détecter les comètes GFP EB one, à relier les comètes à des pistes et à déterminer les paramètres de la dynamique des microtubules.La deuxième étape consiste à utiliser la commande plus les traces de l’astuce C pour visualiser les traces de microtubules superposées aux images des cônes de croissance. La dernière étape consiste à utiliser l’analyse de groupe de pointes plus pour analyser et comparer les paramètres de piste des microtubules de groupes de films. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’utilisation du suivi des mains pour analyser les traces individuelles et les pointes, est qu’elle permet une détection, un suivi, une visualisation et une analyse rapides et automatisés.La première étape de l’analyse d’images consiste à détecter les comètes GFP EB one, à relier les comètes en pistes et à déterminer les paramètres de la dynamique des microtubules. Ceci est obtenu avec la commande plus tip. Obtenez des traces avant l’analyse de l’image.Convertissez chaque film time-lapse en une séquence de fichiers d’image TIFF et enregistrez chaque série dans son propre dossier appelé images. Notez que les images sont sensibles à la casse. Pour commencer l’analyse, ouvrez l’application MATLAB et tapez plus tip get tracks dans la fenêtre de commande.Cela provoquera l’apparition d’une nouvelle boîte de dialogue. Cliquez sur, configurez de nouveaux projets et sélectionnez une ou plusieurs des séries d’images TIFF précédentes en sélectionnant le dossier d’images approprié. Une fois cette étape terminée, un répertoire de fichiers sera créé.Cliquez sur, d’accord. Une fois la première image affichée, utilisez la souris pour cliquer et créer un polygone. Englobe alors l’intégralité du cône de croissance.Double-cliquez sur la souris pour fermer le polygone. Une boîte de dialogue apparaîtra si l’image a un autre cône de croissance. Pour analyser, sélectionnez oui.Sinon, sélectionnez non. L’étape suivante consiste à sélectionner les projets qui seront immédiatement analysés. Cliquez sur sélectionner des projets et sélectionnez le dossier.Pour analyser une liste, sélectionnez l’écran gluant qui apparaîtra. Sélectionnez les projets sur le côté gauche de l’écran et déplacez-les sur le côté droit. Cliquez sur, d’accord.Choisissez un emplacement pour enregistrer la liste des projets et cliquez sur enregistrer, sélectionnez détection, suivi et post-traitement. Une fois ces sélections effectuées, le côté droit de la boîte de dialogue deviendra configurable. Remplissez les paramètres de post-traitement.En fonction des paramètres d’acquisition d’image spécifiques souhaités, cliquez sur démarrer. Le logiciel exécutera ensuite les étapes qui ont été saisies. La fenêtre de commande affiche le temps restant estimé pour chaque fonction et indique quand l’exécution de l’étape est terminée.Maintenant que les traces microtubiales ont été définies, la fonction plus les traces C est utilisée pour la visualisation des traces et pour afficher les traces microtubulaires superposées aux images des cônes de croissance. Ceci est obtenu avec la commande plus tip C tracks tapez plus tip C tracks dans la fenêtre de commande. Une fois la boîte de dialogue chargée, cliquez sur sélectionner un projet.Sélectionnez le répertoire parent contenant le projet à visualiser et cliquez sur sélectionner le dossier. Une fois la fenêtre affichée, choisissez le fichier à visualiser et cliquez dessus. D’accord, ensuite, cliquez sur sélectionner le retour sur investissement enregistré, accédez au même dossier de région d’intérêt que celui sélectionné à l’étape précédente et sélectionnez le fichier nommé R-O-I-Y-X.Cliquez sur sélectionner le répertoire de sortie pour désigner l’endroit où MATLAB enregistrera les fichiers de visualisation de piste, puis sélectionnez Réaliser un film de piste. Un écran apparaîtra affichant toutes les pistes. Astuce Plus : obtenez des pistes calculées à partir des commentaires de l’astuce Plus.L’étape enregistre la série chronologique de suivi dans un format vidéo. La fonction finale est utilisée pour créer des groupes de films pour l’analyse et la comparaison des paramètres de la piste microtubulaire. Ceci est obtenu avec la commande plus l’analyse de groupe de pointes.Une fois que le conseil plus, obtenir des pistes a été exécuté pour plusieurs films et différents sous-ensembles de données sont prêts à être comparés. Tapez plus tip group analysis dans la fenêtre de commande Pour sélectionner manuellement les groupes à comparer en premier, désélectionnez le groupe automatique de la hiérarchie. Cliquez ensuite sur sélectionner les projets.Accédez aux répertoires parents contenant tous les dossiers ROI. Pour analyser une liste, sélectionnez La fenêtre de l’interface graphique apparaîtra. Sélectionnez tous les projets à inclure dans les groupes sur le côté gauche de l’écran et déplacez-les sur le côté droit.Cliquez sur, d’accord. Choisissez ensuite un emplacement pour enregistrer la liste des projets et cliquez sur enregistrer, une fenêtre apparaîtra. Cliquez sur.D’accord, et la fenêtre gluante de sélection de liste s’affichera. Encore une fois, sélectionnez uniquement les fichiers qui correspondent au premier groupe qui doit être rassemblé et cliquez dessus. D’accord. Entrez le nom du groupe et cliquez sur, d’accord.Une fenêtre apparaîtra, répondez en conséquence et continuez à sélectionner des groupes. Choisissez ensuite un emplacement pour enregistrer la liste des groupes et cliquez sur enregistrer. Cliquez sur sélectionner le répertoire de sortie pour choisir l’emplacement de stockage des dossiers de sortie.Enfin, sélectionnez le type d’analyse de groupe à effectuer. Ici, nous sélectionnons les données du pool dans toutes les cellules et tous les groupes. Cliquez sur comparer les groupes.Cette image affiche les paramètres de la dynamique microtubiale obtenus à partir de la fonction plus les traces git de pointe. Cette vidéo montre les traces de microtubules obtenues à partir de la fonction plus les traces de la pointe C. Enfin, cette image montre les paramètres des microtubules obtenus à partir de l’analyse de la fonction plus l’analyse du groupe de pointes.À l’aide d’un tableur. Ces paramètres acquis à partir de différents groupes de films peuvent également être examinés sous forme de boîtes à moustaches à l’aide d’un programme de traitement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser plus tip tracker pour obtenir des informations quantitatives concernant la dynamique des microtubules plus tip et les cônes de croissance vivants en utilisant les fonctions plus tip git tracks plus tip C tracks, et plus tip Group analysis.

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