Name: Microscopie à force atomique de Red-Light photorécepteurs Utilisation de lassociation PeakForce quantitative nanomécanique propriété (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 13 s
Description: Découvrez la microscopie à force atomique avec PF-QNM pour imager les dimères de photorécepteurs protéiques sur mica. Cette méthode offre des images haute résolution dans un environnement biologique pertinent.

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Le programme NSF-IRM (CHE: 1229103) est reconnu pour financer l&#39;achat de nouveaux appareils électroniques de contrôle, des logiciels, des cellules liquides, et d&#39;autres équipements nécessaires à l&#39;assemblage d&#39;un double AFM / STM. Nous reconnaissons les équipements communs à l&#39;Université de Chicago programme NSF-MRSEC (DMR-0820054) pour l&#39;assistance avec l&#39;AFM instrumentation, de la formation et de l&#39;imagerie, et pour le temps de l&#39;instrument mis à disposition par le Réseau Installations de recherche Matériaux (DMR-0820054). Nous remercions tout particulièrement le Dr Qiti Guo, le Dr Justin Jureller, et le professeur Ka Yee Lee pour accueillir nos étudiants avant que le financement de la proposition NSF-IRM qui a l&#39;instrumentation nécessaire à notre campus. Nous reconnaissons le financement d&#39;une subvention STEM titre III (ID: P031C110157) confiée à l&#39;Université Northeastern Illinois qui a fourni des bourses de recherche d&#39;été pour les étudiants et les professeurs ainsi que le soutien pour les consommables. Enfin, nous reconnaissons Bruker-Nano, Inc. pour le soutien instrumental continue et la permission de reproduce un graphique montrant le mécanisme de PeakForce QNM et d&#39;utiliser le mot ScanAsyst pour décrire le logiciel automatisé.

1. informatique et Microscope mis en place <ol><li> Ouvrir la vanne de la bouteille de N 2 et d&#39;ajuster les commandes pour assurer la table d&#39;air est flottant et le niveau. </li><li> Allumez l&#39;ordinateur, le contrôleur et la fibre optique lumière dans cet ordre. </li><li> Réglez le scanner en mode / LFM AFM et centrer la caméra sur la tête AFM. </li><li> Ouvrez le logiciel. Sélectionnez la catégorie de l&#39;expérience &quot;Propriétés nanomécaniques&quot;, &quot;Quantitative nanomécanique Mapping&quot; dans le groupe expérimental, et &quot;PeakForce QNM dans le liquide&quot; en cours d&#39;expérimentation. Cliquez sur l&#39;expérience de charge et puis Configuration. </li><li> Concentrer la caméra avec l&#39;objectif de Z à voir la surface de la scène. Utilisation du grossier vers le haut / vers le bas piezos déplacer le stade d&#39;environ 1 mm en dessous de la surface de l&#39;ouverture de la tête AFM. </li></ol> 2 Préparation de Mica Surface <ol><li> Appuyez sur un autocollant sur la face d&#39;un disque propre de support d&#39;échantillon (de 15 mm de diamètre, 0,8 mm d&#39;épaisseur). Poussez un mica V-4disque de qualité (25 x 25 x 26 mm) sur l&#39;adhésif jusqu&#39;à fermement attaché. </li><li> Frotter un morceau de ruban adhésif transparent sur le mica s&#39;assurant qu&#39;elle est bien respectée sans bulles d&#39;air. Tirez la bande de mica d&#39;un côté à cliver de façon homogène. Répétez si nécessaire pour assurer le mica est plat. </li><li> Saisir le disque de support, côté mica nettoyage, avec une paire de pinces circulaires (pinces de disques), et placer sur le scanner. Le mica doit être en dessous du niveau de l&#39;ouverture de la tête AFM. </li></ol> 3. fluide Assemblée cellulaire et l&#39;imagerie de Mica Surface <ol><li> Rincer la cellule de fluide, un joint torique, l&#39;adaptateur de seringue, l&#39;adaptateur de tuyau flexible et le tuyau d&#39;éjection dans 100% d&#39;éthanol. Rincer la cellule fluide dans l&#39;eau DI. Laissez toutes les pièces sécher à l&#39;air complètement. </li><li> Poussez l&#39;adaptateur de tuyau dans le port de la cellule fluide propre. Appuyez doucement sur le joint torique dans l&#39;encoche centre de la cellule fluide en utilisant des pinces à tête plate. </li><li> Appuyez sur le ressort légèrement sur le clip sonde de retenue et le détourner de la Groove pour la pointe. </li><li> Saisissez la sonde sur la partie longue de la pointe avec des pincettes à tête plate. Placer la sonde dans la rainure avec la pointe tournée vers le centre de la cellule. Poussez le ressort dans et ajuster le clip de retenue sur la sonde pour le fixer (figure 1B). </li><li> Vérifiez la pince sur l&#39;AFM afin de s&#39;assurer qu&#39;elle est complètement rétracté (figure 1C). </li><li> Placer le tube de fluide, le joint torique et la sonde vers le bas, au-dessus de l&#39;échantillon de mica. Permettre à la cellule fluide pour se reposer sur les goujons de l&#39;AFM. Abaisser la pince à stabiliser la cellule fluide sur la scène. Appuyez sur le bouton vers le bas sur le microscope jusqu&#39;à ce qu&#39;une inspection visuelle indique que le joint torique comprimé fermement entre le disque de support et la cellule de fluide. </li><li> Tout en regardant le moniteur, concentrer le bouton de réglage grossier de visualiser la partie supérieure de la cellule fluide sur l&#39;écran. </li><li> Déplacez le microscope jusqu&#39;à ce qu&#39;il y est une image claire de la pointe à l&#39;aide des X / Y boutons de réglage et l&#39;objectif de Z. La pointe sera apporeille comme un triangle d&#39;or métallique. Déplacer l&#39;extrémité proche de la surface de l&#39;échantillon à l&#39;aide du levier piézoélectrique sur le microscope. Focus sur la réflexion de la pointe. Gardez une trace de la console réelle par rapport à sa réflexion. A ce stade, ils doivent être étroitement alignés, mais pas complètement chevauchement. </li><li> Fixez l&#39;adaptateur de la seringue pour une seringue de 1 ml stérile. Attacher une extrémité du tuyau d&#39;éjection de l&#39;adaptateur de seringue et placer l&#39;autre extrémité du tuyau dans le réservoir de solution tampon. Déployez complètement le piston de la seringue. </li><li> Fixer le tuyau à l&#39;adaptateur de tuyau sur la cellule fluide. Appuyez doucement sur le piston jusqu&#39;à ce que le fluide remplit entièrement la chambre centrale. Vérifiez la cellule pour assurer qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles d&#39;air. Vérifiez qu&#39;il n&#39;y a pas de liquide débordant de la cellule fluide sur le microscope. Placer la seringue sur un support solide en relief. </li><li> Utilisez l&#39;alimentation de l&#39;appareil photo et les boutons X / Y de traduction pour localiser le laser sur l&#39;écran (un point rouge diffuse). Utilisation du laser mouvemboutons de commande ent, déplacer le laser sur la pointe. </li><li> Ajuster finement les commandes de laser et de miroir, jusqu&#39;à ce que le signal de somme affichée sur le microscope est maximisée (value = 4-6). </li><li> Ajustez l&#39;angle de la diode quadrant en utilisant les boutons sur le côté arrière gauche et en haut à gauche de la tête de balayage pour réduire les déviations verticales et horizontales affichées sur le microscope le plus près possible de zéro (± 0,1). </li><li> Dans le logiciel, sélectionnez les options d&#39;acquisition. Au minimum, sélectionnez hauteur (trace et retrace), l&#39;erreur de la force maximale et la déformation. Les autres options dépendent utilisateur et peuvent être adaptés en fonction de l&#39;information spécifique désirée par l&#39;expérimentateur. </li><li> Sélectionnez &quot;ligne&quot; pour RT Avion Fit dans chaque fenêtre d&#39;acquisition. Sélectionnez «aucun» pour l&#39;OT plan Fit dans les fenêtres de hauteur. Réglez la décalages X et Y et l&#39;angle de balayage à zéro, si ce n&#39;est déjà fait. </li><li> Réglez la vitesse de balayage de 1 Hz, l&#39;échantillon par ligne 256, le contrôle automatique de ScanAsystà l&#39;individu, et l&#39;auto Z limite de ScanAsyst désactivé. Modifier la limite de Z à 500 nm. Régler la taille de balayage à 1 pm. </li><li> Cliquez engager. A ce stade, la pointe se rapproche de la surface. Bien que la pointe est proche, observer Z changement de tension piézo-électrique dans le coin inférieur gauche de l&#39;écran. Si la pointe sort de la plage, retirer la pointe et re-approche. En cas d&#39;échec, la pointe peut-être besoin d&#39;être changé afin d&#39;avoir une approche réussie. Une fois que la pointe est engagée, les lignes vont commencer à apparaître sur chacune des fenêtres d&#39;acquisition qui composeront une image. </li><li> Prendre des images de mica à 1 x 1 um et agrandir lentement afin de s&#39;assurer que la surface du mica est propre et plane. Cliquez sur la capture continue d&#39;enregistrer des images telles qu&#39;elles apparaissent. Zoomer et se déplacer autour de la surface comme vous le souhaitez. </li></ol> 4. protéines dépôt et Préparation de l&#39;échantillon pour l&#39;imagerie <ol><li> Obtenir protéine purifiée échantillon 38 et garder sur la glace. Si elles sont stockées dans un congélateur, décongeler échantillon surde la glace pendant 5 min. </li><li> Diluer la protéine de 0,0010 mg / solution tampon d&#39;imagerie utilisant ml réfrigéré. Le tampon d&#39;imagerie utilisée ici est 15 mM Tris-HCl (pH = 8,0), 150 mM de NaCl et 15 mM de MgCl2. </li><li> Remplir une chambre 4 (100 x 15 mm) de boîte de Pétri avec une solution tampon d&#39;imagerie réfrigéré. Remplir chaque chambre avec au moins 5 ml de solution. Mélanger la solution de protéine diluée avec le bout attaché à micropipetteur doucement. </li><li> Appliquer 200 ul de la solution de protéine diluée à la surface du mica déjà préparé. Après 30 secondes, ramasser la protéine de surface / mica avec les pinces circulaires (pinces de disque). Maintenez l&#39;échantillon parallèle à la paillasse. </li><li> Tout en maintenant l&#39;échantillon, immédiatement immerger l&#39;échantillon dans la solution tampon contenue dans le premier quadrant de la boîte de Pétri (étape 4.2), tout en veillant à ce que l&#39;échantillon est parallèle à la cuvette de la boîte de Pétri. Après 1 sec, retirer l&#39;échantillon. </li><li> Continuer à maintenir l&#39;échantillon parallèle au bassinde la boîte de Pétri, répétez l&#39;étape 4.5 pour les trois autres quadrants. </li><li> Placez le disque sur un chiffon à poussière sec pour absorber l&#39;excès d&#39;humidité et de transférer le disque sur la platine du microscope. Ne touchez pas la surface réelle avec le chiffon. Ne pas laisser l&#39;échantillon à sécher. </li><li> Répétez les étapes 3.6 à 3.16. </li></ol> 5. imagerie protéines sur Mica <ol><li> Cliquez sur les paramètres de contrôle boîte sur le côté gauche de l&#39;écran. taille de printemps et le rayon de pointe devraient être fixés repose sur la pointe utilisée. </li><li> Cliquez engager. De même pour le processus d&#39;imagerie de mica (étape 3.17), observer la fenêtre z-piézo à l&#39;approche de pointe. </li><li> Autoriser le scanner à l&#39;image de la même zone pendant au moins deux passes consécutives. Cliquez sur la capture continue à enregistrer chaque image recueillie. </li><li> Déplacez le scanner à une nouvelle région et / ou changer la taille de l&#39;image comme vous le souhaitez. </li><li> Après que le logiciel automatisé a terminé le réglage de laparamètres de numérisation pour une taille d&#39;image particulier, tournent le logiciel off. </li><li> Ajuster manuellement la vitesse de balayage, limite z, le nombre de lignes, et de la tension afin de peaufiner la mise au point de l&#39;image. Si l&#39;image est trop loin de la mise au point, tourner logiciel de back sur pour retourner la position de départ. Pour augmenter la résolution d&#39;une image lors d&#39;un zoom sur une protéine, diminuer la vitesse de balayage et d&#39;augmenter le nombre de lignes proportionnellement. </li><li> Après l&#39;expérience, nettoyer la cellule liquide avec 100% d&#39;éthanol et rincer à DI H 2 O. Permettre à la cellule liquide pour sécher complètement. </li><li> Ouvrez le logiciel de données pour traiter des images de données brutes. Tout d&#39;abord, aplatir l&#39;image en cliquant sur l&#39;icône de l&#39;aplatir. Sélectionnez zéro ème ordre et cliquez sur exécuter. En fonction de l&#39;image, un plan de coupe peut être nécessaire pour obtenir une image appropriée à plat. Dans ce cas, sélectionnez l&#39;ajustement avion icon et dessiner un plan d&#39;une zone plate de l&#39;image à l&#39;aide du curseur. Cliquez sur exécuter. Répéter au besoin </li><li> Select l&#39;onglet de section à mesurer les dimensions de la protéine. Tracez une ligne avec le curseur déplacer sur la molécule ou de la zone à analyser. Répétez l&#39;opération pour de multiples domaines et le logiciel va générer une superposition. Exporter l&#39;image ou les données utilisées pour générer l&#39;image dans un format compatible avec d&#39;autres logiciels et dessin. </li></ol>

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</ol>

Il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents ou de conflits d’intérêts.

L&#39;AFM est un procédé de microscopie à sonde de balayage tout à fait capable d&#39;imager des protéines et d&#39;autres macromolécules biologiques dans des conditions physiologiquement pertinentes. En comparaison à la cristallographie aux rayons X et RMN, une des limites de l&#39;AFM est son incapacité à obtenir la même résolution, en particulier la résolution latérale. Lors de l&#39;utilisation de l&#39;AFM analyser une molécule sur une surface, l&#39;impact de la surface et la sonde sur l&#39;image de la molécule d...

Microscopie à force atomique (AFM) est devenu un outil très important pour l&#39;étude des propriétés structurales et mécaniques des surfaces, couches minces, et des molécules simples depuis son invention en 1986 (Figure 1). 1-3 Utilisation d&#39;une cellule de liquide, la méthode a devenir particulièrement utile dans les études des macromolécules biologiques et même de cellules vivantes dans un environnement physiologiquement pertinents. 4-10 Tapping mode AFM a traditionnellement été utilisé pour l&#39;imagerie des tissus mous ou des molécules faiblement liées à la surface, car le contact en mode AFM est généralement inadaptés en raison de pour les dommages causés par les forces latérales exercées sur l&#39;échantillon par la console. 11 Tapping mode AFM permet de réduire considérablement ces forces en ayant la pointe intermittence toucher la surface plutôt que d&#39;être en contact permanent. Dans ce mode, le cantilever est amené à osciller à ou près de sa fréquence de résonance normale à la surface. De même pour communiquer avec mode AFM, la topographie est analyzed en traçant le mouvement de la piézo-z comme une fonction de xy (distance). La dynamique en porte à faux peuvent être très instable à ou près de résonance; par conséquent, ils sont très difficiles à automatiser l&#39;extérieur d&#39;une situation dite de «stabilisation». Plus précisément, ces dynamiques dépendent à la fois les propriétés de l&#39;échantillon et de l&#39;environnement de la numérisation. Pour une molécule doux adsorbé à un (re) surface dure, une boucle de rétroaction bien réglé pour la molécule peut engendrer un retour oscillation de la surface. Fonctionnement en fluide complique encore la mise au point de la poutre. Changements dans les niveaux de température ou fluides exigent un réajustement constant de point de consigne, les gains, et d&#39;autres paramètres d&#39;imagerie. Ces ajustements ont tendance à prendre beaucoup de temps et très difficile pour les utilisateurs. Property Mapping pic de travail quantitative nanomécanique (PF-QNM), comme le mode de percussion AFM, d&#39;éviter les interactions latérales en contactant par intermittence l&#39;échantillon (Figure 2). 12-15 &lt;/ Sup&gt; Toutefois, PF-QNM fonctionne en mode et fréquences beaucoup plus basses que-tapping mode AFM non-résonance. Ceci élimine les problèmes de réglage de mode taraudage AFM, en particulier ceux exacerbé par la présence de fluide. Avec PF-QNM, les images sont recueillies en prenant une courbe de réponse de la force à chaque point de contact. Avec l&#39;ajout de logiciels de ScanAsyst, 15 réglage des paramètres de numérisation peut être automatisée et une image à haute résolution obtenue dans une affaire de minutes, même par des utilisateurs inexpérimentés. Une fois que l&#39;utilisateur se familiarise avec l&#39;AFM, tout ou partie des paramètres automatiques peuvent être désactivées à tout moment qui permet à l&#39;expérimentateur d&#39;affiner la qualité de l&#39;image manuellement. Depuis sa création, le PF-QNM a été appliquée à la carte bactériorhodopsine, une protéine de la membrane, et d&#39;autres protéines natives au niveau submoléculaire. 16-18 Pour bactériorhodopsine, il existe une corrélation directe entre la flexibilité des protéines et X-ray structures cristallographiques. PF 12 -qnM a été utilisée pour étudier des cellules vivantes avec une résolution élevée. 19,20 liens importants outre, les données PF-QNM a élucidés entre la structure et la mécanique dans la membrane des érythrocytes qui sont critiques pour l&#39;intégrité et la fonction des cellules. 21 Nous avons utilisé la microscopie à sonde à balayage (SPM) méthodes, 22 y compris AFM, 23 pour étudier la structure des photorécepteurs aux feux rouges appelé bactériophytochromes (BphPs). 24,25 Ils se composent d&#39;un module de détection de lumière lié de façon covalente à un module de signalisation effecteur tel comme l&#39;histidine kinase (HK) 26. Le module de détection de lumière comprend généralement un chromophore bilin qui subit une transformation structurelle lors de l&#39;absorption d&#39;un photon, avec une série de modifications structurelles qui atteignent le module de signalisation de l&#39;effecteur et conduisant à une transformation globale de la protéine entière . 24,27-29 base de cette transformation, il ya deux lumière distincte absorbant stats de BphPs, un état absorbant la lumière rouge et rouge lointain, désignés comme Pr et Pfr. Pr est thermiquement stable, état ​​adapté à l&#39;obscurité pour la plupart des BphPs. 28 La base moléculaire de Pr / Pfr photoconversion n&#39;est pas entièrement comprise en raison de la connaissance structurelle limitée de ces protéines. A l&#39;exception d&#39;une structure de D. radiodurans, tous les 30 rayons X publiée structures cristallographiques de ces protéines sont dans l&#39;état adapté à l&#39;obscurité et manquent de domaine effecteur. Les BphPs intacts sont trop gros pour être étudié de manière efficace par résonance magnétique nucléaire (RMN) et sont notoirement difficiles à cristalliser dans leur forme intacte (en particulier dans l&#39;Etat de lumière adapté) pour la cristallographie aux rayons X. BphPs ont récemment été conçu en tant que marqueurs de protéines fluorescentes infrarouge (IFP). 31 Caractérisation structurale de ces protéines peut favoriser l&#39;aide à la conception IFP efficace. 32-36 Est l&#39;objet de cet article de présenter une procédure pourde formation d&#39;image à l&#39;aide de l&#39;AFM BphPs liquide-cellule par l&#39;intermédiaire de PF-QNM. La méthode est démontrée par des études de l&#39;état de lumière adaptée de la bactériophytochrome RpBphP3 (P3) de la bactérie photosynthétique R. palustris. La procédure de l&#39;AFM approche présentée ici est simple et commode pour l&#39;imagerie de protéines ainsi que d&#39;autres macromolécules biologiques. Avec cette méthode, les détails de structure des molécules individuelles peuvent être collectées dans un court laps de temps, similaire à une session de cours de science de laboratoire de niveau supérieur. Grâce à la mesure de sections et de compléter d&#39;autres analyses dimensionnelles, les données expérimentales peuvent être comparés à des modèles informatiques utiles. 37-42

<table><tbody><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4997-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Acros Organics</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Acros Organics</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Multimode 8 AFM</td><td>Bruker-Nano</td><td>492-008-011</td><td>équipé d’un contrôleur Nanoscope V et d’un scanner J</td></tr><tr><td>Sonde</td><td>Bruker-Nano</td><td>SNL-10, ScanAsyst-Fluid+</td><td></td></tr><tr><td>Mode de tapotement Cellule fluide</td><td>Bruker-Nano</td><td>MTFML</td><td></td></tr><tr><td>Mica V-4 Grade</td><td>SPI fournit</td><td>1150503</td><td>25 x 25 x .26 mm</td></tr><tr><td>Disque de support d’échantillon</td><td>nanoSurf</td><td>BT02236</td><td></td></tr><tr><td>boîte de Pétri</td><td>Plasta-Medic, Inc.</td><td></td><td>100 mm x 15 mm&nbsp ;</td></tr><tr><td>micropipettes</td><td>Denville Scientific</td><td>XL 3000i</td><td></td></tr><tr><td>RpBphP3</td><td></td><td></td><td>Préparé selon les références citées</td></tr><tr><td>Logiciel de nanoscope</td><td>Bruker-Nano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optic Light</td><td>Digital Instruments Inc.</td><td>F0-50</td><td></td></tr><tr><td>Pelco AFM Disque</td><td>Pince Ted Pella Inc</td><td>1668</td><td>Seringue 12 mm</td></tr><tr><td>1 ml</td><td>McKesson</td><td>102-ST1C</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Eppendorf</td><td>Denville Scientific</td><td>C2171</td><td></td></tr><tr><td>Le système graphique moléculaire Pymol v.1.5.0.1</td><td>Schrödinger, LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microscopie à force atomique de red-light photorécepteurs utilisation de l&#39;association peakforce quantitative nanomécanique propriété

Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

La microscopie à force atomique (AFM) utilise une pointe pyramidale fixée à un porte à faux à sonder la réaction d&#39;une surface de force. Les déviations de la pointe peut être mesurée à ~ 10 pN par un laser et d&#39;un détecteur à secteurs, qui peut être converti à l&#39;image de la topographie. Modulation d&#39;amplitude ou &quot;tapping mode&quot; AFM implique la sonde en contact intermittent avec la surface en oscillant à sa fréquence de résonance pour produire une image. Utilisé en association avec une cellule de fluide, en mode taraudage AFM permet l&#39;imagerie des macromolécules biologiques telles que les protéines dans des conditions physiologiquement pertinentes. Mode Tapping AFM nécessite un réglage manuel de la sonde et de fréquents ajustements d&#39;une multitude de paramètres d&#39;analyse qui peut être difficile pour les utilisateurs inexpérimentés. Pour obtenir des images de haute qualité, ces ajustements sont les plus coûteux en temps. PeakForce quantitative nanomécanique Property Mapping (PF-QNM) produit une image en mesurant une respon forcecourbe soi pour chaque point de contact avec l&#39;échantillon. Avec le logiciel de ScanAsyst, PF-QNM peut être automatisé. Ce logiciel permet de régler le point de consigne, la fréquence d&#39;entraînement, vitesse de balayage, les gains, et d&#39;autres paramètres de numérisation importants automatiquement pour un échantillon donné. Non seulement ce processus à protéger les deux sondes et les échantillons fragiles, il réduit considérablement le temps nécessaire pour obtenir des images à haute résolution. PF-QNM est compatible pour l&#39;imagerie AFM dans le liquide; par conséquent, il a une large application pour l&#39;imagerie de matériaux biologiquement pertinents. La méthode présentée dans ce document décrit l&#39;application de PF-QNM d&#39;obtenir des images d&#39;un photorécepteur de lumière rouge bactérienne, RpBphP3 (P3), de la photosynthèse R. palustris dans son état ​​adapté à la lumière. En utilisant cette méthode, les dimères de protéines individuelles de P3 et des agrégats de dimères ont été observées sur une surface de mica en présence d&#39;un tampon d&#39;image. Avec les ajustements appropriés à la surface et / ou de la concentration de la solution, cette méthodepeuvent généralement être appliquées à d&#39;autres macromolécules d&#39;intérêt biologique et de matériaux souples.

Images AFM représentatifs d'une protéine de photorécepteur, P3, dans l'état adapté à la lumière sont présentés sur les figures 3 et 4. Un substrat de mica fraîchement clivé (figure 3A) est une surface appropriée, plat pour l'adsorption des protéines. Collecte d'une image de mica propre en tant que témoin négatif est important pour plusieurs raisons. Tout d'abord, il assure la cellule liquide est propre et pas de matières résiduelles provenant d'expériences antérieures c...

Une méthode d’étude de la structure d’un photorécepteur protéique à l’aide de la microscopie à force atomique (AFM) est décrite dans cet article. La cartographie quantitative des propriétés nanomécaniques PeakForce (PF-QNM) révèle des dimères de protéines intacts à la surface d’un mica.

Microscopie à force atomique de Red-Light photorécepteurs Utilisation de l&#39;association PeakForce quantitative nanomécanique propriété

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

L’objectif global de cette procédure est de collecter des images à haute résolution des protéines photoréceptrices à l’aide de la microscopie à force atomique. Pour ce faire, on obtient d’abord un échantillon du photorécepteur et on le dilue. La deuxième étape consiste à appliquer l’échantillon de protéines sur une surface de mica fraîchement clivée et propre pendant environ 30 secondes.Ensuite, le MICA est rincé avec un tampon pour éliminer les molécules non liées et faiblement attachées. Ensuite, l’échantillon est fixé à une cellule liquide équipée d’une sonde appropriée. Cet ensemble est chargé sur le scanner.Après avoir rempli la cellule liquide avec une solution tampon, engagez l’extrémité avec l’échantillon et commencez le balayage. En fin de compte, la microscopie à force atomique incorpore une force maximale. La cartographie quantitative des propriétés nanomécaniques est utilisée pour collecter des images d’une protéine photoréceptrice unique à la surface de l’échantillon.La microscopie à force atomique qui intègre les forces maximales q et m peut répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie moléculaire, telles que quelles sont les caractéristiques structurelles et chimiques importantes qui déterminent la fonction des macromolécules biologiquement actives. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes actuelles telles que la RMN et la cristallographie aux rayons X est qu’elle permet d’obtenir des images à haute résolution de protéines intactes et d’autres macromolécules biologiques dans un environnement biologiquement pertinent. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode ont du mal car le réglage de la sonde et de la solution nécessite plusieurs étapes, dont certaines sont assez complexes.Avec les logiciels automatisés et les logiciels automatisés, plusieurs de ces étapes sont simplifiées, ce qui facilite grandement le processus pour les nouveaux utilisateurs et les étudiants de premier cycle. Trois étudiants de premier cycle de mon laboratoire de recherche, Marie Kroger, Blair Sorenson et Jessica Thomas, feront la démonstration de cette procédure. Ces étudiants poursuivront des études supérieures dans les domaines de la microbiologie, du génie chimique et de la chimie au cours de la prochaine année.Ces éléments doivent être activés dans un ordre spécifique. D’abord, l’ordinateur, puis le contrôleur, et enfin, la lumière à fibre optique. Le microscope doit lire un FM et un LF fm.La caméra doit être centrée sur la tête optique FM du logiciel. Les éléments suivants doivent être sélectionnés. La catégorie d’expérience est celle des propriétés mécaniques.Le groupe d’expériences est la cartographie nanomécanique quantitative, et l’expérience est la force de crête q et m dans un fluide. Une fois les paramètres correctement sélectionnés, l’expérience peut être chargée et configurée. La mise au point de la caméra doit d’abord être réglée à l’aide de l’objectif Z, suivie de l’utilisation des commandes de parcours pour positionner la platine, l’objectif est de placer l’ouverture de la tête A FM un millimètre avant la surface de la scène pour manipuler les disques d’échantillon avec du mica fraîchement clivé et des pinces à épiler à disque circulaire.Commencez par assembler la cellule de fluide à partir de pièces parfaitement nettoyées. Tout d’abord, fixez l’adaptateur de tuyau à l’orifice des cellules de fluide propres. Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler à tête plate, appuyez très doucement sur le joint torique dans son indentation sur la cellule de fluide.Ensuite, sur le clip de retenue de la sonde, appuyez légèrement sur le ressort et tournez-le pour l’éloigner de la rainure. À l’aide de la même pince à épiler, saisissez la sonde et faites-la glisser dans la rainure, de sorte que la pointe soit tournée vers le centre de la cellule. Fixez ensuite la sonde à l’aide du clip.L’étape suivante consiste à vérifier que la pince sur le FM.It A doit être complètement rétractée. Placez l’ensemble vers le bas sur le dessus de l’échantillon. Montez l’ensemble sur les goujons de l’A FM pour la stabilisation.Abaissez la pince. Pour inspecter le joint torique, appuyez sur l’interrupteur vers le bas du microscope jusqu’à ce que le joint torique soit visible. Il doit être fermement comprimé entre le disque de support et la cellule de fluide.La cellule de fluide peut être mise au point à l’aide du bouton de réglage grossier. Ensuite, à l’aide du réglage XY, concentrez-vous sur la pointe de la sonde. Il ressemble à un triangle doré métallique.À l’aide du levier pizo vers le bas, déplacez la pointe près de la surface de l’échantillon, ajustez la mise au point sur les pointes, la réflexion et surveillez la position des porte-à-faux par rapport à cette réflexion. À l’heure actuelle, ils devraient être étroitement alignés, mais ne pas se chevaucher complètement. Maintenant, préparez la seringue.Remplissez-le d’un millilitre de solution tampon et fixez l’adaptateur. Fixez ensuite la seringue au tuyau d’éjection et déployez complètement le piston. Ensuite, fixez le tuyau à la cellule de fluide à l’aide d’un adaptateur pour remplir la chambre, appuyez doucement sur le piston jusqu’à ce que le centre de la chambre soit plein.Il ne doit pas y avoir de bulles d’air ou de déversement de la cellule de fluide sur le microscope. Placez ensuite la seringue dans une position bien soutenue au-dessus de la chambre. Ensuite, utilisez le flux de la caméra et les boutons de traduction XY.Pour localiser le laser à l’écran, il doit apparaître sous la forme d’un point rouge diffus. Une fois localisé, utilisez les commandes laser pour le déplacer vers la sonde. Enfin, ajustez les commandes du laser et du miroir jusqu’à ce que la somme des signaux sur le microscope soit maximisée entre quatre et six, ajustez la diode du quadrant.Ensuite, utilisez les boutons de la tête de balayage pour ajuster les déviations verticales et horizontales jusqu’à ce que les valeurs sur le microscope reviennent aussi proches que possible de zéro. Assurez-vous de sélectionner les options d’acquisition appropriées avant de continuer. Réglez la vitesse de balayage sur environ un hertz dans la fenêtre des échantillons par ligne.Entrez 256. Pour le contrôle automatique de l’assistance au balayage. Sélectionnez l’individu pour l’assistance au balayage auto Z limite, sélectionnez off.La limite Z doit être de 500 nanomètres et la taille du balayage doit être d’un micron. Une fois les paramètres correctement réglés, mesurez la sonde. Observez le changement de tension du pazo Z lorsque la pointe de la sonde s’approche de la surface.Si la pointe sort de la plage, retirez-la et rapprochez-la, il peut être nécessaire de remplacer la pointe de la sonde. Si cela ne fonctionne pas, lorsque la pointe est enclenchée, des lignes doivent apparaître sur chacune des fenêtres d’acquisition, et ces lignes construiront une image. Commencer la capture continue d’images du mica.Zoomez lentement pour vous assurer que la surface MICA est à la fois plane et propre. Préparez une boîte de Pétri à quatre chambres avec une solution tampon d’imagerie réfrigérée. Chaque chambre a besoin d’au moins cinq millilitres.Avant de prélever une aliquote de protéine diluée, remuez doucement avec la micro-pipette. Ensuite, prenez une aliquote de 200 microlitres et appliquez la protéine diluée sur la surface MICA. Attendez environ 30 secondes pour que la solution reste à la surface.Ensuite, à l’aide des pinces à disque, soulevez le disque sans l’incliner et plongez-le immédiatement dans le premier bassin de solution tampon. Pendant une seconde, assurez-vous que le disque reste parallèle au banc. Il est très important de garder l’échantillon parallèle à la boîte de Pétri pendant l’étape de rinçage.Ces molécules molles et flexibles peuvent être déformées en surface par de forts courants de solution aqueuse. Ensuite, plongez brièvement le disque dans chacune des trois autres flaques pendant une seconde par flaque. Transférez ensuite le disque sur un chiffon sec et sans poussière.Laissez l’excès d’humidité se transférer sur le chiffon, mais ne laissez pas le disque sécher complètement. Ne laissez pas le chiffon toucher l’échantillon Retirez délicatement l’échantillon du tissu à l’aide des pinces à disque et placez l’échantillon sur le scanner A FM. Placez la cellule de fluide sur l’échantillon et procédez à la configuration et à l’imagerie.Une fois que tous les paramètres de la sonde ont été définis, la taille du ressort et le rayon de la pointe sont correctement réglés. Mesurez la sonde comme lors de l’imagerie. Michée, observe l’azoïque ZP lorsque la pointe s’approche de la surface.Lorsque vous prenez des images, laissez le scanner imager la même zone pendant au moins deux passages consécutifs. Utilisez la capture continue pour enregistrer chaque image. Ajustez la taille et l’emplacement de l’image comme vous le souhaitez.Une fois que le logiciel automatisé a fini d’ajuster les paramètres de numérisation pour une taille d’image particulière. Désactivez le logiciel pour qu’il soit correct. Réglez manuellement la mise au point de l’image, ajustez la vitesse de balayage, la limite Z, le nombre de lignes et le point de consigne.Si l’image devient trop floue, rallumez le logiciel pour revenir à la position de départ d’origine. Tout en zoomant sur une protéine, diminuez la vitesse de balayage et augmentez le nombre de lignes proportionnellement afin d’augmenter la résolution de l’image. Plus tard. Lors de l’analyse des images, aplatissez d’abord l’image en cliquant sur l’icône d’aplatissement.Sélectionnez l’ordre zéro et exécutez l’opération. Parfois, il est nécessaire d’utiliser un ajustement uni pour obtenir des images suffisamment plates. Sélectionnez l’icône d’ajustement simple et utilisez le curseur pour dessiner un plan sur une zone plane de l’image.Exécutez l’ajustement simple et répétez l’opération si nécessaire. Ensuite, sélectionnez l’onglet de la section efficace pour mesurer les dimensions de la protéine. Tracez une ligne avec le curseur sur la molécule ou la zone à analyser.Répétez ce processus dans plusieurs zones. Si un recouvrement est souhaité, n’importe quel nombre de molécules biologiques peut être étudié à l’aide d’un FM pour une protéine photoréceptrice dans son état adapté à la lumière, un substrat de micas fraîchement clivé est une surface plane appropriée pour l’absorption des protéines. Des dimères de protéines photorécepteurs uniques ont été observables en utilisant le mode QNM de force de pointe.Les flèches indiquent des dimères individuels et l’astérisque indique un agrégat de protéines à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Les coupes efficaces des protéines peuvent être mesurées après l’aplatissement de l’image. Les données XY sont corrélées aux mesures de hauteur.Ceux-ci peuvent être utilisés pour une variété de calculs. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure de mettre en place une expérience A FM pour collecter des images haute résolution de protéines sur une surface dans un environnement biologiquement pertinent. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures environ.Par conséquent, la force de crête q et m est une forme appropriée de microscopie à force atomique à présenter aux étudiants de premier cycle inscrits à des cours de laboratoire tels que l’analyse instrumentale, la biochimie et la physique moderne. Après son développement, cette méthode a permis aux chercheurs dans le domaine de la microscopie à sonde à balayage d’explorer des molécules biologiques telles que des protéines, des acides nucléiques et même des cellules vivantes dans des milieux biologiquement pertinents.

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Source : Kulkarni, M. et al. Imagerie Ca2+ Dynamique dans les terminaux axonaux des photorécepteurs coniques de la rétine de la souris. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo montre l’utilisation de la microscopie à deux photons pour surveiller la dynamique calcique dans les photorécepteurs coniques d’une rétine de souris transgénique. Il décrit les étapes de préparation des coupes rétiniennes, d’imagerie des biocapteurs de calcium basés sur FRET et d’analyse des changements de fluorescence pour...

Microscopie à deux photons pour la surveillance de la dynamique calcique dans les photorécepteurs coniques rétiniens de souris

Nous décrivons une technique permettant de mesurer simultanément la cinétique de liaison du récepteur unique et du ligand régulée par la force et l’imagerie en temps réel de la signalisation calcique dans un seul lymphocyte T.

Fluorescence Biomembrane la Force Probe: quantification simultanée de Kinetics récepteur-ligand et induits Reliure-signalisation intracellulaire sur une cellule unique

Un certain nombre de biocapteurs de force basés sur FRET ont récemment été développés, permettant la résolution spécifique des protéines de la force intracellulaire. Dans ce protocole, nous démontrons comment l’un de ces capteurs, conçu pour l’agent de liaison de la protéine du complexe nucléosquelette-cytosquelette (LINC) Nesprin-2G, peut être utilisé pour mesurer les forces de l’actomyosine sur le complexe nucléaire LINC.

Un protocole pour l&#39;utilisation Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force biocapteurs pour mesurer les forces mécaniques à travers le complexe nucléaire LINC

Nous décrivons les modalités et les stratégies pour mesurer les propriétés mécaniques et les voies qui se déroule mécaniques unique de molécules de protéines à l’aide d’un microscope à force atomique. Nous montrons également des résultats représentatifs comme référence pour la sélection et la justification des enregistrements de molécule de protéine seule bonne.

Spectroscopie de force unique de molécules de protéines à l’aide d’un Microscope à Force atomique

Nous présentons ici un protocole pour l’utilisation simultanée de Förster resonance capteurs tension axée sur le transfert de l’énergie pour mesurer la récupération de charge et de fluorescence de protéine après photoblanchiment pour mesurer la dynamique des protéines permettant la mesure de force-sensibles dynamique des protéines dans des cellules vivantes.

Mesure de la dynamique des protéines sensibles à la Force dans les cellules vivantes à l’aide d’une combinaison de Techniques Fluorescent

Présenté ici est un protocole complet pour effectuer des expériences de serrage de force ultrarapide sur des moteurs de myosine-5 processive, qui pourrait être facilement étendu à l’étude d’autres classes de moteurs processifs. Le protocole détaille toutes les étapes nécessaires, de la configuration de l’appareil expérimental à la préparation des échantillons, en passant par l’acquisition et l’analyse des données.

Dissection des propriétés mécanoenzymatiques des myosines processives avec la spectroscopie ultrarapide à pince de force

Nous présentons ici un protocole pour étudier les propriétés mécaniques intracellulaires de cellules embryonnaires isolées de poisson-zèbre en confinement tridimensionnel avec mesure directe de la force par un piège optique.

Mesures de force directe de la mécanique subcellulaire en confinement à l’aide de pinces optiques

Nous présentons ici un protocole pour reconstituer des faisceaux de microtubules in vitro et quantifier directement les forces exercées en leur sein en utilisant le piégeage optique simultané et la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale. Ce test permet de mesurer à l’échelle nanométrique les forces et les déplacements générés par les ensembles de protéines au sein de réseaux de microtubules actifs.

Mesure directe des forces dans les faisceaux de microtubules actifs reconstitués

Ici, nous décrivons une pince magnétique à haute vitesse qui effectue des mesures nanomécaniques sur des biomolécules sensibles à la force à la vitesse maximale de 1,2 kHz. Nous introduisons son application aux épingles à cheveux à ADN et aux complexes SNARE en tant que systèmes modèles, mais elle sera également applicable à d’autres molécules impliquées dans des événements mécanobiologiques.

Pinces magnétiques à grande vitesse pour les mesures nanomécaniques sur des éléments sensibles à la force

Ici, nous montrons le protocole d’imagerie pour l’observation des interactions biomoléculaires avec le tapping photothermique hors résonance (PORT), où nous avons optimisé les paramètres d’imagerie, identifié les limites du système et étudié les améliorations potentielles dans l’imagerie de l’assemblage de motifs d’ADN en étoile à trois points.

Imagerie par microscopie à force atomique à grande vitesse de l’auto-assemblage du motif d’étoile à trois points d’ADN à l’aide d’un tapotement photothermique hors résonance

Découvrez la microscopie à force atomique avec PF-QNM pour imager les dimères de photorécepteurs protéiques sur mica. Cette méthode offre des images haute résolution dans un environnement biologique pertinent.

Microscopie à force atomique de Red-Light photorécepteurs Utilisation de lassociation PeakForce quantitative nanomécanique propriété (Vidéo) | JoVE Journal

Microscopie à force atomique de Red-Light photorécepteurs Utilisation de l'association PeakForce quantitative nanomécanique propriété

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