Sous-clonage plus insertion (SPI) - Un Recombineering nouveau procédé pour la construction rapide de ciblage de gène Vecteurs

L’objectif général de l’expérience suivante est de construire des vecteurs de ciblage génique en utilisant le sous-clonage et l’insertion. Ceci est réalisé en transformant le dos contenant e coli avec un plasmide recombinant. La deuxième étape consiste à générer des cassettes d’insertion phosphorolées asymétriques et à sous-cloner des plasmides par réaction en chaîne par polymérase.

Après l’ajout d’arabinose, les protéines de recombinaison GBAA sont exprimées et la cassette d’insertion terminale modifiée et le plasmide de sous-clonage sont électroporés. La séquence d’ADN souhaitée est simultanément captive par l’arrière et modifiée avec la cassette d’insertion dans le plasmide de sous-clonage. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la recombinaison standard, est que la construction de vecteurs ciblant les gènes peut être effectuée en une seule réaction.

Pour commencer, concevez des oligos pour la cassette d’insertion et le plasmide de sous-clonage, concevez chaque oligo de manière à ce qu’il contienne 180 bras d’homologie de paires de bases flanquant le site cible génomique et 20 paires de bases, une séquence d’amorçage spécifique pour la cassette d’insertion ou le plasmide de sous-clonage. Ensuite, déterminez l’orientation de l’insert d’ADN génomique du clone arrière à l’aide d’un outil Web tel que clone db. Établissez la direction de réplication à partir de ou ES en vérifiant la carte du squelette plasmidique arrière utilisé dans le dos.

Construction de la bibliothèque, ajoutez deux liaisons phospho huit terminales, donc l’extrémité première cinq de l’oligo qui est opposée à la direction de réplication sur le clone arrière. Ensuite, ajoutez une modification de phosphate à cinq premiers ordres à l’oligo inverse. Insérez d’abord une pointe de pipette stérile dans la culture de gélose arrière et inculquez 5,0 millilitres de bouillon odidé.

Cultivez la culture à 37 degrés Celsius pendant cinq heures en secouant à 200 tr/min. Ensuite, refroidissement, solution de glycérol à 10 %, microcentrifugeuse, tubes et électroporation, cuvettes sur refroidisseur de glace, grande centrifugeuse réfrigérée et micro-centrifugeuse à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, déterminer la densité optique de la culture à l’aide d’un spectrophotomètre.

Mesure de l’absorbance. À 600 nanomètres. Préparez les cellules électrocompétentes lorsqu’une lecture OD 600 de 0,3 à 0,8 est atteinte.

Lorsque la culture est prête, faites tourner les cellules dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Lavez les cellules avec un millilitre de glycérol 10 % réfrigéré et essorez-les à nouveau. Effectuez ces étapes de lavage trois fois au total.

Remettez les cellules en suspension dans un volume total de 50 microlitres et ajoutez 10 à 200 nanogrammes de plasmide recombinant. Obtenez une suspension à cellule unique en pipetant plusieurs fois de haut en bas, puis transférez les cellules dans une électroporation pré-refroidissement. Vete. Ensuite, placez le vete dans un dispositif d’électroporation et électro-actionnez les cellules récupèrent immédiatement les cellules dans un millilitre de LB et transférez les cellules dans un tube de centrifugation de 50 millilitres.

Cultivez la culture arrière à 30 degrés Celsius pendant deux heures en secouant à 200 tr/min. Après ce temps, ajoutez neuf millilitres de LB à la culture récupérée. Cultiver pendant la nuit à 30 degrés Celsius en secouant à 200 tr/min pour incorporer les bras d’homologie dans la cassette d’insertion et le plasmide de clonage subc.

Effectuez une PCR en utilisant les oligos modifiés longs préparés précédemment. À l’aide d’une enzyme de restriction, choisissez-en une qui coupe en dehors de la région d’amplification de la PCR et qui est activée par la chaleur. Configurez la PCR à l’aide d’un système d’ADN polymérase à démarrage à chaud haute fidélité.

Préparez un mélange maître PCR et effectuez un cycle thermique conformément aux meilleures pratiques. Après la réaction, analysez les produits PCR par électrophorèse sur gel AROS. Chargez un à cinq microlitres de chaque PCR sur un gel à 1 %.

Ensuite, purifiez les produits PCR à l’aide d’un kit de purification PCR. Quantifiez l’ADN amplifié par PCR par rapport à un ensemble connu d’étalons d’ADN ou à l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop. Après une incubation d’une nuit, diluer la culture d’ACSB de 50 fois et préparer une culture distincte pour un contrôle négatif.

Faites pousser les cultures diluées à 30 degrés Celsius en secouant à 200 tr/min pendant une heure et 50 minutes. Ensuite, refroidissez tous les matériaux et équipements de recombinaison à quatre degrés Celsius, comme démontré précédemment. Préparez une solution à 10 % en poids par volume d’OSE et filtrez la stérilisation à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 micron.

Lorsque la DO de la culture du dos atteint le niveau souhaité, procédez à l’induction des protéines de recombinaison. Ajoutez 200 microlitres de la solution arabe à 10 % à 10 millilitres de la culture dorsale pour obtenir une concentration finale de 0,2 %. Incluez une culture non induite à utiliser comme témoin négatif. Transférez les cultures dans un incubateur à 37 degrés Celsius et induisez l’expression rouge pendant 45 minutes en secouant à 230 tr/min.

Faites tourner les cellules et lavez-les trois fois avec du glycérol à 10 %, comme indiqué précédemment à 600 à 1000 nanogrammes. Chacune des cassettes d’insertion et du plasmide de sous-clonage de la réaction de recombinaison comprend un vecteur seul et un vecteur plus un contrôle d’insertion unique pour vérifier la capacité de recombinaison et l’intégrité du vecteur. Ensuite, procurez-vous une suspension à cellule unique et faites fonctionner les cellules comme indiqué précédemment.

Permettre la récupération dans un milieu LB à 37 degrés Celsius pendant une heure pour les plasmides à copies multiples ou dans 10 lb à 37 degrés Celsius pendant trois heures pour les vecteurs arrière. Effectuer différentes dilutions avec la culture récupérée sur double sélection. Agar s’il vous plaît et cultivez à 37 degrés Celsius pendant 16 heures.

Lorsque vous êtes prêt, choisissez les colonies dans cinq millilitres de LB contenant l’antibiotique sélectif et cultivez-les pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Ensuite, utilisez un kit de purification en colonne pour préparer un mini ADN de préparation, introduisez l’enzyme de restriction appropriée, puis identifiez les clones contenant les tailles de fragments attendues par électrophorèse sur gel. Enfin, effectuez le séquençage de l’ADN à travers les bras d’homologie et la cassette d’insertion pour vérifier les erreurs de photosynthèse oli.

Dans cet exemple, l’analyse de digestion de restriction de P deux RX un insert EYFP contenant des clones a montré le modèle attendu indiquant qu’ils contiennent le vecteur knockin correctement assemblé. Ce schéma illustre le concept de parage des bacts. L’utilisation du sous-clonage et de l’analyse d’insertion des produits PCR a confirmé que les cassettes étaient correctement incorporées.

De plus, lorsque des clones positifs ont été analysés après l’ajout de l’enzyme de restriction appropriée, le motif attendu a été obtenu. L’analyse de la digestion de restriction de 12 clones de R SR deux SBI a montré un assemblage vectoriel correct dans la majorité des recombinants. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de construire rapidement des vecteurs de ciblage génique en utilisant le sous-clonage et l’insertion.