Microscopie à force atomique de Red-Light photorécepteurs Utilisation de l'association PeakForce quantitative nanomécanique propriété

L’objectif global de cette procédure est de collecter des images à haute résolution des protéines photoréceptrices à l’aide de la microscopie à force atomique. Pour ce faire, on obtient d’abord un échantillon du photorécepteur et on le dilue. La deuxième étape consiste à appliquer l’échantillon de protéines sur une surface de mica fraîchement clivée et propre pendant environ 30 secondes.

Ensuite, le MICA est rincé avec un tampon pour éliminer les molécules non liées et faiblement attachées. Ensuite, l’échantillon est fixé à une cellule liquide équipée d’une sonde appropriée. Cet ensemble est chargé sur le scanner.

Après avoir rempli la cellule liquide avec une solution tampon, engagez l’extrémité avec l’échantillon et commencez le balayage. En fin de compte, la microscopie à force atomique incorpore une force maximale. La cartographie quantitative des propriétés nanomécaniques est utilisée pour collecter des images d’une protéine photoréceptrice unique à la surface de l’échantillon.

La microscopie à force atomique qui intègre les forces maximales q et m peut répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie moléculaire, telles que quelles sont les caractéristiques structurelles et chimiques importantes qui déterminent la fonction des macromolécules biologiquement actives. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes actuelles telles que la RMN et la cristallographie aux rayons X est qu’elle permet d’obtenir des images à haute résolution de protéines intactes et d’autres macromolécules biologiques dans un environnement biologiquement pertinent. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode ont du mal car le réglage de la sonde et de la solution nécessite plusieurs étapes, dont certaines sont assez complexes.

Avec les logiciels automatisés et les logiciels automatisés, plusieurs de ces étapes sont simplifiées, ce qui facilite grandement le processus pour les nouveaux utilisateurs et les étudiants de premier cycle. Trois étudiants de premier cycle de mon laboratoire de recherche, Marie Kroger, Blair Sorenson et Jessica Thomas, feront la démonstration de cette procédure. Ces étudiants poursuivront des études supérieures dans les domaines de la microbiologie, du génie chimique et de la chimie au cours de la prochaine année.

Ces éléments doivent être activés dans un ordre spécifique. D’abord, l’ordinateur, puis le contrôleur, et enfin, la lumière à fibre optique. Le microscope doit lire un FM et un LF fm.

La caméra doit être centrée sur la tête optique FM du logiciel. Les éléments suivants doivent être sélectionnés. La catégorie d’expérience est celle des propriétés mécaniques.

Le groupe d’expériences est la cartographie nanomécanique quantitative, et l’expérience est la force de crête q et m dans un fluide. Une fois les paramètres correctement sélectionnés, l’expérience peut être chargée et configurée. La mise au point de la caméra doit d’abord être réglée à l’aide de l’objectif Z, suivie de l’utilisation des commandes de parcours pour positionner la platine, l’objectif est de placer l’ouverture de la tête A FM un millimètre avant la surface de la scène pour manipuler les disques d’échantillon avec du mica fraîchement clivé et des pinces à épiler à disque circulaire.

Commencez par assembler la cellule de fluide à partir de pièces parfaitement nettoyées. Tout d’abord, fixez l’adaptateur de tuyau à l’orifice des cellules de fluide propres. Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler à tête plate, appuyez très doucement sur le joint torique dans son indentation sur la cellule de fluide.

Ensuite, sur le clip de retenue de la sonde, appuyez légèrement sur le ressort et tournez-le pour l’éloigner de la rainure. À l’aide de la même pince à épiler, saisissez la sonde et faites-la glisser dans la rainure, de sorte que la pointe soit tournée vers le centre de la cellule. Fixez ensuite la sonde à l’aide du clip.

L’étape suivante consiste à vérifier que la pince sur le FM.It A doit être complètement rétractée. Placez l’ensemble vers le bas sur le dessus de l’échantillon. Montez l’ensemble sur les goujons de l’A FM pour la stabilisation.

Abaissez la pince. Pour inspecter le joint torique, appuyez sur l’interrupteur vers le bas du microscope jusqu’à ce que le joint torique soit visible. Il doit être fermement comprimé entre le disque de support et la cellule de fluide.

La cellule de fluide peut être mise au point à l’aide du bouton de réglage grossier. Ensuite, à l’aide du réglage XY, concentrez-vous sur la pointe de la sonde. Il ressemble à un triangle doré métallique.

À l’aide du levier pizo vers le bas, déplacez la pointe près de la surface de l’échantillon, ajustez la mise au point sur les pointes, la réflexion et surveillez la position des porte-à-faux par rapport à cette réflexion. À l’heure actuelle, ils devraient être étroitement alignés, mais ne pas se chevaucher complètement. Maintenant, préparez la seringue.

Remplissez-le d’un millilitre de solution tampon et fixez l’adaptateur. Fixez ensuite la seringue au tuyau d’éjection et déployez complètement le piston. Ensuite, fixez le tuyau à la cellule de fluide à l’aide d’un adaptateur pour remplir la chambre, appuyez doucement sur le piston jusqu’à ce que le centre de la chambre soit plein.

Il ne doit pas y avoir de bulles d’air ou de déversement de la cellule de fluide sur le microscope. Placez ensuite la seringue dans une position bien soutenue au-dessus de la chambre. Ensuite, utilisez le flux de la caméra et les boutons de traduction XY.

Pour localiser le laser à l’écran, il doit apparaître sous la forme d’un point rouge diffus. Une fois localisé, utilisez les commandes laser pour le déplacer vers la sonde. Enfin, ajustez les commandes du laser et du miroir jusqu’à ce que la somme des signaux sur le microscope soit maximisée entre quatre et six, ajustez la diode du quadrant.

Ensuite, utilisez les boutons de la tête de balayage pour ajuster les déviations verticales et horizontales jusqu’à ce que les valeurs sur le microscope reviennent aussi proches que possible de zéro. Assurez-vous de sélectionner les options d’acquisition appropriées avant de continuer. Réglez la vitesse de balayage sur environ un hertz dans la fenêtre des échantillons par ligne.

Entrez 256. Pour le contrôle automatique de l’assistance au balayage. Sélectionnez l’individu pour l’assistance au balayage auto Z limite, sélectionnez off.

La limite Z doit être de 500 nanomètres et la taille du balayage doit être d’un micron. Une fois les paramètres correctement réglés, mesurez la sonde. Observez le changement de tension du pazo Z lorsque la pointe de la sonde s’approche de la surface.

Si la pointe sort de la plage, retirez-la et rapprochez-la, il peut être nécessaire de remplacer la pointe de la sonde. Si cela ne fonctionne pas, lorsque la pointe est enclenchée, des lignes doivent apparaître sur chacune des fenêtres d’acquisition, et ces lignes construiront une image. Commencer la capture continue d’images du mica.

Zoomez lentement pour vous assurer que la surface MICA est à la fois plane et propre. Préparez une boîte de Pétri à quatre chambres avec une solution tampon d’imagerie réfrigérée. Chaque chambre a besoin d’au moins cinq millilitres.

Avant de prélever une aliquote de protéine diluée, remuez doucement avec la micro-pipette. Ensuite, prenez une aliquote de 200 microlitres et appliquez la protéine diluée sur la surface MICA. Attendez environ 30 secondes pour que la solution reste à la surface.

Ensuite, à l’aide des pinces à disque, soulevez le disque sans l’incliner et plongez-le immédiatement dans le premier bassin de solution tampon. Pendant une seconde, assurez-vous que le disque reste parallèle au banc. Il est très important de garder l’échantillon parallèle à la boîte de Pétri pendant l’étape de rinçage.

Ces molécules molles et flexibles peuvent être déformées en surface par de forts courants de solution aqueuse. Ensuite, plongez brièvement le disque dans chacune des trois autres flaques pendant une seconde par flaque. Transférez ensuite le disque sur un chiffon sec et sans poussière.

Laissez l’excès d’humidité se transférer sur le chiffon, mais ne laissez pas le disque sécher complètement. Ne laissez pas le chiffon toucher l’échantillon Retirez délicatement l’échantillon du tissu à l’aide des pinces à disque et placez l’échantillon sur le scanner A FM. Placez la cellule de fluide sur l’échantillon et procédez à la configuration et à l’imagerie.

Une fois que tous les paramètres de la sonde ont été définis, la taille du ressort et le rayon de la pointe sont correctement réglés. Mesurez la sonde comme lors de l’imagerie. Michée, observe l’azoïque ZP lorsque la pointe s’approche de la surface.

Lorsque vous prenez des images, laissez le scanner imager la même zone pendant au moins deux passages consécutifs. Utilisez la capture continue pour enregistrer chaque image. Ajustez la taille et l’emplacement de l’image comme vous le souhaitez.

Une fois que le logiciel automatisé a fini d’ajuster les paramètres de numérisation pour une taille d’image particulière. Désactivez le logiciel pour qu’il soit correct. Réglez manuellement la mise au point de l’image, ajustez la vitesse de balayage, la limite Z, le nombre de lignes et le point de consigne.

Si l’image devient trop floue, rallumez le logiciel pour revenir à la position de départ d’origine. Tout en zoomant sur une protéine, diminuez la vitesse de balayage et augmentez le nombre de lignes proportionnellement afin d’augmenter la résolution de l’image. Plus tard. Lors de l’analyse des images, aplatissez d’abord l’image en cliquant sur l’icône d’aplatissement.

Sélectionnez l’ordre zéro et exécutez l’opération. Parfois, il est nécessaire d’utiliser un ajustement uni pour obtenir des images suffisamment plates. Sélectionnez l’icône d’ajustement simple et utilisez le curseur pour dessiner un plan sur une zone plane de l’image.

Exécutez l’ajustement simple et répétez l’opération si nécessaire. Ensuite, sélectionnez l’onglet de la section efficace pour mesurer les dimensions de la protéine. Tracez une ligne avec le curseur sur la molécule ou la zone à analyser.

Répétez ce processus dans plusieurs zones. Si un recouvrement est souhaité, n’importe quel nombre de molécules biologiques peut être étudié à l’aide d’un FM pour une protéine photoréceptrice dans son état adapté à la lumière, un substrat de micas fraîchement clivé est une surface plane appropriée pour l’absorption des protéines. Des dimères de protéines photorécepteurs uniques ont été observables en utilisant le mode QNM de force de pointe.

Les flèches indiquent des dimères individuels et l’astérisque indique un agrégat de protéines à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Les coupes efficaces des protéines peuvent être mesurées après l’aplatissement de l’image. Les données XY sont corrélées aux mesures de hauteur.

Ceux-ci peuvent être utilisés pour une variété de calculs. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure de mettre en place une expérience A FM pour collecter des images haute résolution de protéines sur une surface dans un environnement biologiquement pertinent. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures environ.

Par conséquent, la force de crête q et m est une forme appropriée de microscopie à force atomique à présenter aux étudiants de premier cycle inscrits à des cours de laboratoire tels que l’analyse instrumentale, la biochimie et la physique moderne. Après son développement, cette méthode a permis aux chercheurs dans le domaine de la microscopie à sonde à balayage d’explorer des molécules biologiques telles que des protéines, des acides nucléiques et même des cellules vivantes dans des milieux biologiquement pertinents.