Name: Sous-clonage plus insertion (SPI) - Un Recombineering nouveau procédé pour la construction rapide de ciblage de gène Vecteurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Découvrez la méthode de sous-clonage plus insertion pour construire rapidement des vecteurs de ciblage génique dans E. coli. Cette technique améliore l'efficacité du recombining pour la génération de modèles transgéniques.

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T.R.R a conçu le projet, conçu et réalisé des expériences et préparé le manuscrit. E.J.K et S.E.M ont réalisé des expériences. Tous les auteurs ont contribué intellectuellement au manuscrit final. Ce travail a été financé par une bourse d’innovation de l’Université de Leicester à SEM et par une bourse de recherche senior du Conseil de la recherche médicale (MRC) du Royaume-Uni à S.M.C (MR/J009202/1). Le séquençage de l’ADN a été effectué par les Laboratoires des protéines et des acides nucléiques (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, Université de Leicester. Nous tenons à remercier A. Francis Stewart d’avoir fourni les plasmides Rox et Dre. Les plasmides pL451 et pL452 ont été obtenus auprès du National Cancer Institute (NCI), à Frederick, aux États-Unis.

1. Gene Targeting Conception <ol style="margin-left: 40px;"><li> Commander un clone BAC appropriée couvrant la région génomique d&#39;intérêt. Assurez-vous que ce est isogène du type de cellules ES être modifié par exemple, des clones RPCI-23 et RPCI-24 BAC pour le ciblage de gènes avec C57BL / 6 cellules ES. </li><li> Appliquer les critères de ciblage génique classique lors de la conception du vecteur de ciblage. Les paramètres clés comprennent si la modification est nécessaire pour être constitutive ou conditionnelle, définissant exons critiques (CE) pour la suppression dans une stratégie de gène KO et l&#39;espacement et l&#39;emplacement des cassettes introniques. NOTE: Chacun de ces a été discuté en détail par ailleurs 10. </li><li> Choisir chacune des régions génomiques 5-6 kb flanquant le site de modification cible. NOTE: La taille de l&#39;insert sous-cloné est donc typiquement 10-12 kb, bien que la limite supérieure peut être aussi élevée que 80 kb avec un faible nombre de copies sous-clonage plasmide comme p15A, pBR322, etc., et jusqu&#39;à 200 kb avec un taux d&#39;alcoolémievecteur. </li></ol> 2. Multiplex Recombineering Oligos <ol style="margin-left: 40px;"><li> oligos de conception pour le squelette plasmidique (sous-clonage de plasmide) et le marqueur de sélection (cassette d&#39;insertion). Concevoir chaque oligo telle qu &#39;elle contient 180 pb flanquant le HA de site cible génomique et 20 pb de la séquence d&#39;amorçage spécifique de la cassette d&#39;insertion ou de sous-clonage du plasmide (Figure 2). REMARQUE: bras homologie ne doivent pas contenir d&#39;éléments répétitifs, la présence d&#39;éléments répétitifs se traduira par ciblage incorrect et sous-clonage. Éléments répétitifs peuvent être détectés en utilisant des outils basés sur le Web tels que le &#39;&#39; Répéter Masker &#39;&#39;. </li><li> Inclure un site unique d&#39;enzyme de restriction (RE) sur l&#39;un des oligos de vecteur pour linéariser le vecteur de ciblage de gène de cellules ES ciblé (figure 2). </li><li> Contrôler les paramètres de oligo aide d&#39;un programme oligo de l&#39;analyseur. Prenez soin d&#39;éviter des structures secondaires dans la région d&#39;amorçages. </li><li> Shorter HA (50 pb) de la cassette d&#39;insertion est tolérée et donne plus faible nombre de recombinants mais faire en sorte que le sous-clonage du plasmide HA est toujours plus long (180 pb). </li><li> Déterminer l&#39;orientation de l&#39;insert d&#39;ADN génomique du clone BAC notamment en utilisant des outils basés sur le Web tels que &#39;&#39; cloneDB &#39;&#39;. Établir la direction de réplication à partir de Oris en cochant la carte du plasmide squelette BAC utilisé dans la construction de la bibliothèque BAC. REMARQUE: ORIS est généralement opposée à la direction de transcription du marqueur Chloramphenicol (Chl) pour tous les plasmides BAC couramment utilisés. </li><li> Ajouter deux phosphorothioate (PTO) liaisons terminales à l&#39;extrémité 5 &#39;de l&#39;oligonucléotide qui est opposée à la direction de réplication sur le clone BAC. Ajouter une modification phosphate en 5 &#39;de l&#39;oligo inverse (figure 2). NOTE: La cassette PCR phosphorothioate asymétrique en digestion Rouge génère un ADN simple brin intermédiaire qui peut amorcer le brin retardéde la fourche de réplication. REMARQUE: Maximal multiplex fréquence de recombinaison est observée avec les brin retardé cassettes protégées. Brin précoce protégée ou cassettes double protégées peut ne pas produire l&#39;efficacité de recombinaison équivalents à une loci. </li><li> Commandez oligos avec PAGE ou la purification HPLC. </li></ol> 3. BAC Clone transformation avec pSC101 BADgbaA Recombineering plasmide. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Pour rendre le E. souche de E. coli portant le recombineering BAC compétents, transformée avec le plasmide pSC101 BADgbaA contenant les gènes rouges 16. NOTE: Le plasmide pSC101 BADgbaA contient les Rouge et RecA gènes sous le contrôle de la Arabinose inductible araC-P BAD promoteur, un marqueur de sélection de la tétracycline et la température sensibles pSC101 réplicon. <ol><li> Poignarder une pointe de pipette stérile dans la culture d&#39;agar BAC et inoculer 5,0 ml de bouillon de lysogénie (LB) pH 8,0 contenant 12,556; g ml -1 Chl. Croître à 37 ° C pendant 5 heures sous agitation à 200 rpm. </li><li> Réfrigérer 10% (v / v) solution de glycérol, microtubes et cuvettes d&#39;électroporation sur la glace. Refroidir une grande centrifugeuse réfrigérée et microcentrifugeuse à 4 ° C. </li><li> Déterminer la densité optique (DO) de la culture en utilisant un spectrophotomètre et mesurer l&#39;absorbance à 600 nm. Préparer des cellules électrocompétentes (comme décrit ci-dessous) quand une DO 600 de lecture de 0,3 à 0,8 est atteint. </li><li> Centrifuger les cellules dans un tube de centrifugation de 50 ml dans une centrifugeuse à grande 1216 xg pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Laver les cellules avec 1 ml de réfrigérés 10% de glycérol et centrifuger les cellules à 17 949 g pendant 20 secondes à 4 ° C. Effectuer l&#39;étape de lavage un total de 3 fois. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans un volume total de 50 ul de glycerol à 10% et ajouter de 10 à 200 ng du plasmide pSC101 recombineering BADgbaA. Obtenir une suspension cellulaire unique par pipetagede haut en bas plusieurs fois et ensuite transférer les cellules à un pré-réfrigérés 1 mm écart cuvette d&#39;électroporation. </li><li> Électroporation des cellules avec un réglage de 1,8 kv, 25 pF et 200 Ω. REMARQUE: Vérifiez les paramètres corrects pour chaque marque de électroporateur. Une constante de temps de l&#39;électroporation moins de 4 indique la présence de sel et d&#39;autres impuretés. </li><li> Récupérer immédiatement les cellules dans 1 ml de LB et transférer les cellules dans un tube de centrifugation de 50 ml. </li><li> Cultiver la culture BAC gbaa à 30 ° C pendant 2 heures sous agitation à 200 rpm. NOTE: Le plasmide pSC101 BADgbaA est perdue lorsque les cellules sont cultivées à 37 ° C en raison de l&#39;inactivation du facteur de réplication sensible à la température de repe. Cultiver les cellules gbaa à 30 ° C afin de maintenir les fonctions de recombineering. </li><li> Ajouter 9 ml de LB contenant 12,5 pg ml -1 Chl et 4 pg ml -1 tétracycline (Tet) à la culture de BAC gbaa récupéré. Cultivez laBAC gbaa culture O / N à 30 &#160; ° C sous agitation à 200 rpm. NOTE: L&#39;efficacité de transformation de l&#39;électroporation gbaa plasmidique surenroulé est suffisamment élevée pour permettre la croissance de saturation O / N dans des milieux liquides. </li></ol></li></ol> 4. Préparation d&#39;insertion Cassettes et Sous-clonage plasmides <ol style="margin-left: 40px;"><li> Pour incorporer HA dans la cassette (s) d&#39;insertion et le plasmide de sous-clonage, effectuer la réaction en chaîne par polymerase (PCR) en utilisant les oligos modifiés de temps comme décrit ci-dessous. <ol><li> Facultatif: Pour éviter plasmide report dans la réaction de recombineering, utilisez une origine R6K ou un modèle étroite gamme d&#39;hôtes de plasmide similaire pour amplifier la cassette d&#39;insertion. </li><li> Alternativement, linéariser le modèle de plasmide en utilisant une digestion RE (tableau 2). Choisir un RE qui coupe à l&#39;extérieur de la région d&#39;amplification par PCR et est inactivé à la chaleur. Chaleur inactiver les RE tel que recommandé par le fabracturer. </li><li> Mettre en place la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) en utilisant un système d&#39;ADN hotstart polymerase haute fidélité. Préparer un mélange maître PCR comme détaillé (tableau 3). Effectuer cyclage thermique comme indiqué (tableau 3). </li></ol></li><li> Analyser les produits de PCR par électrophorèse sur gel d&#39;agarose. Charge 1-5 pi de chaque PCR sur un 1% (p / v) contenant du gel d&#39;agarose à 0,5 mg ml-1 de bromure d&#39;éthidium (EtBr). REMARQUE: La présence de produits d&#39;amplification non spécifiques ne interfère pas dans la réaction de recombineering. Dans certains cas cependant, des dimères d&#39;amorces peuvent diminuer l&#39;efficacité de recombineering. </li><li> Purifier les produits de PCR en utilisant un kit de purification PCR. <ol><li> En option: supprimer le modèle de plasmide de PCR par traitement avec Dpnl suivie par PCR clean-up. ADN Elute dans un volume minimal d&#39;eau déminéralisée stérile (tel que recommandé par le fabricant). REMARQUE: Ajout de Dpnl au PCR non purifié réactions des résultats en réduction de l&#39;efficacité du clivage de ee matrice d&#39;ADN plasmidique méthylé. </li></ol></li><li> Quantifier PCR ADN amplifié par analyse de gel d&#39;agarose contre un ensemble connu de normes d&#39;ADN par exemple, λ HindIII digest ou en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop. </li></ol> 5. Sous-clonage plus insertion <ol style="margin-left: 40px;"><li> Diluer le O / N BAC gbaa culture 50 fois en ajoutant 200 ul dans 10 ml de LB + Chl + Tet. Croître à 30 &#160; ° C sous agitation à 200 tours par minute pendant 1 h 50 min. Inclure un échantillon à être utilisé comme contrôle négatif. </li><li> Réfrigérer tous les matériaux et équipements recombineering à 4 ° C comme décrit dans l&#39;étape 3.1.2. </li><li> Verser LB agar pH 8 plaques contenant la concentration appropriée de l&#39;antibiotique sélectif approprié (s) qui va permettre la sélection du fragment d&#39;ADN qui est insérée ainsi que pour la sélection du vecteur de sous-clonage (tableau 4). NOTE: Certains antibiotiques sont sensibles au pH. Utiliser LBagar pH 8 en règle. </li><li> Préparer un 10% (p / v) de solution de L-arabinose. Stériliser par filtration à travers un filtre à seringue de 0,2 um. REMARQUE: arabinose induit l&#39;expression des protéines à partir du plasmide recombineering gbaa. </li><li> Vérifiez la DO de la culture BAC gbaa aide d&#39;un spectrophotomètre. Une fois une DO 600 de 0,25 à 0,3 est atteint, induire les protéines de recombineering comme décrit dans l&#39;étape suivante. </li><li> Ajouter 200 ul de la solution de 10% arabinose à 10 ml de la culture d&#39;alcoolémie pour atteindre une concentration finale de 0,2% de l&#39;arabinose. Inclure une culture non induite (sans Arabinose) pour être utilisé comme contrôle négatif. </li><li> Transférer la culture de BAC à un 37 &#160; ° C incubateur agitateur et induire l&#39;expression Rouge pendant 45 min en agitant à 230 rpm. NOTE: L&#39;expression de protéines Red est inefficace à 30 ° C. </li><li> Isoler les cellules et laver avec 10% de glycérol 3 fois comme décrit à l&#39;étape 3.1.5. </li><li> Ajouter 600-1,000 ng de chacun du plasmide et de sous-clonage de la cassette (s) d&#39;insertion à la réaction de recombineering. Inclure un seul vecteur et le vecteur ainsi que les contrôles d&#39;insertion unique de vérifier la compétence et l&#39;intégrité de recombinaison du vecteur et les cassettes. </li><li> Obtenir une suspension de cellules isolées par pipetage de haut en bas. Effectuer électroporation comme décrit dans l&#39;étape 3.1.7 et reprise ultérieure de 1 ml LB à 37 ° C pendant 1 heure pour les plasmides à copies multiples ou dans 10 ml de LB à 37 ° C pendant 3 heures pour les vecteurs BAC. </li><li> Plate différentes dilutions de la culture récupéré par exemple, 90%, 10%, 1% sur des plaques de gélose au double sélection et de croître à 37 &#160; ° C pendant 16 heures. </li></ol> 6. Analyse des recombinants <ol style="margin-left: 40px;"><li> Facultatif: Choisissez 6-12 colonies et effectuer colonie PCR en utilisant une amorce flanquant HA et une amorce spécifique d&#39;insertion. Inclure le plasmide de sous-clonage et la SAE d&#39;insertionsette plasmide ainsi que le clone BAC parent comme témoins négatifs. <ol><li> Effectuer une analyse de gel d&#39;agarose des PCR de colonie. Identifier des clones positifs par la présence d&#39;une bande brillante à la taille attendue. NOTE: Le rendement élevé du processus de clonage SPI génère recombinants essentiellement correctes. </li></ol></li><li> Prélever des colonies dans 5 ml LB pH 8 contenant l&#39;antibiotique sélectif et développer O / N à 37 ° C. </li><li> Préparer minipreps ADN en utilisant un kit de purification sur colonne selon les instructions du fabricant. </li><li> Préparer BAC ADN miniprep en utilisant l&#39;isolement phénol-chloroforme standard ou un protocole similaire. </li><li> Effectuer digère RE sur l&#39;ADN miniprep. ADN séparés par électrophorèse sur gel d&#39;agarose. Analyser les modèles de RE pour identifier les clones contenant les fragments tailles attendues du vecteur de ciblage correct. Choisissez une RE qui discrimine clairement entre le vecteur dépourvu insert (s) et le vecteur contenant l&#39;insert (s). </li><li> Optional: pour obtenir des cellules qui sont dépourvues de la BAC, qui est toujours présent dans la E. coli après recombineering, utiliser l&#39;ADN miniprep de plasmide pour transformer DH5alpha ou DH10B E. cellules de E. coli. </li><li> Effectuer séquençage de l&#39;ADN à travers le HA et la cassette d&#39;insertion pour vérifier les erreurs de synthèse oligo. </li></ol>

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</ol>

T.R.R est l’inventeur d’une demande de brevet britannique sur la technologie de recombinaison multiplexe.

Construction de lignes de cellules souches embryonnaires et les modèles de souris a historiquement impliqués ciblage de gène en utilisant des constructions plasmidiques qui contenaient l&#39;allèle modifié 4. Cependant, la construction de ces vecteurs de ciblage génique complexes se est avérée être un obstacle important à la production rapide de ces modèles. Le développement de stratégies de construction du vecteur de recombineering base a permis l&#39;amélioration des dessins vectoriels et assemblage de vecteur plus efficace. Néanmoins, les protocoles de recombineering actuels impliquent toujours plusieurs étapes, exigent la purification de plasmide intermédiaire et utilisent différentes souches bactériennes. Sous-clonage insertion plus offre une nouvelle approche pour la construction du vecteur qui peut être effectuée dans une épreuve d&#39;électroporation dans la souche BAC hôte de résident. L&#39;utilité de SPI dans le ciblage génique a été testée ici dans une variété d&#39;applications de construction de vecteur. Dans tous les cas examinés ici, SPI se est avérée efficace et le plasmide recombinant a été produit correcte.Dans la majorité des cas, les multiples cassettes différentes ont été correctement inséré dans le vecteur de ciblage. Les grandes cassettes et des vecteurs d&#39;ADN sont facilement logés dans le protocole SPI et ont démontré la souplesse de ce système. SPI repose sur l&#39;utilisation de séquences longues d&#39;homologie et phosphorothioate (PTO) protection des cassettes d&#39;ADN linéaire. modification de force confère une protection contre exonucléases à l&#39;ADN linéaire 20,21 et la longue HA augmente l&#39;efficacité de recombinaison pour permettre le multiplexage. Cependant, la synthèse des séquences plus longues oligo augmente les chances d&#39;accumulation des erreurs en particulier des suppressions. Des mutations dans le oligo peuvent être particulièrement préjudiciable si elles couvrent des régions codantes de protéines. séquençage de l&#39;ADN à travers le HA et couvrant la pleine longueur de la cassette insérée est fortement recommandé d&#39;éliminer clones avec des altérations de séquence. Utilisation d&#39;un système d&#39;ADN polymerase haute fidélité est également recommandé d&#39;éviter l&#39;introduction d&#39;uny erreurs de PCR. La longueur et la composition de l&#39;HA du plasmide de sous-clonage est plus critique par rapport à celle de la cassette d&#39;introduction (données non présentées). Pour les applications particulièrement sensibles comme la construction de vecteurs Knockin, où des mutations dans les régions d&#39;exon ne sont pas tolérés, l&#39;HA de la cassette d&#39;insertion peut être raccourcie (50-120 pb) pour éviter les problèmes associés aux longs oligos. La cassette d&#39;insertion peut également être laissée non modifié ou sous forme de phosphorothioate double (où la connaissance de la direction de la replication ne est pas disponible). Mais multiplexage dans ces cas nécessite encore longtemps protégé HA plasmides sous-clonage. Une mise en garde de cette stratégie particulière est l&#39;abaissement de l&#39;efficacité multiplexage qui peuvent avoir une incidence sur le clonage à des loci SPI différente. La longueur de la cassette d&#39;insertion et le plasmide de sous-clonage est un autre paramètre important dans le clonage SPI. Molécules d&#39;ADN plus grands électroporer moins efficace et l&#39;effet est cumulatif, compte tenu de la reexigence voulant introduire toutes les cassettes dans la même cellule (données non présentées). Le multiplexage est plus efficace avec des petites cassettes d&#39;insertion. Fragments d&#39;ADN de plus de 3 kb placer aussi une limite sur le traitement des ssADN médiation Rouge, qui est la plus efficace jusqu&#39;à 3 kb 30. cassettes d&#39;insertion de plus de 3 kb sont à double résection et recombinent moins efficacement par une voie indépendante de 20 bêta. Par conséquent, le dépistage de colonies suffisante pour identifier le clone correct devient important dans ces cas. Une durée plus longue de la recombinaison après électroporation augmente également les chances de guérison du clone correct à des exercices difficiles SPI. Jusqu&#39;à quatre petites cassettes (&lt;1,5 kb) peuvent être insérés en même temps que le processus SPI, bien que l&#39;efficacité de multiplexage diminue avec chaque cassette additionnelle (données non présentées). Toutefois, cela reflète le résultat d&#39;une expérience SPI optimale et il est conseillé de considérer les limites de multiplexage lors de l&#39;utilisation de nombreuses grandes cassettes. </p&gt; Le développement d&#39;outils d&#39;édition du génome comme cluster répétitions palindromiques courts régulièrement espacées (CRISPR) système de endonucléase -cas9 a permis la création de nouvelles modifications du génome et a conduit à plus efficace l&#39;ingénierie des génomes 36. Cependant, ces nouvelles technologies ont complété ciblage génique vecteurs plutôt que de les supplanter. Il est envisagé que le système CRISPR-cas pourrait remplacer sélection antibiotique et affiner le protocole recombineering multiplex.

Le développement de technologies géniques ciblant a permis la construction de lignées cellulaires et des modèles de souris pour étudier différents systèmes biologiques 1-3. Une première étape clé dans la modification d&#39;une séquence génomique est la conception et la construction d&#39;un gène vecteur de ciblage 4. Des vecteurs de ciblage sont des constructions plasmidiques qui portent l&#39;allèle d&#39;intérêt contenant les modifications désirées (s) flanqué par un marqueur de sélection (par exemple, la néomycine), et de longues régions génomiques nécessaires pour une recombinaison homologue efficace dans des cellules de mammifères 5. Modification génétique précise est obtenue par l&#39;introduction du vecteur de ciblage dans souches embryonnaires (ES) des cellules 6 ou des cellules somatiques 7, dans lequel la recombinaison homologue entre les tronçons identiques de la séquence d&#39;ADN sur le vecteur de ciblage et les résultats de locus génomiques dans le transfert de la modification envisagée au génome par conversion génique 8. Cette modified cellules ES peuvent être injectées dans des blastocystes de souris pour produire une descendance (chimères) qui peut ensuite transmettre ces allèles modifiés via la lignée germinale 9. Une voie alternative pour produire des souris transgéniques implique la micro-injection d&#39;un vecteur d&#39;expression de gènes dans des zygotes unicellulaires de souris, ce qui conduit à l&#39;intégration aléatoire du vecteur dans le génome de la souris 10. Les méthodes traditionnelles de construction du vecteur sont appuyés sur conventionnelle &quot;couper-coller&quot; clonage en utilisant des enzymes de restriction et les ligases d&#39;ADN à cloner les différents marqueur de sélection et des fragments génomiques dans un squelette du vecteur. Cependant, un facteur limitant inhérente de clonage traditionnel est le positionnement et le choix des sites de restriction, en particulier avec de plus longues séquences d&#39;ADN. Ceci nécessite souvent plusieurs étapes de sous-clonage et introduit également des séquences d&#39;ADN étranger dans le vecteur, ce qui conduit souvent à une efficacité inférieure de ciblage de gène. Recombineering (eng recombinogèneineering) est une technologie d&#39;ingénierie d&#39;ADN qui surmonte ces limitations en utilisant une recombinaison homologue (HR) à médiation par des protéines de recombinaison phage dans E. cellules de E. coli 11,12. Etant donné que ne importe quelle région d&#39;une séquence homologue peut servir de substrat de recombineering, les contraintes de disponibilité de sites de restriction sont enlevés. De grandes séquences d&#39;ADN peuvent être modifiés de façon transparente directement in vivo, préservant ainsi aussi leur intégrité structurelle 13. Recombineering est très efficace avec des homologies courtes (50 pb) 14 et donc bras d&#39;homologie (HA) peuvent être facilement incorporés dans des séquences d&#39;oligo synthétiques. Dans une expérience de recombineering typique, un oligo ou un fragment d&#39;ADN double brin (ADNdb) contenant HA est électroporation dans E. recombineering compétente cellules de E. coli contenant la cible située soit sur ​​le chromosome ou sur un plasmide 15. Le potentiel de recombinaison est conféré par l&#39;expression inductible de la rec-Rougeombinaison protéines de phage 16,17 ou les protéines RecET du prophage rac 18. Le exonucléase Rouge / RecE convertit ADNdb linéaires à un ADN simple brin (ADNsb) intermédiaire, qui est ensuite lié par son partenaire, Rouge / RecT, un seul brin protéines de recuit (SSAP) 19. Le recuit d&#39;un long ou un court ADNsb oligo à sa séquence cible complémentaire se produit sur la mèche de ralentissement de la fourche de réplication et conduit à l&#39;incorporation de la séquence au niveau du site cible. Retard brin ssADN recombinaison est la base de la grande efficacité de recombineering et peut être décrit par la &#39;beta&#39; modèle de recombinaison 20,21. Un workflow de recombineering typique pour construire un vecteur de ciblage de gène implique l&#39;une des deux voies suivantes. Une voie consiste à sous-clonage de la région génomique désirée à partir d&#39;un clone BAC de la souris dans un plasmide, suivie par l&#39;insertion séquentielle des sites de recombinaison LoxP, un marqueur de sélection <sjusqu&#39;à&gt; 22 etc., ou la voie alternative consiste à cibler le locus génomique de BAC avec les différents éléments de vecteur de ciblage par plusieurs tours de recombineering 10,23 puis sous-clonage du locus modifié dans un plasmide par écart de réparation clonage 24,25. Variations sur ce thème ont été utilisés dans différents pipelines à haut débit recombineering dans le cadre de programmes de production à grande de souris 26,27. Toutefois, ces procédures impliquent les étapes longues et complexes, nécessitent l&#39;utilisation de vecteurs spécialisés et E. coli souches (par exemple, des cellules exprimant Cre) et d&#39;utiliser une ou plusieurs étapes intermédiaires de purification de l&#39;ADN vecteur et re-transformation (tableau 1). Sous-clonage insertion plus (SPI) est une nouvelle technique de recombineering qui combine beta recombinaison et la réparation écart clonage dans un processus unique (Figure 1). SPI assemblage de vecteur est simple, rapide et flexible et offre une amélioration significative sur recombi normeingé- approches (tableau 1). Ici, nous démontrons la facilité et l&#39;utilité de l&#39;aide SPI pour différentes applications de construction du vecteur avec un accent particulier sur la construction de conceptions de vecteur non-standard et difficiles. Les cas de tests comprenaient la construction d&#39;un vecteur reporter de Knockin fluorescent, une expression de protéine marquée vecteur Knockin double, un vecteur rapporteur fluorescent de BAC et un vecteur de knock-out conditionnel. Ceux-ci ont examiné diverses à l&#39;exigence de localiser un récepteur de surface cellulaire, la purification d&#39;un complexe de protéine nucléaire ou ablatent conditionnelle l&#39;expression d&#39;un gène.

<table><tbody><tr><td>Antibiotiques sauf Zeocin</td><td>Sigma : http://www.sigmaaldrich.com</td><td>Ampicilline, A9518-5G ; Chloramphénicol , C1919-5G ; blasticidine, 15205-25MG ; gentamicine, G1264-50MG ; hygromycine, H3274-50MG ; Kanamycine, : K1876-1G ; Chlorhydrate de tétracycline, T7660-5G ; Triméthoprime, 92131-1G</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invivogen :&nbsp ;</td><td>ant-zn-1</td><td>Zeocin est également disponible chez Life technologies/Fisher</td></tr><tr><td>C57BL/6 BAC clones</td><td>CHORI : https://bacpac.chori.org/&nbsp ;</td><td>Les banques de BAC RPCI-23 ou RPCI-24</td> Les <td>clones de 129/Sv BAC peuvent être obtenus à partir du système d’ADN polymérase à démarrage rapide Invivogen ou Life technologies/Fisher</td></tr><tr><td>KOD</td><td>Millipore : https://www.merckmillipore.com</td><td>71086-3</td><td></td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sigma : http://www.sigmaaldrich.com</td><td>A3256-25G</td><td></td></tr><tr><td>Oligos longs</td><td>IDT : https://www.idtdna.com ; Lien génétique : https://www.genelink.com</td><td>Ultramères IDT ou Oligos longs Gene Link</td><td>PTO et Phosphosphate disponibles en tant que modifications personnalisées. La purification PAGE est fortement recommandée pour les oligos longs.</td></tr><tr><td>Kit de purification PCR MinElute</td><td>Qiagen : http ://www.qiagen.com&nbsp ;</td><td>28004</td><td>Les kits de purification PCR à élution minimale sont préférés.</td></tr><tr><td>QIAPrep Spin Mini Kit de préparation</td><td>Qiagen : http ://www.qiagen.com&nbsp ;</td><td>27104</td><td>La colonne de silice ou les kits de matrice similaire sont préférés.</td></tr><tr><td>Enzymes de restriction</td><td>NEB : https://www.neb.com</td><td>DpnI : R0176L</td><td>Voir le site Web de NEB pour une liste d’ER.</td></tr></tbody></table>

sous-clonage plus insertion (spi) - un recombineering nouveau procédé pour la construction rapide de ciblage de gène vecteurs

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Le ciblage génique fait référence à la modification précise d’un locus génétique par recombinaison homologue. La génération de nouvelles lignées cellulaires et de modèles de souris transgéniques à l’aide de cette méthode nécessite la construction d’un vecteur « de ciblage », qui contient des séquences d’ADN homologues au gène cible, et a été pendant de nombreuses années une étape limitante dans le processus. La construction de vecteurs peut être réalisée in vivo dans des cellules d’Escherichia coli en utilisant la recombinaison homologue médiée par des recombinases de phages à l’aide d’une technique appelée recombinaison. La recombinaison est la technique privilégiée pour sous-cloner les longues séquences d’homologie (>4kb) et divers éléments de ciblage, y compris les marqueurs de sélection qui sont nécessaires pour médier un échange allélique efficace entre un vecteur de ciblage et son locus génomique apparenté. Les protocoles de recombinaison typiques suivent un schéma itératif d’intégration par étapes des éléments de ciblage et nécessitent des étapes intermédiaires de purification et de transformation. Ici, nous présentons une nouvelle méthodologie de recombinaison de l’assemblage vectoriel à l’aide d’une approche multiplexe. La réparation des lacunes plasmidiques est réalisée par la capture simultanée de séquences génomiques à partir de banques de chromosomes artificiels bactériens de souris et l’insertion de marqueurs de sélection bactériens et mammifères doubles. Cette méthode de sous-clonage et d’insertion est très efficace et produit une majorité de recombinants corrects. Nous présentons des données pour la construction de différents types de vecteurs conditionnels d’inactivation de gènes, ou knock-in, et de vecteurs rapporteurs BAC qui ont été construits à l’aide de cette méthode. La construction vectorielle SPI élargit considérablement le répertoire de la boîte à outils de recombinaison et fournit une méthode simple, rapide et rentable de construction de ces vecteurs très complexes.

Les méthodologies de ciblage génique peuvent être utilisées pour générer des souris transgéniques avec des allèles knockout, knock-in et marqués. Ici, nous décrivons une méthode améliorée de recombinaison chez E. coli, que nous appelons « sous-clonage plus insertion », qui peut être utilisée pour générer rapidement des vecteurs de ciblage génique personnalisés.

Sous-clonage plus insertion (SPI) - Un Recombineering nouveau procédé pour la construction rapide de ciblage de gène Vecteurs

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...

L’objectif général de l’expérience suivante est de construire des vecteurs de ciblage génique en utilisant le sous-clonage et l’insertion. Ceci est réalisé en transformant le dos contenant e coli avec un plasmide recombinant. La deuxième étape consiste à générer des cassettes d’insertion phosphorolées asymétriques et à sous-cloner des plasmides par réaction en chaîne par polymérase.Après l’ajout d’arabinose, les protéines de recombinaison GBAA sont exprimées et la cassette d’insertion terminale modifiée et le plasmide de sous-clonage sont électroporés. La séquence d’ADN souhaitée est simultanément captive par l’arrière et modifiée avec la cassette d’insertion dans le plasmide de sous-clonage. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la recombinaison standard, est que la construction de vecteurs ciblant les gènes peut être effectuée en une seule réaction.Pour commencer, concevez des oligos pour la cassette d’insertion et le plasmide de sous-clonage, concevez chaque oligo de manière à ce qu’il contienne 180 bras d’homologie de paires de bases flanquant le site cible génomique et 20 paires de bases, une séquence d’amorçage spécifique pour la cassette d’insertion ou le plasmide de sous-clonage. Ensuite, déterminez l’orientation de l’insert d’ADN génomique du clone arrière à l’aide d’un outil Web tel que clone db. Établissez la direction de réplication à partir de ou ES en vérifiant la carte du squelette plasmidique arrière utilisé dans le dos.Construction de la bibliothèque, ajoutez deux liaisons phospho huit terminales, donc l’extrémité première cinq de l’oligo qui est opposée à la direction de réplication sur le clone arrière. Ensuite, ajoutez une modification de phosphate à cinq premiers ordres à l’oligo inverse. Insérez d’abord une pointe de pipette stérile dans la culture de gélose arrière et inculquez 5,0 millilitres de bouillon odidé.Cultivez la culture à 37 degrés Celsius pendant cinq heures en secouant à 200 tr/min. Ensuite, refroidissement, solution de glycérol à 10 %, microcentrifugeuse, tubes et électroporation, cuvettes sur refroidisseur de glace, grande centrifugeuse réfrigérée et micro-centrifugeuse à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, déterminer la densité optique de la culture à l’aide d’un spectrophotomètre.Mesure de l’absorbance. À 600 nanomètres. Préparez les cellules électrocompétentes lorsqu’une lecture OD 600 de 0,3 à 0,8 est atteinte.Lorsque la culture est prête, faites tourner les cellules dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Lavez les cellules avec un millilitre de glycérol 10 % réfrigéré et essorez-les à nouveau. Effectuez ces étapes de lavage trois fois au total.Remettez les cellules en suspension dans un volume total de 50 microlitres et ajoutez 10 à 200 nanogrammes de plasmide recombinant. Obtenez une suspension à cellule unique en pipetant plusieurs fois de haut en bas, puis transférez les cellules dans une électroporation pré-refroidissement. Vete. Ensuite, placez le vete dans un dispositif d’électroporation et électro-actionnez les cellules récupèrent immédiatement les cellules dans un millilitre de LB et transférez les cellules dans un tube de centrifugation de 50 millilitres.Cultivez la culture arrière à 30 degrés Celsius pendant deux heures en secouant à 200 tr/min. Après ce temps, ajoutez neuf millilitres de LB à la culture récupérée. Cultiver pendant la nuit à 30 degrés Celsius en secouant à 200 tr/min pour incorporer les bras d’homologie dans la cassette d’insertion et le plasmide de clonage subc.Effectuez une PCR en utilisant les oligos modifiés longs préparés précédemment. À l’aide d’une enzyme de restriction, choisissez-en une qui coupe en dehors de la région d’amplification de la PCR et qui est activée par la chaleur. Configurez la PCR à l’aide d’un système d’ADN polymérase à démarrage à chaud haute fidélité.Préparez un mélange maître PCR et effectuez un cycle thermique conformément aux meilleures pratiques. Après la réaction, analysez les produits PCR par électrophorèse sur gel AROS. Chargez un à cinq microlitres de chaque PCR sur un gel à 1 %.Ensuite, purifiez les produits PCR à l’aide d’un kit de purification PCR. Quantifiez l’ADN amplifié par PCR par rapport à un ensemble connu d’étalons d’ADN ou à l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop. Après une incubation d’une nuit, diluer la culture d’ACSB de 50 fois et préparer une culture distincte pour un contrôle négatif.Faites pousser les cultures diluées à 30 degrés Celsius en secouant à 200 tr/min pendant une heure et 50 minutes. Ensuite, refroidissez tous les matériaux et équipements de recombinaison à quatre degrés Celsius, comme démontré précédemment. Préparez une solution à 10 % en poids par volume d’OSE et filtrez la stérilisation à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 micron.Lorsque la DO de la culture du dos atteint le niveau souhaité, procédez à l’induction des protéines de recombinaison. Ajoutez 200 microlitres de la solution arabe à 10 % à 10 millilitres de la culture dorsale pour obtenir une concentration finale de 0,2 %. Incluez une culture non induite à utiliser comme témoin négatif. Transférez les cultures dans un incubateur à 37 degrés Celsius et induisez l’expression rouge pendant 45 minutes en secouant à 230 tr/min.Faites tourner les cellules et lavez-les trois fois avec du glycérol à 10 %, comme indiqué précédemment à 600 à 1000 nanogrammes. Chacune des cassettes d’insertion et du plasmide de sous-clonage de la réaction de recombinaison comprend un vecteur seul et un vecteur plus un contrôle d’insertion unique pour vérifier la capacité de recombinaison et l’intégrité du vecteur. Ensuite, procurez-vous une suspension à cellule unique et faites fonctionner les cellules comme indiqué précédemment.Permettre la récupération dans un milieu LB à 37 degrés Celsius pendant une heure pour les plasmides à copies multiples ou dans 10 lb à 37 degrés Celsius pendant trois heures pour les vecteurs arrière. Effectuer différentes dilutions avec la culture récupérée sur double sélection. Agar s’il vous plaît et cultivez à 37 degrés Celsius pendant 16 heures.Lorsque vous êtes prêt, choisissez les colonies dans cinq millilitres de LB contenant l’antibiotique sélectif et cultivez-les pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Ensuite, utilisez un kit de purification en colonne pour préparer un mini ADN de préparation, introduisez l’enzyme de restriction appropriée, puis identifiez les clones contenant les tailles de fragments attendues par électrophorèse sur gel. Enfin, effectuez le séquençage de l’ADN à travers les bras d’homologie et la cassette d’insertion pour vérifier les erreurs de photosynthèse oli.Dans cet exemple, l’analyse de digestion de restriction de P deux RX un insert EYFP contenant des clones a montré le modèle attendu indiquant qu’ils contiennent le vecteur knockin correctement assemblé. Ce schéma illustre le concept de parage des bacts. L’utilisation du sous-clonage et de l’analyse d’insertion des produits PCR a confirmé que les cassettes étaient correctement incorporées.De plus, lorsque des clones positifs ont été analysés après l’ajout de l’enzyme de restriction appropriée, le motif attendu a été obtenu. L’analyse de la digestion de restriction de 12 clones de R SR deux SBI a montré un assemblage vectoriel correct dans la majorité des recombinants. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de construire rapidement des vecteurs de ciblage génique en utilisant le sous-clonage et l’insertion.

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Utilisation de l'assemblage de l'ADN, de multiples vecteurs de CRISPR peuvent être construits en parallèle dans une réaction de clonage unique, ce qui rend la construction d'un grand nombre de vecteurs CRISPR une tâche simple. Tomate racines chevelues sont un excellent modèle pour valider des vecteurs CRISPR et de générer des matériaux mutantes.

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