Spécificité Analyse des protéines lysine Methyltransferases Utilisation SPOT Peptide Arrays

L’objectif général de l’expérience suivante est d’étudier la spécificité du substrat des protéines lysine méthyltransférases ou PK mts. Ceci est réalisé par l’identification d’un substrat initial et la préparation de réseaux de peptides avec plusieurs variantes de ce substrat contenant des échanges d’acides aminés uniques à différentes positions. Dans un deuxième temps, le réseau de peptides est incubé avec le PKMT en présence d’un donneur de groupe méthyle radioactif, ce qui permet de détecter la méthylation peptidique par transfert de la radioactivité vers le point peptidique correspondant.

Ensuite, le réseau est exposé à un film de rayons X et analysé quantitativement afin de déterminer l’activité de méthylation au niveau de chacun des peptides. Et pour définir le profil de spécificité du PKMT, les résultats montrent quels acides aminés du peptide de substrat sont critiques pour sa méthylation par le PKMT. Le principal avantage de cette technique ou des méthodes existantes telles que la méthylation de peptides individuels est qu’un certain nombre de peptides différents peuvent être testés dans une seule expérience de manière rentable.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la méthylation des protéines lym, telles que la spécification de nouveaux substrats de PK mtss jusqu’alors inconnus. Cette méthode peut donc donner un aperçu de la spécificité des MTS PK. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que les protéines kinases, d’autres méthodes protéiques, les transférases ou l’ajout à des transférases.

J’ai eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque je me suis familiarisé avec la possibilité de préparer de grands réseaux de peptides personnalisés à des coûts raisonnables en utilisant la synthèse ponctuelle de peptides. Pour commencer cette procédure, concevez des séquences peptidiques pour la synthèse à l’aide du logiciel multi pep spotter. Entrez les séquences peptidiques sous la forme d’un code d’une seule lettre, chaque lettre définissant l’acide aminé spécifique suivant ce pré-gonflement, la membrane ponctuelle fonctionnalisée de l’amino peg à l’extrémité, l’extrémité du diméthylformamide ou du DMF pendant 10 minutes. Une fois terminé, placez la membrane humide sur le cadre du synthétiseur sans bulles d’air ni plis.

Séchez complètement la membrane pendant au moins 10 minutes avant de commencer le programme de synthèse. Lavez la membrane trois fois avec de l’éthanol à 100 % pour générer la liaison amide avec le groupe amino libre sur la membrane. Activez le groupe carboxy de l’acide aminé entrant en ajoutant du DIC et de l’éthylhydroxy-amino-acétate de sino au dérivé de l’acide aminé.

Après l’activation, repérez les volumes souhaités d’acides aminés activés sur la membrane fonctionnalisée de l’amino-cheville à l’aide du robot programmable. Répétez l’étape précédente trois fois pour assurer un meilleur couplage du premier acide aminé activé. Après avoir incubé la membrane pendant 20 minutes, lavez-la avec du DMF pour éliminer les acides aminés découplés après séchage et en bloquant les groupes aminés libres.

Lavez la membrane avec du DMF quatre fois, puis incubez avec 20 % de pipérine dans du DMF pendant 20 minutes pour éliminer le groupe protecteur FM. Après avoir lavé et séché la membrane, répétez les étapes de déblatage et d’élimination du MOC F jusqu’à ce que la longueur de peptide souhaitée soit atteinte. Après la dernière protection F MOC groupe D, laver la membrane avec du DMF et de l’éthanol à 100 %.

Traitez ensuite la membrane avec 0,02 % de bleu de phénol brom dans du DMF pendant au moins cinq minutes jusqu’à ce qu’elle devienne complètement bleue. Après avoir lavé et séché la membrane, retirez-la du synthétiseur et placez-la dans une boîte résistante aux produits chimiques. Traitez-le avec 20 à 25 millilitres d’un mélange de protection de la chaîne latérale D, composé de 95 % d’acide trichloracétique pour cliver les groupes protecteurs de la chaîne latérale et de réactifs de piégeage pour protéger les chaînes latérales d’acides aminés de la modification.

Après s’être assuré que le mélange de protection en profondeur recouvre la membrane, fermez complètement la boîte et incubez-la pendant une à deux heures en la secouant doucement après l’incubation. Lavez la membrane six fois avec 20 à 25 millilitres de di chlorométhane pendant deux minutes chacune. Après avoir lavé deux fois avec de l’éthanol à 100 %, séchez la membrane dans un dessiccateur pendant la nuit.

Ensuite, pré-incubez la membrane du réseau peptidique dans un sac en plastique scellé contenant le tampon de méthylation respectif sans enzyme et l’amet avec le groupe méthyle radioactivement marqué Pendant 10 minutes, jetez le tampon de pré-incubation et incubez la membrane dans huit millilitres de tampon de méthylation contenant le PKMT respectif pendant une à deux heures. Ensuite, jetez le tampon de méthylation dans un conteneur de déchets radioactifs et lavez les réseaux de peptides cinq fois avec 20 millilitres de tampon contenant 100 millimolaires de bicarbonate d’ammonium, et 1 % de STS pendant cinq minutes pour éliminer la protéine liée. Après avoir jeté le dernier tampon de lavage dans le conteneur de déchets radioactifs, incubez la membrane pendant cinq minutes dans 10 millilitres de solution amplifiée.

Jetez ensuite la solution d’amplification dans le conteneur de déchets radioactifs pour les solvants organiques. Scellez le réseau de peptides dans un sac en plastique et placez-le dans une cassette de radiographie automatique. Placez le film de radiographie automatique sur le peptide dans une pièce sombre.

Fermez ensuite la cassette avec précaution. Après avoir exposé le film à moins 80 degrés Celsius, développez-le pour analyser les résultats. Enfin, capturez l’image plusieurs fois avec des temps d’exposition différents pour éviter la saturation des substrats peptidiques fortement méthylés.

Un exemple de réaction de méthylation d’un réseau de peptides avec un réseau de peptides NSD est présenté ici. L’axe horizontal représente la séquence du peptide et dans la direction verticale. L’acide aminé altéré est indiqué méthylation avec nsd, l’un montre qu’il agit spécifiquement sur H trois K 36 et reconnaît trois à quatre résidus d’acides aminés de chaque côté de la consolidation de la lysine cible des trois expériences de réseau peptidique de NSD un est montré ici.

Environ 85 % des peptides présentent des écarts-types inférieurs à plus ou moins 20 % et plus de 97 % des peptides présentent des écarts-types inférieurs à plus ou moins 30 %. Les données du facteur de discrimination calculé montrent que NSD un préfère les résidus aromatiques à la position moins deux. Aux sites moins un et plus deux, il préfère les résidus atiques hydrophobes. Et au site plus un, il y a une préférence pour l’arginine, la lysine, la glutamine ou l’asparagine.

De nouveaux substrats peptidiques potentiels peuvent être trouvés en effectuant des recherches dans des bases de données du protéome humain. Une forte méthylation de certains de ces peptides avec ome confirme leur identité en tant que nouveaux substrats peptidiques NSD un. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’utiliser le substrat initial le plus approprié Après cette procédure.

D’autres méthodes telles que la méthylation des protéines correspondantes in vitro et dans les cellules peuvent être effectuées afin de savoir si les protéines sont acceptées comme substrats, ainsi qu’après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la mésylation de la protéine lysine, pour définir la spécificité du substrat de nombreux MT PK et identifier plusieurs nouveaux substrats. Cela a permis de comprendre l’importante fonction biologique de PK mts.

N’oubliez pas qu’il est possible d’affirmer que le travail avec la radioactivité et les solvants organiques dans la synthèse des peptides et que des précautions appropriées doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.