Name: La production et le ciblage des monovalent Quantum Dots (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Apprenez à préparer des quantum dots monovalents ciblés pour l'imagerie de molécules uniques de protéines membranaires dans des cellules vivantes. Cette méthode simplifiée utilise l'ADN phosphorothioate et facilite le suivi de particules uniques.

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Le financement accordé par le DOD W81XWH-01.10.1023 (ZJG), subvention P50 GM081879 du Centre UCSF pour les systèmes et la biologie synthétique (ZJG), NIH 5R21EB015088-02 (YJ) et NIH 1R21EB018044 (ZJG &amp; YJ). DS a été soutenu par le programme Human Frontier Science croisée postdoc disciplinaire bourse de recherche.

1 Production de monovalent Quantum Dots <ol><li> transfert de la phase de boîtes quantiques de organique à la phase aqueuse <ol><li> Diluer 200 ul d&#39;une solution à 1 M de points quantiques de la phase organique avec 400 pi de chloroforme dans un flacon de 5 ml en verre. </li><li> Mélanger 400 ul d&#39;une solution 0,3 M de bromure de tétrabutylammonium (TBAB) de chloroforme avec 36 ul de mPEG pur thiol (CH 3 O (CH 2 CH 2 O) 6 C 2 H 5 SH) et agiter O / N. </li><li> Ajouter 800 ul d&#39;une solution aqueuse 0,2 M de NaOH et agiter pendant 30 secondes. Un transfert de phase se produit au bout de quelques minutes, indiqués par le transfert des particules colorées dans la phase aqueuse au-dessus de la phase organique dense. </li><li> Si les particules se rassemblent dans une troisième phase entre les phases aqueuse et organique, augmenter le temps d&#39;incubation avec le thiol mPEG. Si la phase aqueuse reste clair, les points quantiques n&#39;ont pas transfert de phase (voir figure 3A). Sinon, augmenter la concentration de mPEG thiol à l&#39;étape 2 pour alléger transfert de phase pauvres. </li><li> Récupérer le (couleur) phase aqueuse, puis concentrer les boîtes quantiques recueillies avec une colonne Centricon de spin (30 kDa de poids moléculaire de coupure) à 1 ml. </li><li> Ajouter la solution de QD concentré dans une colonne de Sephadex NAP10 pré-équilibrée avec du tampon Tris 10 mM contenant 30 mM de NaCl (pH 8,0). On élue les points quantiques avec 1,5 ml de tampon d&#39;élution par un écoulement par gravité. </li><li> Mesurer la concentration de boîtes quantiques par spectroscopie d&#39;absorption à 350 nm. </li></ol></li><li> Préparation de mQDs <ol><li> Achat (ou synthétiser) ptDNA. Ce protocole utilise la séquence 5&#39;-A S 50 (CT) 10 (ACTG) 5 -3 &#39;(voir le tableau 1). </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> ADN </td><td> Séquence </td></tr><tr><td> 5&#39;-A S 50 (CT) 10 (ACTG) 5 </sub&gt; -3 &#39; </td><td> A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACTGACTGACTGACTGACTG </td></tr><tr><td> 5&#39;-NH 2 - (CT) 10 (CAGT) 5 -3 &#39; </td><td> NH 2 - / C6spacer / CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGT </td></tr><tr><td> BG-ADN </td><td> BG- / C6spacer / CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGT </td></tr></tbody></table> Tableau 1: séquences d&#39;ADN et utilisés pour produire des mQDs cibles. <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> Préparer 1 ml d&#39;une solution de QD 100 nM dans du tampon Tris 10 mM contenant 30 mM de NaCl (pH 8). </li><li> Ajoutez goutte à goutte 500 pi de la solution 100 nM ptDNA aux boîtes quantiques aqueuses pendant 1 min en remuant énergiquement. Mélanger ou placer sur un agitateur pendant une 9 heures supplémentaires. Remarque: Ce devrait théoriquement produire un rapport de 1: 2 de ptDNA: QD. Cependant, la stoechiométrie réelle n&#39;est jamais parfaite - habituellement le résultat est proche de 1: 1,5. Afin de produire un rapport de 1: 1 de ptDNA: QD, densitométrie après électrophorèse en gel est nécessaire de quantifier le rapport exact de conjugaison compte tenu des volumes connus utilisés ci-dessus. </li><li> Retirez ~ 10 pl du mélange de QD pour fonctionner sur un gel d&#39;agarose analytique. Retirez également une concentration similaire de points quantiques non conjugués en phase aqueuse (de l&#39;étape 1.2.1). <ol><li> Ajouter ~ 2 μ, L de tampon de charge 6x Ficoll (pour augmenter la densité de la solution) et d&#39;exécuter ces deux échantillons en même temps sur un gel à 0,8% en poids / volume d&#39;agarose dans un tampon de borate de sodium pendant 15 min à 150 V. Une seule bande de la voie de commande non conjugué migrer à proximité le bien, et deux bandes dans la voie de QDs conjugués sont considérés (voir gels dans la figure 2B). </li></ol></li><li> Calculer la fraction QD non conjugué en utilisant l&#39;intensité relative des deux bandes (voir l&#39;équation de la figure 2B). Puis, utilisez la fraction de calculer le volume supplémentaire de 100 nM solution ptDNA nécessaire pour correspondre au nombre de points quantiques. </li><li> Répétez les étapes 1.2.3 à 1.2.5 une fois de plus avec ce volume calculé ou jusqu&#39;à ce que l&#39;effondrement dans une seule bande de QDs conjugués sur le gel indiquant conjugaison complète de tous les points quantiques. </li><li> Ajouter 100 ul de 10 mM (CO 2 H) CH 2 O (CH 2 CH 2 O) 6 C 11 H 23 SH (carboxy PEG6 alcane thiol) dans 10 mM Tris tampon containing 30 mM de NaCl (pH 8) pour les mQDs conjugués produits ci-dessus, et agiter pendant 10 min. Remarque: Ces ligands PEG passivent la surface de QD. A plus PEG sera mieux passiver les points quantiques, cependant, il permettra également d&#39;augmenter leur taille. La fonctionnalité alcane thiol hydrophobe a une affinité beaucoup plus élevée pour les points quantiques, dans l&#39;ensemble, à moins hydrophobe PEG-thiol utilisé pour le transfert de phase. Par conséquent, ne laissez pas cette étape pour poursuivre trop longtemps ou la ptDNA sera remplacé par l&#39;alcane-PEG-thiol. Après une incubation ~ 30 min, une fraction importante de l&#39;ADN aura été déplacé à partir des points quantiques (figure 3B). </li><li> Pour supprimer alcane-thiol PEG excès, ajouter 0,5 ml de la solution de QD une colonne Sephadex NAP5 de pré-équilibrée avec un tampon d&#39;élution (tampon Tris 10 mM contenant 30 mM de NaCl). Recueillir les mQDs avec 1,0 ml de tampon d&#39;élution par écoulement gravitaire. </li><li> Concentrer les boîtes quantiques recueillies avec une colonne Centricon de spin (30 kDa). Conservez ces mQDs à 4 ° C pendant des mois. Ne frEEZE eux. Remarque: Si une pastille colorée dans la partie inférieure du tube est considéré, les points sont regroupés et sont susceptibles de ne plus utilisable. </li></ol> 2 Production de ciblage (Benzylguanine-) ADN <ol><li> Produire ou d&#39;acheter de l&#39;ADN à terminaison amine. Ce protocole utilise la séquence 5&#39;-NH 2 - (PM), 10 - (CAGT) 5 -3 &#39;(voir tableau 1). L&#39;éditeur de liens poly-CT augmente l&#39;accessibilité aux fonctionnalités enfoui au plus profond dans le glycocalyx mais ne peut pas être nécessaire pour toutes les applications. Si on a accès à un synthétiseur d&#39;ADN, produire de l&#39;ADN amino-modifié à l&#39;aide d&#39;un 5 &#39;amino-modificateur (5&#39; approprié amino-modificateur C6). </li><li> Dissoudre BG-N-hydroxysuccinimide (NHS-BG) dans le diméthylsulfoxyde sec (DMSO) à une concentration de 10 mg / ml. Remarque: BG-NHS va absorber l&#39;eau de l&#39;air et de conduire à une hydrolyse de l&#39;ester de NHS-réactif, en particulier dans des solvants hygroscopiques tels que le DMSO et le diméthylformamide (DMF). BG-NHS est le meilleur magasind à -80 ° C sous forme de poudre dans son flacon dans un récipient contenant un produit déshydratant secondaire. Réchauffer à température ambiante avant d&#39;ouvrir le flacon. Alternativement, aliquoter immédiatement à usage unique de l&#39;ester BG-NHS dans un solvant polaire sec et congeler à -80 ° C, ou de réagir pleinement avec l&#39;ADN d&#39;amine dans l&#39;étape 2.2. </li><li> Réagir en mélangeant le BG-NHS dans du DMSO à l&#39;étape 2.1 de l&#39;ADN à terminaison amine dans de l&#39;HEPES (4-(2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic) tamponnée (pH 8,5) de l&#39;eau. Dans une réaction typique de 20 pi de 10 mg / ml BG-NHS dans du DMSO avec 2 ul de 2 mM de NH 2 - (PM), 10 - (CAGT) 5 à 58 pl d&#39;eau désionisée avec 20 pi de tampon de 0,5 M de HEPES pH 8,5. Réaliser des réactions dans un tube de 1,5 ml. Mélanger rapidement que la réaction se déroule rapidement et doit rivaliser avec hydrolyse NHS-ester. </li><li> Soniquer pendant 5-10 min pour bien mélanger. Incuber ~ 1 heure à température ambiante. Le rapport stoechiométrique de BG: ADN peut être modifiée pour conduire la réaction à son terme. </li><li&gt; dessaler la réaction en utilisant une colonne NAP5 standard en mM d&#39;acétate de 100 triéthylamine (TEAA, pH 7). </li><li> Purifier le BG-ADN à partir de l&#39;aminé n&#39;ayant pas réagi par l&#39;ADN-HPLC en phase inverse exécutant une TEAA 100 mM: acétonitrile (ACN), gradient de 8% à 95% d&#39;acétonitrile en 30 min. L&#39;amine-ADN n&#39;ayant pas réagi éluera avant l&#39;ADN BG. Recueillir la fraction BG-ADN dans un tube conique. <ol><li> Utilisez une colonne C 18 Zorbax pour la purification d&#39;oligonucléotides standard et le gradient suivant: 0 → 15 min: 8 → 30% d&#39;ACN; 15 → 21 min: 30-90% d&#39;ACN; 21 → 25 min: 90 → 8% d&#39;ACN; 25 → 30 min: 8% d&#39;ACN; </li></ol></li><li> Congeler dans l&#39;azote liquide et lyophiliser la fraction recueillie. Remettre en suspension l&#39;ADN dans de l&#39;eau déminéralisée. Pour être très prudent, lyophiliser deux fois de plus pour éliminer TEAA résiduelle. TEAA résiduel peut être toxique pour les cellules à des concentrations plus élevées. </li><li> Reprendre le BG-ADN lyophilisé dans l&#39;eau, en s&#39;assurant de laver les côtés de ee tube et diluer à environ 25 uM stock. Aliquote et conserver à 4 ° C. Les échantillons ont été conservés pendant ~ 9 mois sans dégradation notable. </li></ol> 3. cellules étiquetage direct avec monovalent Quantum Dots <ol><li> Eventuellement, passiver les mQDs juste avant une expérience d&#39;imagerie en utilisant des réactifs tels que la caséine (0,5%) ou l&#39;albumine de sérum bovin (BSA, 1 à 3%). </li><li> cellules des plaques exprimant la protéine SNAP-marqué sur le total de fluorescence à réflexion interne (FRBR) verre -quality. Dans cette expérience, nous utilisons une lignée cellulaire U2OS exprimant un récepteur Notch1 SNAP-marqués et les surfaces de verre de haute qualité. </li><li> Après que les cellules ont attaché au verre (~ 24 h), retirer le support de croissance, laver avec du PBS, et incuber les cellules à 10-30 min à température ambiante dans ~ 100-150 pi de PBS ou milieu cellulaire contenant ~ 1 uM BG- ADN de l&#39;étape 2.6 ci-dessus. </li><li> Après incubation avec BG, laver soigneusement les cellules avec du PBS ou milieu cellulaire. Incuber les cellules pendant ~ 5-10 min avec emQDs e produites dans l&#39;étape 1.2.9 (et éventuellement passivation à l&#39;étape 3.1). </li><li> Eventuellement, laver les mQDs non liés et retourner les cellules dans un tampon / media approprié à la fois pour l&#39;imagerie et de la culture. Pour les cellules qui étaient à imager en mode FRBR, une étape de lavage final est souvent inutile car mQDs non traitées dans la solution diffusés si rapidement par rapport à mQDs liées pour être indétectable lors de l&#39;analyse. </li></ol> 4. microscopie et analyse <ol><li> Image les cellules en utilisant un microscope TIRF. Remarque: Le champ doit avoir excitation séparée et filtres d&#39;émission, ou un filtre cube QD personnalisé. QDs sont les meilleurs excité avec un laser de faible longueur d&#39;onde (405 ou 488 nm). QD de diamètre différent ont des longueurs d&#39;onde d&#39;émission caractéristiques, généralement associée à un décalage de grande Stoke. </li><li> En raison de la luminosité de mQDs, recueillir des images à des cadences élevées dans la FRBR tandis que l&#39;imagerie du côté de base d&#39;une cellule vivante. Remarque: Vous pouvez également, la dynamique de molécules uniques peuvent être Follomarier à d&#39;autres plans focaux à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal disque rotatif. Logiciel automatisé de suivi une particule est généralement couronnée de succès à un suivi précis des mQDs lumineuses et photostable. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La modularité de la conception MQD permet un accroissement du niveau de flexibilité expérimentale. Par exemple, une variété de mQDs peuvent être préparés rapidement en couleurs uniques permettant l&#39;imagerie simultanée de multiples cibles. La séquence de ciblage ADN simple brin peut diriger mQDs de protéines, de sucres, de lipides et 12 surfaces 13. Un certain nombre de balises enzymatiques sont disponibles avec des réactivités orthogonales, permettant à plusieurs cibles à imager simultanément avec mQDs différemment ciblées. En plus de cibler avec l&#39;étiquette de SNAP, l&#39;étiquetage des protéines cibles avec mQDs utilisant la balise CLIP, l&#39;étiquette de HALO, et des protéines biotinylées a également été couronnée de succès. Ce protocole montre le marquage spécifique d&#39;un récepteur de surface de cellules vivantes avec ces mQDs, mais le protocole peut être facilement adapté à un certain nombre de contextes différents. L&#39;idée méthodologique important dans la production de mQDs de valence est défini que ~ 50 phosphorothioate-liébases sont nécessaires pour envelopper les boîtes quantiques (et éviter ainsi deux molécules de liaison simultanément). A-Une séquence poly S 50 reproductible et liée de façon stable 605 nm boîtes quantiques de Life Technologies. Bien que ce produit a été abandonné, la stratégie d&#39;exclusion stérique est généralisable à des produits similaires d&#39;autres fournisseurs ayant des tailles différentes, des formes, des propriétés spectrales. L&#39;efficacité et la stabilité des boîtes quantiques ptDNA emballés dépendent essentiellement de la chimie de surface et la structure des boîtes quantiques. Par conséquent, la réussite d&#39;un protocole dépend de la structure chimique et de la source commerciale des points quantiques. Pour les fins du présent protocole, il existe trois principaux points de divergence entre les différentes sources commerciales de boîtes quantiques: une différence dans les conditions nécessaires pour le transfert de phase; une différence dans la force initiale de PEG-thiol-ligand de liaison, peut entraver le déplacement par ptDNA; et une différence dans la quantité de CdSe noyau exposé, qui peut leannonce à la trempe de la QD par les conditions de transfert de phase thiol MPEG. Dès la publication, les points quantiques avec la meilleure structure pour la production de mQDs sont les points quantiques 4-10 nm CdSe / ZnS base / shell achetés auprès de Life Technologies avec des spectres d&#39;émission à 545, 585, 605 et 625 nm (figure 2A). QD basées sur la formulation «Vivid» (545, 605, etc) étanchent lors de l&#39;ajout de mPEG thiol et ne conviennent pas pour cette application. QD de Aldrich et océan Nanotech fonctionnent bien, mais nécessitent des étapes de transfert de phase et plus prétraitement avec de l&#39;oxyde de trioctylphosphine. Ce protocole a été optimisé pour les points quantiques de Life Technologies. La séquence poly-A phosphorothioate utilisé pour envelopper les boîtes quantiques est terminé par une queue d&#39;ADN 20-mère contenant la séquence native de (ACTG) 5 dans laquelle un brin de ciblage peut s&#39;hybrider. Cette séquence est commode, car il a peu ou pas de structure secondaire, et restera hybridized à 37 ° C dans du PBS. Si on a accès à un synthétiseur d&#39;ADN, par la ptDNA peut alors synthétisé et purifié par Chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (HPLC) utilisant une colonne C 8. Le ptDNA éluera plus tard sur la HPLC que oligonucléotides équivalentes à squelette natif. Nous laissons généralement 5 &#39;DMT groupe protecteur sur nos oligonucléotides phosphorothioates après purification. Passivation des boîtes quantiques ptDNA-emballés est généralement nécessaire pour améliorer la stabilité colloïdale des boîtes quantiques et réduire la liaison pour les applications les plus expérimentales fond. Le protocole utilise un PEG-couche de passivation les boîtes quantiques. Carboxy PEG de alcanethiol avec des unités supplémentaires de PEG ((CO 2 H) CH 2 O (CH 2 CH 2 O) 12 C 11 H 23 SH, carboxy-PEG12 alcane thiol) contribuent à réduire de manière significative fond, si les PEG plus sont à la fois plus grande, et généralement plus coûteux. mQDs revêtus de carboxy PEG alkaligands thiols nes sont très stable dans des tampons physiologiques tels que le phosphate tamponnée salines et les milieux de culture. Stockage à long terme (&gt; 8 mois) de mQDs à 4 ° C n&#39;a montré aucune agrégation significative ou détachement ptDNA 11. En fonction de l&#39;expérience, le PEG passivation des points quantiques ne pas toujours seul réduire suffisamment la liaison non spécifique des mQDs. L&#39;incubation des cellules et les deux mQDs dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 3% de BSA pendant 20 minutes avant utilisation permet de réduire sensiblement la liaison non spécifique à des cellules, bien que cela augmente le rayon hydrodynamique apparent des mQDs de ~ 50%. Passivation avec 0,5% de caséine réduit la liaison non spécifique, mais encore elle augmente la taille apparente d&#39;une plus grande mesure que la BSA. L&#39;extrémité 5 &#39;d&#39;un brin d&#39;ADN complémentaire à la mQDs peut être modifié pour permettre le ciblage d&#39;un certain nombre de différentes biomolécules. Il existe un certain nombre de techniques disponibles établies pour modifier de manière covalente les protéines, lipids et des sucres à l&#39;ADN simple brin (ADN simple brin). Tant que l&#39;ADNsb est présentée de façon extracellulaire, il est accessible à mQDs solubles. mQDs avec les séquences ci-dessus seront rapidement s&#39;hybrider avec leur brin d&#39;ADN complémentaire dans des conditions de culture cellulaire. Un 10-20x poly (CT) entretoise entre la ptDNA et la séquence de ciblage peut être nécessaire pour le ciblage efficace de façon à élever la séquence de liaison au-dessus de la glycocalyx épaisse et chargée négativement de la cellule. Pour ce protocole, on a choisi pour produire un ADN-BG avec une séquence complémentaire de (CAGT) 5 qui sera hybridée à la fois aux mQDs covalente et se lier à une protéine SNAP-tag pour le marquage rapide et précis. A fonctions protocolaires similaires bien pour le couplage d&#39;autres esters NHS à oligonucléotides aminés modifiés. Pour l&#39;imagerie de molécules simples, une faible densité de marquage est typiquement nécessaire pour résoudre des molécules individuelles. Une concentration MQD finale de ~ 0,5 nM dans du PBS avec agent de passivationest une bonne cible. Cependant, ces dilutions élevées parfois donné lieu à une sous-marquage des cellules. Si cela se produit, MQD supplémentaire peut être ajouté jusqu&#39;à une densité optimale de marquage n&#39;est observé. Dans le cas de Notch1 humain SNAP-marqués, les concentrations de&gt; 10 nM MQD cellules produites à l&#39;étiquetage denses tandis que 0,5 nM MQD conduit à la fixation de ~ 20 mQDs à la surface de base de cellule cible (voir la figure 4B). étiquetage portable avec mQDs était fortement tributaire de la confluence de cellules étalées. Trop cellules confluentes ne pas étiqueter leurs surfaces de base. En résumé, une méthode simple pour générer monovalent et boîtes quantiques modulaires a été décrite. Ces mQDs trouvent une utilité dans une large gamme d&#39;applications d&#39;imagerie des cellules, tel que démontré par l&#39;imagerie du récepteur Notch sur les cellules vivantes U2OS. Applicabilité de mQDs n&#39;est pas limitée à ce cas particulier, mais peut être étendu à d&#39;autres potentiellement des cibles cellulaires tels que d&#39;autres protéines, acides nucléiques et les enzymes.

La dynamique de molécules uniques sur cellules vivantes contribue à leur fonction biologique. Simple fluorescence de molécules imagerie est une méthode populaire pour étudier la dynamique de molécules uniques sur le 1,2,3 de la surface cellulaire. Cependant, les sondes d&#39;imagerie les plus couramment utilisés dans ces études présentent plusieurs inconvénients importants. Par exemple, les colorants organiques et les protéines fluorescentes conventionnelles offrent luminosité modérée, environ 10 5 à 10 6 M -1 cm -1, mais sont photochimiquement instable, le blanchiment après l&#39;émission de l&#39;ordre de 10 5 -10 6 photons dans les conditions typiques d&#39;imagerie en temps réel des cellules 4,5. En revanche, les nanoparticules semi-conductrices, souvent appelés points quantiques (QD), sont nettement plus brillant et plus stable, avec des coefficients d&#39;extinction dans la gamme de 10 6 à 10 7 M -1 cm -1 et de plus de 10 7 -10 8 photons émis avant photoblENSEIGNEMENT 5. La luminosité améliorée et photostabilité des boîtes quantiques plus de fluorophores organiques permet l&#39;observation de molécules uniques à une accélération significative du taux de trame et trajectoires sur beaucoup plus longtemps 6. Malgré leurs avantages et la disponibilité commerciale, plusieurs engagements restent pour ces agents d&#39;imagerie puissantes. Tout d&#39;abord, ils ont mal défini ciblage valence, ce qui peut entraîner une réticulation des biomolécules cibles 6. Deuxièmement, ils ont généralement une taille hydrodynamique (&gt; 20 nm) qui limite l&#39;accès à certains environnements cellulaires encombrés 7. Troisièmement, ils ont limité le ciblage modularité 7. Plusieurs stratégies ont tenté de répondre à ces problèmes 8,9,10, mais exigent généralement des connaissances et des réactifs spécialisés pour la mise en œuvre. Pour résoudre ces problèmes, nous avons récemment signalé une stratégie «d&#39;exclusion stérique&quot; pour préparer monovalent, petites etmodulaires QD 11. Les points quantiques sont emballés avec un seul polymère ADN phosphorothioate longue (ptDNA). Le ptDNA se lie à la surface par l&#39;intermédiaire d&#39;interactions multiples QD Zn-S entre les atomes de Zn exposées à la surface et les groupes phosphorothioate du polymère ptDNA. Un seul polymère lié de manière électrostatique et stérique exclut la liaison des équivalents supplémentaires du polymère sans augmenter de manière significative la taille globale de la particule (environ 2 nm). Tous les réactifs sont disponibles dans le commerce, les produits sont formés avec un rendement élevé, et le procédé nécessite seulement des étapes de purification de dessalage. Une fois marqué, les points quantiques emballés avec un seul bind ptDNA (mQDs) à des brins d&#39;ADN complémentaires portant ciblant les domaines (par exemple, benzylguanine (BG), benzylcytosine ou alkylhalogénures). Ces fonctionnalités ciblent spécifiquement les mQDs à étiquettes enzymatiques tels que la SNAP, CLIP &amp; HALO qui sont génétiquement fusionnés à la protéine d&#39;intérêt. Il s&#39;agit d&#39;un protocole de synthèse, Le ciblage et l&#39;imagerie des cellules vivantes de mQDs produites par exclusion stérique.

<table><tbody><tr><td colspan="4">mQD Production</td></tr><tr><td>Phosphorothioate DNA :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(A*)x50-(ACTG)x5</td><td>IDT</td><td></td><td>La plupart des sociétés de synthèse d’ADN</td></tr><tr><td>Quantum Dots :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QDots 525, 585, 605 & 625</td><td>Invitrogen</td><td>Q21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605)</td><td>Synthèse QD personnalisée pour QD625.</td></tr><tr><td>QD610</td><td>Ocean Nanotech</td><td>QSP-610-10&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>QD 610 lamda</td><td>Aldrich</td><td>731854</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme, 99,8 %</td> <td>ACROS</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>Bromure de tétrabutylammonium, 98,0 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>426288</td><td></td></tr><tr><td>mPEG thiol [2,5,8,11,14,17,20-Heptaoxadocosane-22-thiol], MW 354,5, 95 %</td> <td>Polypure</td><td>11156-0695</td><td></td></tr><tr><td>HSC11EG6CO2H&nbsp ; [HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH2CO2H]</td><td>ProChimia</td><td>TH 003-m11.n6-0.1</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique, 99,5 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>B0394</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium, 99,0 %</td> <td>ACROS</td><td>S/4845</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium, 98 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>310166</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>U.S. Biotech Sources</td><td>G02PD-125</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459828</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">BG-DNA Production</td></tr><tr><td colspan="4">Amine DNA :</td></tr><tr><td>(CAGT)5-NH2</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>La plupart des entreprises de synthèse d’ADN(</td></tr><tr><td>CAGT)5(T)40-NH2</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>La plupart des sociétés de synthèse d’ADN</td></tr><tr><td>NHS-GLA-Benzylguanine</td><td>New England Biosciences</td><td>S9151</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8428</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>NAP5 Colonne</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0853-01</td><td></td></tr><tr><td>C18 Colonne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Culture cellulaire de mammifères & Imagerie</forte></td></tr><tr><td>Lignée cellulaire exprimant la protéine marquée SNAP</td><td>New England Biosciences</td><td>E9100S</td><td></td></tr><tr><td>McCoys 5A</td><td>UCSF Installation</td><td></td> de culture cellulaire <td>Spécifique à la culture U2OS</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Usine de culture cellulaire UCSF Spécifique</td><td></td><td>à la culture U2OS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>UCSF</td> Installation de culture <td></td><td></td>cellulaire</tr><tr><td>Nunc Lab-tek II Chambrée Coverglass</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Matriplate Plaque à 96 puits</td><td>Brooks Life Science Systems</td><td>MGB096-1-2-LG-L</td><td></td></tr><tr><td>BSA 5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> % Caseine soluble dans les alcalis</td><td>EMD Millipore</td><td>70955</td> Toutes <td>les caséines ne sont pas identiques</td></tr><tr><td colspan="4">(Optionnel) Réactifs de synthèse d’ADN</td></tr><tr><td>5' Modificateur d’amine C6</td><td>Glen Research</td><td>Oct-06</td><td></td></tr><tr><td>dA-Thiophosphoramidite</td><td>Glen Research</td><td>10-700</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Analysis Software</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>http://valelab.ucsf.edu/~schindelin/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>RyTrack.pro http://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tracker</td><td></td><td></td><td></td>http://www.gartnerlab.ucsf.edu/more/software</tr></tbody></table>

la production et le ciblage des monovalent quantum dots

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

La nature multivalente des points quantiques commerciaux (QD) et les difficultés associées à la production de points monovalents ont limité leurs applications en biologie, où le regroupement et l’organisation spatiale des biomolécules font souvent l’objet d’études. Nous décrivons ici un protocole pour produire des points quantiques monovalents (mQD) qui peut être réalisé dans la plupart des laboratoires de recherche biologique via un simple mélange de QD CdSe/ZnS cœur/coquille avec de l’ADN phosphorothioate (ADNpt) de longueur définie. Une fois qu’un seul brin d’ADNpt a enveloppé le QD, les brins supplémentaires sont exclus de la surface. La production de mQD de cette manière peut être réalisée à petite et grande échelle, avec des réactifs commerciaux, et en quelques étapes. Ces mQD peuvent être spécifiquement dirigés vers des cibles biologiques par hybridation avec un ADN cible simple brin complémentaire. Nous démontrons l’utilisation de ces mQD comme sondes d’imagerie en marquant des récepteurs Notch marqués par SNAP sur des cellules de mammifères vivants, ciblées par des mQD portant une fraction benzylguanine.

Le transfert de phase des points quantiques d'une organique à une phase aqueuse est critique pour la production de mQDs, mais peut être à la fois et de condition-QD-spécifique. transfert de phase dans la section 1.1 devrait apparaître aussi propre que les deux premiers flacons de la figure 3. Si le transfert apparaît plus comme flacon 3, alors il faut essayer de nouveau avec des conditions différentes. Une fois que les points quantiques sont revêtues avec l'ADN chargé négativement, ils doivent migrer sur un gel séparément des boîtes quantiques non-enveloppé. Utilisation d'une aliquote de points quantiques déballé en tant que contrôle, une deuxième, une bande à migration plus rapide doit apparaître lors de l'addition de la ptDNA, comme on le voit dans le premier gel à la figure 2B. Formation complète de mQDs est démontré par la perte de la bande immobile, et sa chute dans la bande du service mobile tel que vu dans le dernier gel sur la figure 2B. Si une aliquote de votre produit MQD migre sous forme d'une bande unique séparable des boîtes quantiques déballé, vos mQDs sont monovalents et r eady à être utilisé dans d'autres étapes. étiquetage cellulaire doit être spécifique à la cible de votre choix et devrait dépendre du niveau d'expression de protéines et la concentration MQD. L'optimisation empirique de deux concentration MQD et MQD passivation est souvent nécessaire pour une application donnée. Figure 4B montre le marquage des cellules U2OS exprimant un récepteur Notch SNAP-marqués avec mQDs des concentrations allant de 0,5 à 10 nm. <img fo:content-width="6in" width="600" alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52198/52198fig1highres.jpg"> Figure 1: ciblage de mQDs modulaire. MQDs s'hybrident à l'ADN sb fonctionnalisé par différentes molécules de ciblage. Benzylguanine-liée cibles d'ADN mQDs SNAP-marqués protéines de fusion. D'autres modifications en 5 'et les séquences d'ADN permettent le ciblage des mQDs à une variété d'autres biomolécules./files/ftp_upload/52198/52198fig1highres.jpg "target =" _blank "&gt; S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img fo:content-width="6in" width="600" alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52198/52198fig2highres.jpg"> Figure 2 Schéma de production de mQDs. (A) en phase organique les points quantiques sont transférés vers la phase aqueuse par traitement avec un thiol et mPEG TBAB, enveloppé avec ptDNA, et passivées par un groupe carboxy PEG6 alcane thiol. Images représentant TEM sont QD545 organique, QD585, et QD605, respectivement. (B) Un procédé pour déterminer de manière empirique la stoechiométrie de l'interaction entre les boîtes quantiques et ptDNA en deux étapes ci-dessus. &amp; QD ptDNA stoechiométries sont vérifiées empiriquement par densitométrie de telle sorte que la stoechiométrie de la réaction finale est de 1: 1 (QD: ptDNA). Le nombre initial de moles de ptDNA est multiplié par le rapport entre QD: MQD, et ajustée par le volume réel d'af ter la conjugaison pour donner le nombre de moles nécessaires pour atteindre 1: 1. conjugaison <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52198/52198fig2highres.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img fo:content-width="6in" width="600" alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52198/52198fig3highres.jpg"> Figure 3: Les détails expérimentaux pour la production de mQDs. (A) photos représentatifs de succès et à l'échec de transfert de phase. QD devrait visuellement transférer entre la phase organique dense et la phase aqueuse moins dense. Séparation de phase incomplète indique un mauvais transfert. (B) ptDNA peut être remplacé par l'alcane-thiol-PEG. Droit de données gel est représentatif d'une réaction dans laquelle une fraction importante de ptDNA ont été déplacés à partir des points quantiques due à une sur-passivation.es.jpg "target =" _blank "&gt; S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img fo:content-width="6in" width="600" alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52198/52198fig4highres.jpg"> Figure 4 protéines SNAP-étiquetage marqué sur des cellules vivantes. (A) Schéma montrant l'expression, l'attachement et l'étiquetage d'un récepteur SNAP-marqué d'un MQD BG-ciblée. (B) de l'étiquetage représentant de cellules exprimant un SNAP-Notch-mCherry construire à différentes concentrations MQD. mQDs passives avec PEG12 colocalisent avec mCherry indiquant un étiquetage spécifique. Densités plus faibles en matière d'étiquetage (&lt;0,5 nM) sont généralement préférables pour le suivi de particules isolées. La barre d'échelle est de 10 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52198/52198fig4highres.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Nous fournissons des instructions détaillées pour la préparation de points quantiques ciblés monovalents (mQD) à partir d’ADN phosphorothioate de longueur définie. L’emballage de l’ADN se produit à haut rendement et, par conséquent, les produits ne nécessitent pas de purification. Nous démontrons l’utilisation de l’étiquette SNAP pour cibler les mQD sur les récepteurs de surface cellulaire pour les applications d’imagerie de cellules vivantes.

La production et le ciblage des monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

L’objectif global de cette procédure est de fournir un protocole simple et généralisable pour la préparation de points quantiques monovalents pour l’imagerie de molécules uniques de protéines membranaires cibles dans des cellules vivantes. Ceci est accompli en introduisant d’abord une quantité stœchiométrique d’un long ligand oligonucléotidique poly phospho à une boîte quantique. L’ADN long enveloppe complètement le point quantique et empêche la liaison d’une deuxième molécule d’ADN, générant ainsi des points quantiques monovalents exclusivement et quantitativement. Séparément.L’ADN fonctionnalisé en benzoguine portant des séquences complémentaires est préparé pour cibler les protéines membranaires marquées snap exprimées sur des cellules vivantes. Ensuite, le traitement séquentiel de cellules vivantes exprimant des protéines membranaires marquées snap avec de la benzo guine, de l’ADN, suivi de points quantiques monovalents, conduit à un marquage sélectif du récepteur ciblé. La dernière étape consiste à imager la distribution des protéines cibles et les trajectoires de diffusion via la microscopie à fluorescence à molécule unique.En fin de compte, des informations spatio-temporelles dynamiques en temps réel des protéines cibles dans des cellules vivantes sont extraites pour révéler comment les molécules cibles fonctionnent in vivo. Le principal avantage de cette approche de synthèse de points quantiques monovalents est sa simplicité et son accessibilité générale. Contrairement à de nombreuses autres approches qui nécessitent des compétences ou un équipement spéciaux, cette approche est relativement simple.Par conséquent, il devrait être disponible pour n’importe quel laboratoire et pour n’importe quelle discipline. Nous avons eu l’idée de cette méthode lorsque Zeva et moi avons commencé à discuter de la façon dont notre expertise sur la synthèse de nanoparticules d’ADN pourrait être combinée pour mieux contrôler la réactivité des nanoparticules. Nous avons réalisé ensemble les premières expériences de principe d’approbation pendant un week-end.De plus en plus, notre premier essai a été couronné de succès. Dans cette vidéo, nous utilisons des points quantiques monovalents pour étudier la dynamique des particules uniques du récepteur notch dans des cellules de mammifères vivants. Cependant, ces points quantiques monovalents devraient être largement utiles pour toutes les études nécessitant un suivi de particule unique.En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à le faire, car toutes les boîtes quantiques disponibles dans le commerce ne sont pas identiques, que ce soit géométriquement ou chimiquement. Par conséquent, une certaine optimisation sera nécessaire. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle lors de votre transfert de phase et les étapes d’ajout d’ADN liées au phosphore I pourraient être intimidantes pour un laboratoire sans expérience de la chimie multi-synthétique.Pour commencer, diluez 200 microlitres d’une solution d’une micromolaire de points quantiques en phase organique avec 400 microlitres de chloroforme dans un flacon en verre de cinq millilitres. Combinez ces points quantiques avec un mélange de 400 microlitres de solution de chloroforme de bromure de tétrabutylammonium et de tétrabutyle et d’ammonium et de 36 microlitres de pecthiol pur et agitez pendant la nuit. Ajoutez ensuite 800 microlitres d’une solution aqueuse d’hydroxyde de sodium de 0,2 molaire et agitez pendant 30 secondes.Un transfert de phase se produit en quelques minutes indiqué par le transfert des particules colorées vers la phase aqueuse au-dessus de la phase organique plus dense. Si les particules s’agrègent dans une troisième phase entre les phases aqueuse et organique, augmentez le temps d’incubation avec le cadran pec. Si la phase aqueuse reste claire, les points quantiques n’ont pas fait de transfert de phase.Augmentez la concentration du cadran pec pour atténuer le mauvais transfert de phase. Ensuite, récupérez la phase aqueuse colorée. Concentrez ensuite les points quantiques collectés avec la colonne de spin racon à un millilitre.Ajoutez la solution concentrée de points quantiques dans un prée de colonne cidex NEP 10 équilibré avec un tampon tris de 10 millimolaires contenant 30 millimolaires de chlorure de sodium. Le pH huit élue les points quantiques avec 1,5 millilitres de tampon d’élution par écoulement gravitaire. Procéder à la mesure de la concentration de points quantiques avec la spectroscopie d’absorption à 350 nanomètres.Pour préparer un achat ou une synthèse de l’ADN phospho huit, préparez un millilitre de solution de 100 points quantiques ano-molaires dans un tampon tris de 10 millimolaires contenant 30 millimolaires de chlorure de sodium pH huit. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de la solution d’ADN phospho IO huit nanomolaires. Descendez vers les points quantiques aqueux pendant une minute en remuant vigoureusement.Remuez ou placez le mélange sur un shaker pendant neuf heures supplémentaires. Retirez environ 10 microlitres du mélange de points quantiques pour l’exécuter sur un gel agros analytique. Supprimez également une concentration similaire de points quantiques non conjugués en phase aqueuse.Ensuite, à environ deux microlitres de six x fi, appelez le tampon de chargement pour augmenter la densité de la solution. Analysez ces deux échantillons ensemble sur un gel AROS à 0,8 % en poids dans un tampon de bide de sodium pendant 15 minutes à 150 volts. Le résultat devrait être une seule bande dans la voie de contrôle non conjuguée migrant près du puits et deux bandes dans la voie avec des points quantiques conjugués.Calculez la fraction de points quantiques non conjuguée en utilisant l’intensité relative des deux bandes. Ensuite, utilisez cette fraction pour calculer le volume supplémentaire de 100 nanomolaires de solution d’ADN phospho huit nécessaire pour correspondre au nombre de points quantiques quantiques. Répétez la procédure une fois de plus avec ce volume calculé ou jusqu’à ce que les points quantiques conjugués s’effondrent en une seule bande sur le gel, indiquant la conjugaison complète de tous les points quantiques.Ensuite, ajoutez 100 microlitres de carboxy de 10 millimolaires. Fixez six alcanes thiol aux points quantiques ciblés monovalents conjugués et agitez pendant 10 minutes. Pour éliminer l’excès d’alcane pegol, ajoutez 0,5 millilitre de la solution de points quantiques à ACE fitex knap cinq colonnes pré-équilibrées avec un tampon elucian.Ensuite, collectez les points quantiques ciblés monovalents avec un millilitre de tampon d’élue par écoulement gravitaire. Concentrez les points quantiques collectés avec une colonne de spin centrée. Ces points quantiques ciblés monovalents peuvent être stockés à quatre degrés Celsius par mois, juste avant une expérience d’imagerie utilisant des réactifs tels que la caséine ou les cellules de plaque d’albumine sérique bovine exprimant la protéine snap tagg sur réflexion interne totale, fluorescence ou verre de qualité gazon.Dans cette expérience particulière, nous utilisons une lignée cellulaire U2 OS exprimant un récepteur d’encoche un marqué par enclenchement et des surfaces en verre de haute qualité après que les cellules se soient fixées au verre, aient retiré le milieu de croissance et lavé avec une solution saline tamponnée au phosphate ou PBS. Ensuite, incubez les cellules pendant 10 à 30 minutes à température ambiante dans du PBS ou un milieu cellulaire contenant de l’ADN de benzoyle guine, préparé comme détaillé dans le protocole de texte après incubation avec du benzo Guin, de l’ADN, lavez soigneusement les cellules avec du PBS ou un milieu cellulaire, puis incubez les cellules pendant environ cinq à 10 minutes avec les points quantiques monovalents. Lavez les points quantiques monovalents non liés et renvoyez les cellules dans un tampon ou un milieu adapté à la fois à l’imagerie et à l’image de culture.Les cellules utilisant un microscope sur gazon en raison de la luminosité des points quantiques monovalents collectent des images à des fréquences d’images élevées dans le gazon tout en imageant la face basale d’une cellule vivante. Une fois que les points quantiques sont recouverts d’ADN chargé négativement, ils doivent migrer sur un gel séparément des points quantiques non rappés en utilisant une aliquote de points quantiques non emballés comme contrôle. Une deuxième bande de migration plus rapide devrait apparaître lors de l’ajout du Phosphol IO huit DN. Une formation complète des points quantiques monovalents est démontrée avec la perte de la bande immobile et son effondrement dans la bande mobile.Si une aliquote du produit de points quantiques monovalents migre sous la forme d’une seule bande séparable des points quantiques non encapsulés, alors les points quantiques sont effectivement monovalents et prêts à être utilisés dans d’autres étapes. On voit ici un marquage représentatif de cellules exprimant une construction de cerise M à encoche instantanée à diverses concentrations de points quantiques monovalents. Des points quantiques monovalents passivés avec du PEG 12 co-localisés avec M cherry indiquant un marquage spécifique.Des densités de marquage plus faibles sont généralement préférables pour le suivi d’une seule particule. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la synthèse d’une nanoparticule fluorescente qui est brillante modulaire monovalente et ciblée Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux données de préparation des points quantiques monovalents et en une heure de marquage de cellule photoélectrique si elle est effectuée correctement. Il est important de se rappeler qu’en utilisant des réactifs de départ disponibles dans le commerce, nous pouvons produire des points quantiques monovalents avec d’excellentes propriétés photophysiques qui peuvent être utilisés pour de longues expériences de suivi de particules uniques.À la suite de cette procédure, d’autres protéines peuvent être marquées avec des fusions de snap tag pour suivre leur dynamique moléculaire sur des cellules vivantes. Travailler avec des points quantiques peut être extrêmement difficile à dépoussiérer, alors n’oubliez pas de porter des gants de lunettes de sécurité et des blouses de laboratoire lors de cette procédure.

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