Name: Spécificité Analyse des protéines lysine Methyltransferases Utilisation SPOT Peptide Arrays (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Apprenez à analyser la spécificité des méthyltransférases lysine de protéines (PKMT) en utilisant des arrays de peptides SPOT. Cette méthode permet d'identifier les acides aminés critiques pour la méthylation et de définir les profils de spécificité enzymatique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par la subvention DFG JE 252/7.

1. Préparation d&#39;un peptide Arrays <ol><li> Programmation de la séquences peptidiques <ol><li> Concevoir des séquences peptidiques pour la synthèse en utilisant le logiciel MultiPep spotter. Entrez les séquences peptidiques dans les codes à une lettre. Peptide 1: TARKSTGGKA </li><li> Générer alanine ou l&#39;arginine marche bibliothèques avec une commande spécifique (.replace, A) pour dépister les acides aminés importants nécessaires à la reconnaissance d&#39;un substrat défini. Par exemple, dans l&#39;exemple suivant la première ligne représente la séquence de type sauvage et de la seconde ligne de chaque acide aminé dans un peptide est modifié séquentiellement en alanine. remplacer, A TARKSTG Un -ARKSTG T A -RKSTG TA-A -KSTG TARGET Un -STG TARK- Un -TG TARKS- A -G Un TARKST- </li><li> Utilisez des commandes similaires (.replace R,.remplacer N etc.), comme décrit au point 1.1.2 avec tous les résidus d&#39;acides aminés naturellement disponibles (éventuellement en omettant la cystéine, la méthionine et le tryptophane, parce que ces résidus sont sensibles à l&#39;oxydation et le rendement de synthèse parfois inférieur) pour synthétiser une matrice de peptide pour la détermination du consensus substrat motif de séquence pour une enzyme. Remarque: Comme le montre la figure 4A, l&#39;axe horizontal représente la séquence peptidique donnée et l&#39;axe vertical représente les acides aminés qui sont sélectionnées pour la commande. Semblable à la séquence représentée dans 1.1.2, A sur l&#39;axe vertical signifie qu&#39;une séquence Ala remplace chaque position de la séquence donnée dans la première rangée de la Fig. 4A. De la même façon séquentielle arginine remplace chaque acide aminé dans la seconde rangée et ainsi de suite avec les autres acides aminés. Complete bibliothèques de réseau peptidique sont synthétisés par substitution systématiquement chaque résidu dans la séquence de substrat peptidique munie de chaque ee autres résidus d&#39;acides aminés naturellement disponibles, cette aide à comprendre l&#39;influence de chaque résidu au niveau de chaque position de la séquence donnée. </li><li> Alternativement, la méthylation des substrats connus ou prédits peptidiques peut être facilement vérifié synthétiser des banques de peptides avec les peptides cibles du PKMT ainsi que les contrôles de méthylation positif et négatif (c.-à-peptides connus pour méthylé ou connus pour ne pas être méthylé). Synthétiser des peptides en échangeant la lysine cible putative en alanine pour confirmer la méthylation de la lysine cible comme indiqué ci-dessous par la programmation manuelle. Peptide de type sauvage: StGG K PRQFL Peptide mutant: StGG Un PRQFL REMARQUE: Le logiciel a aussi son inhérents à créer différentes bibliothèques, comme la cartographie d&#39;épitopes avec un décalage de la séquence d&#39;image souhaitée pour cartographier acides aminés importants nécessaires à une interaction. </li></ol></li><li> Préparation de membrane, acides aminés d&#39;uneRéactifs d <ol><li> Pré-gonfler la membrane SPOT dans le DMF (N, N-diméthylformamide) pendant 10 min, puis placez la membrane humide sur le cadre de SPOT synthétiseur sans bulles d&#39;air ou de plis. </li><li> Laver la membrane trois fois avec de l&#39;éthanol à 100%. Sécher les membranes complètement pendant au moins 10 min avant de commencer le programme de synthèse. </li><li> En parallèle, 0,5 M fraîchement préparer des concentrations de travail disponibles dans le commerce les acides aminés protégés par Fmoc en les dissolvant dans de la NMP et préparer également l&#39;activateur et une base comme décrit dans le Tableau 1. </li><li> Assurez-vous que tous les récipients de solution des déchets du synthétiseur de SPOT ont été vidés et remplir les réservoirs de solvant avec le DMF, l&#39;éthanol et pipéridine. NOTE: Maintenant la machine est prête pour la synthèse. </li></ol></li><li> Spotting du premier acide aminé <ol><li> Pour générer la liaison amide avec le groupe amino libre sur la membrane, activer le groupe carboxy de l&#39;acide aminé entrant par annonceding l&#39;activateur (N, N &#39;-Diisopropylcarbodiimide) et une solution de base (cyanoacétate d&#39;éthyle hydroxyimino) en le dérivé d&#39;acide aminé. </li><li> Découvrir les volumes désirés des acides aminés activés à la membrane fonctionnalisée amino-PEG en utilisant le robot programmable. REMARQUE: Ainsi, l&#39;extrémité C-terminale de l&#39;acide aminé est couplé au groupe amino de la membrane. </li><li> Répéter cette étape trois fois pour assurer un meilleur couplage du premier acide aminé activé. Incuber la membrane pendant 20 minutes, puis laver avec du DMF pour éliminer les acides aminés non couplés. </li></ol></li><li> Blocage des espaces libres sur les zones non-comptant REMARQUE: Après le couplage du premier acide aminé C-terminal de tous les peptides du groupe amino de la membrane, les groupes amino entre les taches ainsi que certains des groupes amino dans les zones ponctuelles ne forment pas de liaisons avec des acides aminés. <ol><li> Bloquer ces groupes amino libres par mise en incubation avec la solution de coiffage (20% de l&#39;anhydride acétique dans du DMF)pendant 5 min. REMARQUE: On évite ainsi le couplage des acides aminés dans les autres cycles avec la membrane au lieu de la chaîne peptidique en croissance. </li></ol></li><li> L&#39;élimination du groupe Fmoc <ol><li> Après le blocage, laver la membrane avec du DMF, puis 4 fois incuber avec 20% de pipéridine dans du DMF pendant 20 min pour éliminer le groupe de protection Fmoc. Remarque: Cette étape conduit à l&#39;élimination des groupes amino-protecteurs Fmoc et on l&#39;appelle déprotection. </li><li> Ensuite, laver la membrane deux fois avec DMF et deux fois à l&#39;éthanol et laisser sécher. REMARQUE: Maintenant, la membrane est prête pour le couplage des acides aminés suivants. </li></ol></li><li> Allongement de la chaîne NOTE: L&#39;addition de chaque acide aminé est appelé un cycle. Outre l&#39;accouplement des premier acide aminé, le cycle commence par la déprotection du groupe Fmoc de l&#39;acide aminé couplé et il est suivi par le couplage du groupe carboxyle activé d&#39;un acide aminé entrant au groupe amino du pep croissantla chaîne de la marée. <ol><li> Répéter les étapes 1.3 et 1.5 jusqu&#39;à ce que la longueur du peptide désiré. </li></ol></li><li> Tachant NOTE: Après le cycle final, les tableaux peptidiques sont colorées avec du bleu de bromophénol pour confirmer la synthèse réussie de peptides. Bleu de bromophénol se lie avec les groupes amino libres des peptides. Taches peptidiques montrent la couleur bleu clair après la coloration, mais l&#39;intensité des taches varie en fonction de la séquence peptidique. Cette coloration permet de confirmer la suppression complète de la pipéridine, car en présence de bleu de bromophénol pipéridine ne tache pas les peptides. En outre, cette aide aussi à marquer les tableaux peptidiques pour un usage ultérieur. <ol><li> Après la déprotection du groupe Fmoc dans le dernier cycle de synthèse, laver la membrane avec du DMF et 100% d&#39;éthanol. Ensuite, traiter la membrane avec du bleu de bromophénol (0,02% de bleu de bromophénol dans du DMF) pour un minimum de 5 min jusqu&#39;à ce qu&#39;il devienne complètement bleu. </li><li> Ensuite, laver la membrane avec du DMF et ethanol suivie d&#39;un séchage pendant 10 minutes. Maintenant, prenez la membrane du synthétiseur et effectuer la déprotection de la chaîne latérale (section 1.8) manuellement. Si nécessaire, la membrane photographier pour documenter les résultats de la synthèse de peptide (Fig. 2). </li></ol></li><li> La déprotection de la chaîne latérale <ol><li> Traiter les membranes avec 20 à 25 ml de mélange de déprotection de la chaîne latérale constituée de 95% d&#39;acide trifluoroacétique (TFA) à cliver les groupes de protection de chaîne latérale et des réactifs fixateurs (2,5% d&#39;eau et 2,5% de triisopropylsilane) pour protéger les chaînes latérales d&#39;acides aminés à partir de modification lors de cette étape. Prélever un volume suffisant de mélange de déprotection pour se assurer qu&#39;il couvre complètement la membrane dans un boîtier hermétiquement fermé résistant aux produits chimiques et incuber pendant 1 à 2 h tout en agitant doucement. </li><li> Laver la membrane six fois avec 20 à 25 ml de DCM (dichlorométhane) pendant 2 minutes chaque fois et enfin avec 100% d&#39;éthanol et sécher dans un dessiccateur pendant une nuit. NOTE: Maintenantla membrane peut être utilisée pour les expériences. Un schéma de la synthèse de la matrice de peptide est présenté à la figure 1. </li></ol></li></ol> 2. Protein Expression et purification <ol><li> Expression de la protéine de PKMTs que TPS Fusions <ol><li> En utilisant des techniques standards, de cloner le gène codant pour la pleine longueur PKMT ou son domaine catalytique dans un vecteur d&#39;expression bactérien (tel que pGEX-6P2) de l&#39;exprimer sous forme de protéine de fusion GST. </li><li> Transférer le vecteur avec la PKMT souhaité insérer dans BL21 ou BL21 codon ainsi E. cellules coli par la méthode de choc thermique ou toute autre méthode. </li><li> Préparer une pré-culture avec 30 ml de milieu Luria-Bertani (LB) à la date d&#39;expression et incuber à 37 ° C pendant 7-8 heures avec agitation continue. </li><li> Ensuite, transférer 10 ml de la pré-culture dans un 2 L grands flacons à déflecteurs contenant 1 litre de milieu LB et incuber à 37 ° C dans un incubateur avec agitation continue jusqu&#39;à ce que la portée de la culturees une densité optique défini à 600 nm. REMARQUE: Même si cela peut être optimisé pour chaque protéine, nous incitons régulièrement à une DO 600nm d&#39;environ 0,8. La température d&#39;induction doit être optimisé pour chaque protéine individuellement, certaines protéines montrer bonne expression à 22 ° C, et certains à des températures plus élevées. </li><li> Décaler les cellules à la température d&#39;induction pendant 15 min, puis à induire 1 mM d&#39;isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside et laisser la culture croître pendant 10-12 heures à la température d&#39;induction. </li><li> Après la récolte des cellules par centrifugation à 5000 xg pendant 15 min, et enfin laver le culot avec 30 ml de tampon STE (10 mM Tris pH 8,0, NaCl 100 mM et EDTA 0,1 mM) et conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ol></li><li> Protein Purification <ol><li> Décongeler le culot cellulaire et remettre en suspension dans 30 ml de tampon de sonication (50 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, DTT 1 mM et 5% de glycerol) et perturber par sonication. NOTE: Ce tampon needs à être optimisés pour chaque protéine par la suite. </li><li> Centrifuger le lysat cellulaire à 22 000 x g pendant 1 heure et, ensuite recueillir le surnageant et passer à travers une colonne contenant 600 ul de résine glutathion-Sepharose 4B. </li><li> Laver la colonne avec 50 ml de tampon de sonication et ensuite avec 100 ml de tampon à haute teneur en sel (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, DTT 1 mM et 5% de glycerol) pour éliminer les protéines non spécifiquement liées. Eluer la protéine liée avec 5 ml de tampon salin élevé contenant 40 mM de glutathion. </li><li> Dialyser la protéine éluée dans 2 L de tampon de dialyse à bas glycérol (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM de KCl, 0,5 mM de DTT et 10% de glycerol) pendant 2 heures et ensuite dans du Tris 20 mM pH 7,4, 100 mM de KCl, 0,5 mM TNT et 70% de glycérol pendant 8 heures ou toute la nuit. Se assurer que toutes les mémoires tampon de purification sont à 4 ° C et d&#39;effectuer la purification de la protéine dans la chambre froide pour éviter la dénaturation des protéines. </li></ol></li></ol> 3. Peptide tableau méthylation <ol><li> Pré-incuprobation du peptide Arrays <ol><li> Effectuer peptide tableau méthylation soit dans une boîte de taille appropriée ou dans un sac en plastique pour éviter le gaspillage d&#39;enzyme et coûteux AdoMet marqué radioactivement. Pré-incuber la membrane de peptide de réseau dans un sac en plastique scellé contenant le tampon de méthylation respectif sans enzyme et marqué [méthyl-3H] -AdoMet pendant 10 min. Le volume de tampon dépend de la taille de la matrice, par exemple utiliser 8 ml de tampon de méthylation pour une spécificité toute la gamme profil peptidique. Optimiser la quantité et la concentration de l&#39;AdoMet pour chaque enzyme. </li></ol></li><li> La méthylation d&#39;un peptide Arrays <ol><li> Jeter le tampon de pré-incubation et incuber la membrane dans 8 ml de tampon de méthylation contenant le PKMT respectif et marqué [méthyl-3H] -AdoMet pour 1-2 heures. REMARQUE: La quantité d&#39;enzyme nécessaire à une réaction de méthylation dépend de l&#39;activité spécifique de PKMT, nous initions nos expériences de criblage typiquement avec 50 nM d&#39;enzyme ailetteconcentration al. </li></ol></li><li> Lavage de Peptide Arrays <ol><li> Ensuite, jeter le tampon de méthylation dans un conteneur de déchets radioactifs et laver les matrices de peptides pour 5 fois avec 20 ml de tampon contenant 100 mM de bicarbonate d&#39;ammonium et 1% de SDS pendant 5 min pour éliminer la protéine liée. Jeter le tampon de lavage dans un conteneur de déchets radioactifs. </li></ol></li><li> La détection du signal radioactif <ol><li> Après les lavages incuber la membrane pendant 5 minutes dans 10 ml de solution Amplify (NAMP100V). </li><li> Ensuite, jeter la solution Amplify dans le conteneur de déchets radioactifs aux solvants organiques, sceller la matrice de peptide dans un sac en plastique et le mettre dans une cassette d&#39;autoradiographie. </li><li> Placer le film d&#39;autoradiographie sur le réseau peptidique dans la chambre noire. Fermez la cassette attentivement et de l&#39;exposer à -80 ° C pendant le temps nécessaire. Ensuite, développer le film pour analyser les résultats. Capturez le couple d&#39;image de fois avec expositio différenten fois pour éviter la saturation des substrats peptidiques fortement méthylés. </li></ol></li></ol> 4. Traitement et analyse des données <ol><li> Densitométrique Analyse des intensités spot <ol><li> Scannez le film dans un scanner conventionnel et analyser les intensités au comptant par densitométrie. Pour ce faire, en utilisant ImageJ (qui est un freeware) ou un programme commercial. NOTE: Nous utilisons un logiciel Phoretix pour cette tâche. </li></ol></li><li> Normalisation et Moyenne des résultats de différentes membranes <ol><li> Effectuer les expériences méthylation de tableau de peptide au moins en trois exemplaires. Normaliser les intensités numérisées pour chaque expérience par soustraction de fond et la mise l&#39;activité à un substrat de référence 1.0. La moyenne des données pour les taches individuelles et de les signaler comme des valeurs moyennes et les écarts types. </li></ol></li><li> Analyse des données et Affichage <ol><li> Tracer les données en 2D utilisant un système de niveaux de gris ou de couleur pour indiquer l&#39;activité relative. Pour ce faire, wie Excel ou Sigmaplot comme indiqué ici. De même, préparer un graphique de la distribution des écarts-types des expériences répétées pour analyser la qualité des données. </li><li> Pour comparer afficher et la précision de la reconnaissance de chaque résidu dans le peptide de substrat quantitativement, calculer la préférence relative de la PKMT pour chaque acide aminé à la position x i par un facteur D 16,17 discrimination: D X; i = &lt;V j ≠ i&gt; / V i - 1 Où V i est le taux de méthylation de la variante de peptide portant l&#39;acide aminé i à la position x et &lt;v j ≠ i&gt; est le taux moyen de méthylation de tous les 19 peptides portant un j d&#39;acides aminés différente ≠ i à la position x (y compris la séquence de type sauvage). NOTE: Le facteur de discrimination en ce sens dépend du niveau de fond. Si un seul résidu est accepté à une certaine position avec un fond de 3%, une discriminationfacteur de 32,3 soit obtenu. Aucune préférence à une position se traduit par un facteur de discrimination de 0. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Margueron, R., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure+and+the+inheritance+of+epigenetic+information%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).</li>
<li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+epigenetics%3A+from+mechanism+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li>
<li>Helin, K., Dhanak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+proteins+and+modifications+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromatin proteins and modifications as drug targets.</a> Nature. 502, 480-488 (2013).</li>
<li>Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+methylation+at+the+surface+and+buried+deep%3A+thinking+outside+the+histone+box%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).</li>
<li>Rathert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+lysine+methyltransferase+G9a+acts+on+non-histone+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets.</a> Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).</li>
<li>Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhosphoSite%3A+A+bioinformatics+resource+dedicated+to+physiological+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation.</a> Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).</li>
<li>Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+peptide+arrays+prepared+by+the+SPOT-technology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).</li>
<li>Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPOT+synthesis+as+a+tool+to+study+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions.</a> Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).</li>
<li>Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+kinase+target+phosphorylation+consensus+motifs+using+peptide+SPOT+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays.</a> Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).</li>
<li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SPOT-synthesis+technique.+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports--principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications.</a> Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).</li>
<li>Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+arrays+on+cellulose+support%3A+SPOT+synthesis%2C+a+time+and+cost+efficient+method+for+synthesis+of+large+numbers+of+peptides+in+a+parallel+and+addressable+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion.</a> Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).</li>
<li>Li, S. S., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+peptide+array+to+identify+binding+motifs+and+interaction+networks+for+modular+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains.</a> Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).</li>
<li>Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+peptide+arrays+using+SPOT-technology+and+the+CelluSpots-method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method.</a> Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).</li>
<li>Toepert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+SPOT+synthesis+and+native+peptide+ligation+to+create+large+arrays+of+WW+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).</li>
<li>Volkmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+application+of+peptide+arrays%3A+quo+vadis+SPOT+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem+%3A+a+EuropeanJournal+of+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology.</a> Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).</li>
<li>Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+substrate+specificity+of+the+Dim-5+histone+lysine+methyltransferase+using+peptide+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistr.%2C+%26+biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays.</a> Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).</li>
<li>Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SET8+H4K20+protein+lysine+methyltransferase+has+a+long+recognition+sequence+covering+seven+amino+acid+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues.</a> Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).</li>
<li>Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+analysis-based+identification+of+new+methylation+targets+of+the+SET7%2F9+protein+lysine+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistr.%2C+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase.</a> Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).</li>
<li>Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+analysis+and+novel+substrates+of+the+protein+lysine+methyltransferase+NSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistr.%2C+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1.</a> Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).</li>
<li>Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scansite+2.0%3A+Proteome-wide+prediction+of+cell+signaling+interactions+using+short+sequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs.</a> Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).</li>
<li>Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+design+based+on+an+antibody+complementarity-determining+region+%28CDR%29%3A+construction+of+porphyrin-binding+peptides+and+their+affinity+maturation+by+a+combinatorial+method%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method.</a> Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).</li>
<li>Kramer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spot+synthesis%3A+observations+and+optimizations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pept.+Res%22%5BJournal%5D)">Spot synthesis: observations and optimizations.</a> J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).</li>
<li>Stadler, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+synthesis+of+peptide+arrays+with+a+laser+printer%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).</li>
<li>Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+substrates+for+Cdk5+and+new+targets+for+Cdk5+inhibitors+using+high-density+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays.</a> Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).</li>
<li>Mah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+analysis+of+protein+kinase+complex+Dbf2-Mob1+by+peptide+library+and+proteome+array+screening%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening.</a> BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).</li>
</ol>

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

SPOT synthesis tel que décrit ici est une méthode puissante pour cartographier les sites d&#39;interaction protéine-protéine et d&#39;enquêter sur la reconnaissance de substrat de peptide enzymes de modification. Cependant, la synthèse SPOT a encore certains inconvénients, car bien que les peptides synthétisés par la méthode de SPOT sont signalés à avoir plus de 90% de pureté 21 ce est difficile de confirmer dans chaque cas. Par conséquent, les résultats doivent être reproduits par d&#39;autres méthodes, par ...

Dans les deux dernières décennies, plusieurs rapports ont démontré l&#39;importance des modifications post-traductionnelles (PTM) dans le développement cellulaire et plusieurs maladies comme le cancer, mais récemment protéines lysine méthylation a émergé comme une autre PTM vitale. Alors qu&#39;initialement la méthylation des histones de la lysine a été jugée une marque essentielle de la chromatine, travail plus tard a également montré lysine méthylation de plusieurs protéines non-histones 1-4. Le transfert séquentiel des groupes méthyle de la S-adénosyl-L-méthionine dans le groupe des résidus de lysine ε-amino est catalysée par une famille d&#39;enzymes appelée protéine Lysine méthyltransférases (PKMTs) qui contient plus de 60 protéines dans le génome humain. PKMTs ont d&#39;abord découvert que la modification des histones enzymes qui méthylate résidus de lysine spécifique, mais des rapports ultérieurs ont démontré qu&#39;elles pouvaient aussi méthylation des protéines non-histones 5. Jusqu&#39;à présent, environ 5000 sites de méthylation de la lysine ont été identifiés sur différentes protéines 6 </sinscrire&gt;, mais les enzymes responsables de ces modifications sont souvent pas identifiés. Une raison à cela est que la spécificité de la plupart des PKMTs n&#39;a pas été étudié en profondeur. Par conséquent, il se produit de façon récurrente que de nouveaux substrats de PKMTs sont découverts. L&#39;absence d&#39;une connaissance détaillée de la spécificité de substrat de PKMTs entrave la compréhension de leur fonction biologique et son rôle. Pour étudier la spécificité d&#39;un PKMT en détail, les taux de plusieurs substrats peptidiques qui diffèrent par une ou quelques acides aminés méthylation doivent être mesurées et comparées, qui est idéalement effectuée en utilisant des réseaux de peptides. Basé sur les profils de spécificité résultant, substrats potentiels de PKMTs peuvent être identifiés qui peuvent être étudiées plus loin. matrices de peptides sont des outils largement utilisés pour l&#39;analyse biochimique des anticorps, des peptides et des enzymes de modification de la cartographie des sites d&#39;interaction protéine-protéine (anticorps-antigène, récepteur-ligand) 9.7. Plusieurs centaines de peptides sont nécessaires pour Such applications. Différentes méthodes sont disponibles pour la synthèse des peptides, parmi lesquels Peptide Synthesis de résine est très couramment utilisée, mais elle présente des limites du débit et il est relativement coûteux. Ces problèmes ont été résolus avec l&#39;introduction de la méthode de synthèse SPOT par Frank et ses collègues 10. Procédé de synthèse SPOT permet la synthèse de plusieurs centaines de peptides en parallèle et, en moyenne, il est peu coûteux par rapport à la synthèse de la résine. Les peptides synthétisés sur membrane de cellulose peuvent être utilisées soit directement pour diverses applications ou des peptides peut être clivé à partir de la membrane et utilisés comme peptides libres dans les analyses en solution ou pour préparer des puces à peptides 10-13. Synthèse SPOT est une variante de la synthèse peptidique en phase solide, qui utilise une membrane de cellulose comme support solide et emploie la chimie classique Fmoc-10-13. Par conséquent, la synthèse des chaînes de peptides à partir de l&#39;extrémité C-terminale et se dirige versl&#39;extrémité N-terminale à la différence de la synthèse biologique des ribosomes. Les membranes de cellulose sont fonctionnalisées pour la fixation du premier amino-acides activés (Fig. 1). Procédé SPOT est basé sur la livraison séquentielle des acides aminés activés dans une gouttelette de solvant à des endroits définis sur la membrane en utilisant un système de pipetage automatisé. La gouttelette de liquide est distribué sur la membrane poreuse, où il forme une tache humide circulaire, qui agit ensuite comme un réacteur ouvert pour les réactions chimiques dans la synthèse des peptides. La taille du spot est déterminée par le volume distribué et la capacité d&#39;absorption de la membrane, des multiples de ces taches sont disposées en rangées. L&#39;échelle de la synthèse en corrélation avec la taille de la place et la capacité de chargement de la membrane. La distance entre les points et la densité de réseaux sont gérés en faisant varier les tailles de spot. membrane de cellulose a plusieurs avantages en tant que phase solide dans la synthèse peptidique, il est peu coûteux, tolérant à la chemicals utilisés en synthèse peptidique, dans des solutions aqueuses stables et faciles à manipuler. De plus, sa nature hydrophile rend approprié pour plusieurs systèmes d&#39;analyse biologique. synthèse de SPOT peut être effectuée manuellement ou automatisé (pour 1000s des peptides) selon le nombre requis de peptides. Un synthétiseur de SPOT entièrement automatisé de Intavis (Köln, Allemagne) est utilisé pour nos applications. Il permet la synthèse de peptides en différentes quantités et de longueur différente. Peptides linéaires sont régulièrement synthétisés avec 15 à 20 amino acides de longueur, dans les peptides d&#39;addition de jusqu&#39;à 42 acides aminés peuvent également être préparés par synthèse par étapes 14,15. Cependant, l&#39;augmentation du nombre d&#39;acides aminés conduit à des réductions des rendements de couplage ensemble, ce qui affecte la qualité des peptides. En raison de la faible quantité de peptides par point, les produits sont souvent difficiles à purifier et la qualité de peptides individuels ne peuvent pas être facilement évalués. Par conséquent, les résultats obtenus à partir de SPOT Peptide matrices doivent être confirmées, soit avec des peptides synthétisés par des procédés standard à plus grande échelle, qui peuvent être purifiés et analysés selon les normes en synthèse peptidique ou par la synthèse des protéines contenant les séquences peptidiques souhaitées. Pourtant, nous avons trouvé la synthèse de SPOT pour être très fiable et des résultats généralement être reproductible. synthèse SPOT est pas limitée aux acides aminés protéinogènes, plusieurs acides aminés modifiés disponibles dans le commerce peuvent également être utilisés pour la synthèse, ce qui permet peptides à être modifiés avant et après le clivage final du groupe de protection de chaîne latérale et, en outre, elle permet également l&#39;incorporation de acides aminés phosphorylés, méthylés ou acétylés 11. Des banques de peptides immobilisés synthétisés par la méthode Spot peuvent être directement utilisés pour de nombreuses analyses biologiques et biochimiques. Nous avons utilisé des réseaux peptidiques comprenant les peptides 300-400 pour étudier la spécificité de substrat de PKMTs. Pour modifi enzymatiquecation, les matrices de peptides sont incubés avec la PKMT respectif et étiqueté [méthyl-3H] -AdoMet dans un tampon approprié. La méthylation du substrat respectif est analysé par la suite du transfert enzymatique des groupes méthyle à marqueur radioactif de l&#39;AdoMet pour le substrat peptidique par autoradiographie (fig. 3). Par ce procédé, les tableaux peptidiques permettent l&#39;étude de la méthylation de différents substrats peptidiques en même temps. Un avantage important de ce procédé est que tous les peptides sont méthylés en compétition, de telle sorte que pendant la phase linéaire de la cinétique de méthylation, la méthylation relative de chaque peptide est proportionnelle à la constante de vitesse catalytique divisée par la constante de dissociation (k cat / K D) de l&#39;enzyme pour le substrat peptidique respective. Par conséquent, la quantité de radioactivité incorporée dans chaque spot est directement corrélée à l&#39;activité enzymatique vers le peptide particulier. Utilisation de larésultats d&#39;une expérience de méthylation de réseau peptidique, le profil de spécificité de la PKMT peuvent être définis et sur cette base de nouveaux substrats peut être fondée. Matrices peptidiques permettent la validation rapide et efficace et de coût de la méthylation de nouveaux substrats au niveau des peptides. Pour cela, on prépare des tableaux qui contiennent les nouveaux substrats prédites avec des peptides modifiés contenant une Ala à la place de Lys à des sites cibles ainsi que les peptides témoins positifs et négatifs. Enfin, les nouveaux substrats peuvent être préparés comme des protéines ainsi que des mutants, dans lequel la cible Lys est modifiée à Ala et la méthylation peut être confirmée au niveau de la protéine. Selon les résultats, ce est alors suivi par des études biologiques portant sur les rôles potentiels de la méthylation des substrats protéiques nouvellement décrites.

<table><tbody><tr><td>Éthanol abs Gradient Grade HPLC</td><td>Honeywell</td><td>10299901</td><td>Inflammable</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide Synthèse peptidique</td><td>Biosolve</td><td>4193302</td><td>Inflammable,</td></tr><tr><td>Toxique Piperidine &ge ; 99 % pour la synthèse peptidique</td><td>Roth</td><td>A122.1</td><td>Inflammable, toxique, corrosif</td></tr><tr><td>Oxyma Pure (éthyl(hydroxyimino)cyanoacétate )</td><td>Novabiochem</td><td>8510860100</td><td></td></tr><tr><td>N,N' -Diisopropylcarbodiimide purum &ge ; 98 % GC</td><td>Fluka</td><td>38370</td><td>Inflammable, Toxique, corrosif</td></tr><tr><td>Anhydride acétique</td><td>Roth</td><td>CP28.1</td><td>Inflammable, Toxique, corrosif</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane 99 %</td> <td>Aldrich</td><td>233781</td><td>Inflammable,</td></tr><tr><td>Toxique Dichlorméthane &ge ; 99,9 %</td><td>Roth</td><td>P089.1</td><td>Cancérogène</td></tr><tr><td>N-Methyl-2-Pyrrolidone</td><td>Roth</td><td>4306.2</td><td></td></tr><tr><td>Membrane de cellulose dérivée</td> toxique <td>Intavis AG K&ouml ; ln</td><td>32.1</td><td></td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique</td><td>Roth</td><td>P088.2</td><td>Toxique, corrosif</td></tr><tr><td>Bromphenolblue</td><td>AppliChem</td><td>A3640.0010</td><td></td></tr><tr><td>Carbonate d’ammonium</td><td>Roth</td><td>T871.2</td><td>Granules toxiques</td></tr> de <tr><td>dodécylsulfate de sodium</td><td>Roth</td><td>CN30.3</td><td>Toxique, inflammable</td></tr><tr><td>Synthétiseur MultiPep</td><td>Intavis AG K&ouml ; ln</td><td>n.a.HyperfilmTM</td><td></td></tr> <tr><td>film haute performance</td><td>GE Healthcare</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>logiciel Phoretix</td><td>TotalLab</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

spécificité analyse des protéines lysine methyltransferases utilisation spot peptide arrays

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine méthylation est une modification post-traduction émergent et il a été identifié sur plusieurs protéines histones et non-histones, où il joue un rôle crucial dans le développement des cellules et de nombreuses maladies. Environ 5 000 sites de méthylation de la lysine ont été identifiés sur différentes protéines, qui sont fixés par quelques douzaines de protéines méthyltransférases de lysine. Ceci suggère que chaque PKMT méthylation de multiples protéines, mais jusqu&#39;à présent, seulement un ou deux substrats ont été identifiés pour plusieurs de ces enzymes. Analyse réseau de peptides Pour aborder ce problème, nous avons introduit la spécificité de substrat à base de PKMTs. Tableaux peptidiques sont des outils puissants pour caractériser la spécificité de PKMTs parce méthylation de plusieurs substrats avec différentes séquences peut être testée sur un réseau. Nous avons synthétisé tableaux peptidiques sur membrane de cellulose en utilisant un synthétiseur Intavis SPOT et analysé la spécificité des différents PKMTs. Basé sur les résultats, pour plusieurs de ces enzymes, romanubstrates pu être identifiés. Par exemple, en employant pour NSD1 matrices de peptides, nous avons montré qu&#39;il méthylation H4 K44 de la place de la H4K20 rapporté et en outre le substrat H1.5K168 est hautement préféré sur la H3K36 précédemment connu. Par conséquent, les tableaux peptidiques sont des outils puissants pour caractériser biochimiquement les PKMTs.

tableaux de peptides ont été utilisés avec succès pour caractériser biochimiquement la spécificité de PKMTs, et plusieurs roman histones et non-histones substrats de PKMT ont été identifiées par cette approche 5,16-19. Définir le spectre de substrat correcte d'un PKMT (ou ne importe quelle enzyme) est une étape essentielle vers la compréhension de son mécanisme moléculaire et les fonctions cellulaires. A titre d'exemple de l'application de la méthode de méthylation tableau peptide...

Les réseaux de peptides synthétisés par la méthode SPOT peuvent être utilisés pour analyser la spécificité du substrat des protéines lysine méthyltransférases (PKMT) et pour définir le spectre du substrat des PKMT afin de comprendre leur rôle biologique. Ce protocole décrit comment synthétiser des réseaux de peptides, les méthyler avec des PKMT et analyser les résultats.

Spécificité Analyse des protéines lysine Methyltransferases Utilisation SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

L’objectif général de l’expérience suivante est d’étudier la spécificité du substrat des protéines lysine méthyltransférases ou PK mts. Ceci est réalisé par l’identification d’un substrat initial et la préparation de réseaux de peptides avec plusieurs variantes de ce substrat contenant des échanges d’acides aminés uniques à différentes positions. Dans un deuxième temps, le réseau de peptides est incubé avec le PKMT en présence d’un donneur de groupe méthyle radioactif, ce qui permet de détecter la méthylation peptidique par transfert de la radioactivité vers le point peptidique correspondant.Ensuite, le réseau est exposé à un film de rayons X et analysé quantitativement afin de déterminer l’activité de méthylation au niveau de chacun des peptides. Et pour définir le profil de spécificité du PKMT, les résultats montrent quels acides aminés du peptide de substrat sont critiques pour sa méthylation par le PKMT. Le principal avantage de cette technique ou des méthodes existantes telles que la méthylation de peptides individuels est qu’un certain nombre de peptides différents peuvent être testés dans une seule expérience de manière rentable.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la méthylation des protéines lym, telles que la spécification de nouveaux substrats de PK mtss jusqu’alors inconnus. Cette méthode peut donc donner un aperçu de la spécificité des MTS PK. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que les protéines kinases, d’autres méthodes protéiques, les transférases ou l’ajout à des transférases.J’ai eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque je me suis familiarisé avec la possibilité de préparer de grands réseaux de peptides personnalisés à des coûts raisonnables en utilisant la synthèse ponctuelle de peptides. Pour commencer cette procédure, concevez des séquences peptidiques pour la synthèse à l’aide du logiciel multi pep spotter. Entrez les séquences peptidiques sous la forme d’un code d’une seule lettre, chaque lettre définissant l’acide aminé spécifique suivant ce pré-gonflement, la membrane ponctuelle fonctionnalisée de l’amino peg à l’extrémité, l’extrémité du diméthylformamide ou du DMF pendant 10 minutes. Une fois terminé, placez la membrane humide sur le cadre du synthétiseur sans bulles d’air ni plis.Séchez complètement la membrane pendant au moins 10 minutes avant de commencer le programme de synthèse. Lavez la membrane trois fois avec de l’éthanol à 100 % pour générer la liaison amide avec le groupe amino libre sur la membrane. Activez le groupe carboxy de l’acide aminé entrant en ajoutant du DIC et de l’éthylhydroxy-amino-acétate de sino au dérivé de l’acide aminé.Après l’activation, repérez les volumes souhaités d’acides aminés activés sur la membrane fonctionnalisée de l’amino-cheville à l’aide du robot programmable. Répétez l’étape précédente trois fois pour assurer un meilleur couplage du premier acide aminé activé. Après avoir incubé la membrane pendant 20 minutes, lavez-la avec du DMF pour éliminer les acides aminés découplés après séchage et en bloquant les groupes aminés libres.Lavez la membrane avec du DMF quatre fois, puis incubez avec 20 % de pipérine dans du DMF pendant 20 minutes pour éliminer le groupe protecteur FM. Après avoir lavé et séché la membrane, répétez les étapes de déblatage et d’élimination du MOC F jusqu’à ce que la longueur de peptide souhaitée soit atteinte. Après la dernière protection F MOC groupe D, laver la membrane avec du DMF et de l’éthanol à 100 %.Traitez ensuite la membrane avec 0,02 % de bleu de phénol brom dans du DMF pendant au moins cinq minutes jusqu’à ce qu’elle devienne complètement bleue. Après avoir lavé et séché la membrane, retirez-la du synthétiseur et placez-la dans une boîte résistante aux produits chimiques. Traitez-le avec 20 à 25 millilitres d’un mélange de protection de la chaîne latérale D, composé de 95 % d’acide trichloracétique pour cliver les groupes protecteurs de la chaîne latérale et de réactifs de piégeage pour protéger les chaînes latérales d’acides aminés de la modification.Après s’être assuré que le mélange de protection en profondeur recouvre la membrane, fermez complètement la boîte et incubez-la pendant une à deux heures en la secouant doucement après l’incubation. Lavez la membrane six fois avec 20 à 25 millilitres de di chlorométhane pendant deux minutes chacune. Après avoir lavé deux fois avec de l’éthanol à 100 %, séchez la membrane dans un dessiccateur pendant la nuit.Ensuite, pré-incubez la membrane du réseau peptidique dans un sac en plastique scellé contenant le tampon de méthylation respectif sans enzyme et l’amet avec le groupe méthyle radioactivement marqué Pendant 10 minutes, jetez le tampon de pré-incubation et incubez la membrane dans huit millilitres de tampon de méthylation contenant le PKMT respectif pendant une à deux heures. Ensuite, jetez le tampon de méthylation dans un conteneur de déchets radioactifs et lavez les réseaux de peptides cinq fois avec 20 millilitres de tampon contenant 100 millimolaires de bicarbonate d’ammonium, et 1 % de STS pendant cinq minutes pour éliminer la protéine liée. Après avoir jeté le dernier tampon de lavage dans le conteneur de déchets radioactifs, incubez la membrane pendant cinq minutes dans 10 millilitres de solution amplifiée.Jetez ensuite la solution d’amplification dans le conteneur de déchets radioactifs pour les solvants organiques. Scellez le réseau de peptides dans un sac en plastique et placez-le dans une cassette de radiographie automatique. Placez le film de radiographie automatique sur le peptide dans une pièce sombre.Fermez ensuite la cassette avec précaution. Après avoir exposé le film à moins 80 degrés Celsius, développez-le pour analyser les résultats. Enfin, capturez l’image plusieurs fois avec des temps d’exposition différents pour éviter la saturation des substrats peptidiques fortement méthylés.Un exemple de réaction de méthylation d’un réseau de peptides avec un réseau de peptides NSD est présenté ici. L’axe horizontal représente la séquence du peptide et dans la direction verticale. L’acide aminé altéré est indiqué méthylation avec nsd, l’un montre qu’il agit spécifiquement sur H trois K 36 et reconnaît trois à quatre résidus d’acides aminés de chaque côté de la consolidation de la lysine cible des trois expériences de réseau peptidique de NSD un est montré ici.Environ 85 % des peptides présentent des écarts-types inférieurs à plus ou moins 20 % et plus de 97 % des peptides présentent des écarts-types inférieurs à plus ou moins 30 %. Les données du facteur de discrimination calculé montrent que NSD un préfère les résidus aromatiques à la position moins deux. Aux sites moins un et plus deux, il préfère les résidus atiques hydrophobes. Et au site plus un, il y a une préférence pour l’arginine, la lysine, la glutamine ou l’asparagine.De nouveaux substrats peptidiques potentiels peuvent être trouvés en effectuant des recherches dans des bases de données du protéome humain. Une forte méthylation de certains de ces peptides avec ome confirme leur identité en tant que nouveaux substrats peptidiques NSD un. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’utiliser le substrat initial le plus approprié Après cette procédure.D’autres méthodes telles que la méthylation des protéines correspondantes in vitro et dans les cellules peuvent être effectuées afin de savoir si les protéines sont acceptées comme substrats, ainsi qu’après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la mésylation de la protéine lysine, pour définir la spécificité du substrat de nombreux MT PK et identifier plusieurs nouveaux substrats. Cela a permis de comprendre l’importante fonction biologique de PK mts.N’oubliez pas qu’il est possible d’affirmer que le travail avec la radioactivité et les solvants organiques dans la synthèse des peptides et que des précautions appropriées doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

specificity-analysis-protein-lysine-methyltransferases-using-spot

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Composés de capture sont trifonctionnel petites molécules afin de réduire la complexité du protéome par fonctionnels réversibles petite molécule de protéine d'interaction suivie par la photo-réticulation et de purification. Ici, nous utilisons un composé de capture avec...

Profilage de la méthyltransférase et autres S-Adénosyl- L-Homocystéine protéines liant par spectrométrie de masse de captation composé (CDSM)

Nous présentons une méthode pour l'utilisation de la spectrométrie de masse MALDI et de la chimie méthylation réductrice pour quantifier les changements dans la méthylation de la lysine.

Application de la MassSQUIRM pour des mesures quantitatives de l&#39;activité Déméthylase Lysine

Cette vidéo présente une technique qui applique la technologie des microréseaux peptidiques pour profiler la spécificité des anticorps reconnaissant les modifications post-traductionnelles (PTM) sur les peptides d’histones. Une lame de microréseau contenant des peptides d’histones conjugués à des fluorophores immobilisés avec des combinaisons PTM connues est traitée avec des anticorps spécifiques de PTM cibles. Ce processus permet d'identifier la spécificité de l'anticorps pour la cible et sa...

Une technologie de microréseau peptidique pour le profilage de spécificité des anticorps

En combinant natif et réticulation immunoprécipitation de la chromatine à haute résolution de spectrométrie de masse, l'approche ChroP permet de disséquer l'architecture protéomique composite de modifications des histones, des variantes et des protéines non-histoniques synergie au domaines de la chromatine fonctionnellement distinctes.

L&#39;approche ChroP Combine puce et la spectrométrie de masse à Disséquer protéomiques paysages Locus spécifiques de la chromatine

Le criblage de peptides est un test à haut débit permettant d’identifier les sites d’interaction protéine-protéine. Cela permet de cartographier plusieurs interactions d’une protéine cible et peut servir de méthode pour identifier les sites d’inhibiteurs qui ciblent une protéine. Nous décrivons ici un protocole de criblage et d’analyse des réseaux de peptides.

Identifier les sites d&#39;interaction protéine-protéine à l&#39;aide de peptides tableaux

Ce manuscrit décrit des méthodes pour l'application de la technologie des micro-aigres peptidiques au profilage spécifique des anticorps qui reconnaissent les histones et leurs modifications post-traductionnelles.

Analyse de la spécificité d&#39;anticorps d&#39;histone avec des microarrays de peptides

Nous présentons ici un protocole pour déterminer la spécificité de la protéase dans les tissus de souris brut extraits par spectrométrie de MALDI-TOF.

La détermination de la spécificité de la protéase dans les tissus de souris extraits par spectrométrie de masse MALDI-TOF : manipulation PH afin de provoquer des modifications de la spécificité

Ce flux de travail décrit la performance de l’enrichissement rentable et temporel de multiples modifications post-traductionnelle (PTM) de protéines simultanément pour l’analyse protéomique globale quantitative. Le protocole utilise l’enrichissement ptM de niveau peptidique avec de multiples anticorps conjugués, suivi d’une analyse de spectrométrie de masse d’acquisition indépendante des données pour obtenir des connaissances biologiques sur le crosstalk PTM.

Enrichissement simultané d’affinité de deux modifications post-traductionnelle pour la quantification et la localisation des sites

La méthylation de l’arginine (R) est une modification post-traductionnelle généralisée régulant de multiples voies biologiques. La spectrométrie de masse est la meilleure technologie pour établir le profil global du R-méthyl-protéome, lorsqu’elle est couplée à des approches biochimiques pour l’enrichissement peptidique modifié. Le flux de travail conçu pour l’identification à haut niveau de confiance de la R-méthylation globale dans les cellules humaines est décrit ici.

Une approche protéomique basée sur la spectrométrie de masse pour l’analyse globale et à haut niveau de confiance de la R-méthylation des protéines

Cet article décrit une méthode de préparation d’échantillons basée sur l’inactivation thermique pour préserver les peptides endogènes en évitant la dégradation post-mortem, suivie d’une quantification relative utilisant le marquage isotopique plus LC-MS.

Préparation des échantillons et quantification relative à l’aide de la méthylation réductrice des amines pour les études peptidomiques

Un protocole protéomique de marquage de proximité des lysosomes neuronaux est décrit ici pour caractériser le microenvironnement lysosomal dynamique dans les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme. Les protéines de la membrane lysosomale et les protéines qui interagissent avec les lysosomes (de manière stable ou transitoire) peuvent être quantifiées avec précision dans cette méthode avec une excellente résolution spatiale intracellulaire dans les neurones...

Caractérisation de l’interactome du lysosome neuronal avec protéomique de marquage de proximité

Apprenez à analyser la spécificité des méthyltransférases lysine de protéines (PKMT) en utilisant des arrays de peptides SPOT. Cette méthode permet d'identifier les acides aminés critiques pour la méthylation et de définir les profils de spécificité enzymatique.

Spécificité Analyse des protéines lysine Methyltransferases Utilisation SPOT Peptide Arrays

Explorer plus de vidéos