Name: Une Ex vivo Modèle de T-Cell Attaque de Oligodendrocyte dirigée dans aigus tranches cérébrales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Découvrez un modèle ex vivo d'attaque des oligodendrocytes par les lymphocytes T CD8+ dans des tranches cérébrales aiguës. Cette méthode permet d'étudier la démyélinisation et l'apoptose neuronale en neuroimmunologie.

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Ce travail a été soutenu par le Centre interdisciplinaire de recherche clinique (IZKF) de Münster (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 à S.G.M. ME3283/2-1 à S.G.M.) et par Innovative Medizinische Forschung, Münster (I-BI111316, SB et SGM).

Toutes les expériences utilisant des souris doivent être effectuées en conformité avec les directives du comité de protection des animaux et l&#39;utilisation institutionnelle respective. 1. Observations générales pour l&#39;expérimentation de la souris <ol><li> Gardez les souris dans des conditions exemptes d&#39;agents pathogènes et de leur permettre l&#39;accès à la nourriture et de l&#39;eau ad libitum. NOTE: Il est important d&#39;utiliser des souris d&#39;âge et le sexe dans les groupes expérimentaux parce que les habitudes immunologiques peuvent varier avec l&#39;âge et le sexe. </li></ol> 2. Préparation des cellules T et l&#39;activation de OVA-spécifiques CD8 + (OT-I) <ol><li> Effectuer la stimulation des cellules T OT-I comme décrit ci-dessous cinq jours avant de préparer des tranches de cerveau. NOTE: 5 x 10 5 effectrices CD8 + activées OT-I des cellules T CD8 + (cellules T de souris transgéniques qui reconnaissent le peptide OVA seule 257-264 dans le contexte de molécules du CMH-I) sont nécessaires par tranche la concentration 5 x 10 5 a été choisi expérienceallié comme optimale une à favoriser une bonne interaction cellule-cellule une fois que les cellules commencent à migrer dans la tranche et, en même temps, la quantité de cellules ne est pas trop élevée pour induire une réaction excessive permettant cellule unique comptant 8,18. </li><li> Préparer le milieu de culture de cellules T OT-I. Supplément 500 ml de DMEM avec 5% de sérum de veau foetal (FCS), 10 mM d&#39;HEPES, 2 mM de L-glutamine, 50 pM de 2-mercaptoéthanol, 1% acides aminés non essentiels et 25 ug / ml de gentamicine. Conserver le milieu à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Retirer la rate de souris transgéniques OT-I par référence 16. Les transférer dans le milieu préparé. </li><li> Générer suspension cellulaire unique en écrasant les rates à travers une passoire et centrifuger la suspension de 70 um à 300 g pendant 5 min, 4 ° C. </li><li> Incuber suspension de cellules avec 5 ml de chlorure d&#39;ammonium-potassium (ACK) du tampon (150 mM de NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, 0,1 mM d&#39;EDTA, pH 7,3) pendant 5 minutes pour lyser les globules rouges. </li><li> Arrêtez incubatiavec un milieu de 10 ml et on centrifuge à nouveau comme décrit ci-dessus. </li><li> Diluer la suspension de cellules dans un milieu et calculer des nombres. cellules de la plaque à une densité de 3 x 10 7 cellules / puits dans une plaque à 12 puits et on les premier par incubation avec de l&#39;OVA 257-264 (SIINFEKL; 1 nM) et de l&#39;interleukine 2 (IL-2) (500 UI / ml) pendant 5 jours. </li><li> Après 4 jours, ajouter l&#39;IL-2 à une concentration de 500 UI / mL à nouveau. </li><li> Après stimulation, les cellules T purifier OT-I de la suspension de cellules à l&#39;aide d&#39;une sélection négative à base de souris CD8 + kit d&#39;isolement des cellules T suivant les instructions du fabricant. La purification est basée sur l&#39;épuisement de toutes les cellules CD8 + non en utilisant un cocktail d&#39;anticorps contre CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, CMH de classe II, Ter-119, et TCRy / δ qui sont ensuite mis au rebut en utilisant des colonnes magnétiques pour l&#39;élution des cellules T CD8 + purifiées. REMARQUE: Les étapes critiques dans ce procre sont indiqués par les constructeurs: il est important que la réaction ne implique que des cellules uniques, car la présence de touffes peut bloquer la colonne lors de l&#39;étape d&#39;élution; le comptage de la cellule avant l&#39;addition du cocktail Byotin est important que le degré de pureté de l&#39;échantillon et le test doit être réalisé sur de la glace pour minimiser les liaisons non spécifiques des anticorps. </li></ol> 3. Préparation des tranches de cerveau aiguë et co-culture avec des cellules T OT-I <ol><li> Avant la préparation de cerveau aiguë tranches 19, préparer une solution saline placedine glacée physiologique utilisant le saccharose 200 mM, 20 mM de PIPES, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM NaH 2 PO 4, mM MgSO 4, 10 0,5 CaCl2 et 10 mM de dextrose et le liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) en utilisant 125 mM de NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 24 mM de NaHCO 3, 2 mM de MgSO 4, 2 mM de CaCl2, 10 mM de dextrose. Ajuster le pH de chaque solution à 7,35 par usinNaOH g. Avant d&#39;ajuster le pH de l&#39;ACSF, solution doit être fait barboter avec un mélange de 95% O 2 et 5% de CO 2. </li><li> Pré-refroidir les solutions. </li><li> Anesthésier 8 - souris âgées 10 semaines (par exemple, C57BL / 6 que le contrôle ou transgénique ODC-OVA souris 17 à l&#39;inhalation en utilisant 5,0% d&#39;isoflurane, 5,0% d&#39;halothane ou injecter 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine de poids corporel par ip Attendre pour l&#39;anesthésie et utiliser une pincée d&#39;orteil pour évaluer le niveau de l&#39;anesthésie et décapiter à la fois. Euthanasier la souris selon protection des animaux et utiliser des critères du comité pour l&#39;euthanasie. </li><li> Mettez la souris en position ventrale. Désinfecter et couper le cuir chevelu sagittalement. Ouvrez l&#39;os crânien sagittal, retirez rapidement le cerveau à l&#39;aide d&#39;une pelle et le fixer sur la plaque d&#39;un vibratome en utilisant de la colle. </li><li> Remplir la plaque avec la solution saline préparée placedine glacée physiologique. </li><li> Couper 300 um coupes coronales avec le vibratome. NOTE: Cette procédure est connuen pour obtenir des échantillons de tissus intacts viables appropriés pour des études fonctionnelles cellulaires dans un intervalle de temps d&#39;au moins 8 h 19 à 21. En effet, après cette période de temps, commence déjà après 6 h, la préparation montre la qualité réduite, à savoir la modification des propriétés de base et fonctionnelles comme action potentielle génération et la propagation. </li><li> Après la coupe, transférer une tranche immédiatement dans chaque puits d&#39;une plaque de 12 puits rempli d&#39;ACSF. </li><li> Ajouter soigneusement 5 x 10 5 cellules T OT-I par tranche. </li><li> Incuber tranches jusqu&#39;à 8 heures dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Après la période d&#39;incubation, les tranches de récolte et de les intégrer en utilisant octobre composé Tissue-Tek et les congeler dans l&#39;azote liquide. Rangez-les à -20 ° C pour de plus amples études histologiques à par exemple, évaluer la structure neuronale (par exemple, en utilisant anti-MAPII ou des anticorps anti-synaptophysine) ou l&#39;apoptose (par exemple, en utilisant des anti-caspase-3 et des anticorps anti-NeuN anti-corps) selon des procédures standard. </li></ol>

<ol><li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+demyelination+in+PML+and+MS%3A+Similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences.</a> Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).</li>
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<li>Hogquist, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76 (1), 17-27 (1994).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+transgenic+mice+expressing+ovalbumin+in+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes.</a> Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).</li>
<li>Göbel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29+CD25%28%2B%29+FoxP3%28%2B%29+regulatory+T+cells+suppress+cytotoxicity+of+CD8%28%2B%29+effector+T+cells%3A+implications+for+their+capacity+to+limit+inflammatory+central+nervous+system+damage+at+the+parenchymal+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level.</a> J Neuroinflammation. 9, 41(2012).</li>
<li>Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin+slice+preparation+for+patch+clamp+recordings+from+neurones+of+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system.</a> Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).</li>
<li>Meuth, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+TWIK-related+acid-sensitive+K%2B+channel+1+%28TASK1%29+and+TASK3+channels+to+the+control+of+activity+modes+in+thalamocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons.</a> J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).</li>
<li>Misgeld, U., Frotscher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+the+viability+of+neurons+in+hippocampal+slices+on+oxygen+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply.</a> Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).</li>
<li>Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+activation+of+antigen-specific+CD8%2B+T+cells+in+the+presence+of+antigen+in+organotypic+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices.</a> J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Différents modèles animaux ont été décrits au cours des dernières décennies pour répondre aux caractéristiques pathologiques de troubles inflammatoires démyélinisantes comme MS. In vivo des modèles de souris et de rat sont largement utilisés pour imiter les caractéristiques physiopathologiques de la maladie, à savoir, l&#39;analyse des conséquences des processus de démyélinisation et de remyélinisation et des épisodes entremêlées de l&#39;inflammation et de la neurodégénérescence. Néanmoins, seule une approche ...

La mort des oligodendrocytes et la destruction de la gaine de myéline accompagnées d’une perte de neurones et d’axones sont des signes pathologiques typiques des lésions de la matière grise chez les personnes atteintes de sclérose en plaques (SEP)1,2. Les lésions corticales peuvent être divisées jusqu’à présent en trois sous-types différents2 : lésions sous-piales, intracorticales et leuco-corticales. Par rapport aux plaques de substance blanche, les infiltrats sont caractérisés par une prédominance de lymphocytes T CD8+, suggérant leur possible rôle décisif dans l’inflammation de la matière grise3. De plus, des expansions oligoclonales dans le sang, le liquide céphalo-rachidien (LCR) et dans les lésions inflammatoires peuvent être observées pour les lymphocytes T CD8+ eux-mêmes 4-6. 
Dans le même ordre d’idées, on suppose que les lymphocytes T CD8+ peuvent être spécifiques de différentes protéines de myéline7,8. En effet, les lymphocytes T CD8+ se trouvent à proximité des oligodendrocytes et des gaines de myéline9,10 qui montrent l’expression du CMH I11 et pourraient donc être responsables de la perte de la gaine de myéline. Ce processus est souvent associé à d’importantes lésions neuronales et axonales « collatérales » dans la matière grise du système nerveux central (SNC)1,2. En fait, la mort directe et indirecte des oligodendrocytes et des neurones est induite par les lymphocytes T CD8+ via deux mécanismes différents : (i) le gonflement et la rupture de la membrane cellulaire dus à la formation de granules cytotoxiques suite à la libération de perforines et de granzymes et (ii) la ligature des récepteurs Fas ou l’exposition de FasL à leur surface8,12,13.
Différents types de modèles animaux sont établis pour étudier le mécanisme sous-jacent des processus mentionnés. À cet égard, les lymphocytes T CD8+ amorcés spécifiques des auto-antigènes dont l’expression est induite dans les cellules gliales du SNC, comme les oligodendrocytes ou les astrocytes, peuvent être transférés adoptivement pour analyser la mort neuronale et axonale ''collatérale'' dans la matière grise par la suite14,15. La réalisation de telles expériences in vivo est d’une grande aide pour imiter certains aspects physiopathologiques de la SEP, cependant, cette approche n’est pas adaptée pour résoudre le mécanisme sous-jacent et la cinétique des lésions axonales et de l’apoptose neuronale.
Pour surmonter ces restrictions, une approche ex vivo a été mise en place pour étudier les mécanismes et l’évolution temporelle de la mort cellulaire neuronale à la suite d’une attaque de lymphocytes T CD8+ dirigée par des oligondendrocytes. Étant donné que seuls les oligodendrocytes et donc la production de gaine de myéline devraient être ciblés par les cellules immunitaires, des cellules T OT-I réactives à l’ovalbumine (OVA) restreintes au CMH (OVA) sont utilisées16. Ces cellules sont ensuite transférées dans des coupes de cerveau obtenues à partir de souris exprimant sélectivement des OVA dans des oligodendrocytes (souris ODC-OVA)17.

<table><tbody><tr><td>Plaque 12 puits</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutan</td><td>Roth</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro ; m passoire</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>1.02382.0500</td><td>chlorure</td></tr><tr><td>de calcium CD8+-isolation</td><td>kit Miltenyi Biotech</td><td>130-090-859</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glucose</td><td>Merck</td><td>1.08337.1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15-151</td><td>sérum de veau fœtal</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-050</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Peprotech</td><td>212-12</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Abbott</td><td>05260-05</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04933.0500</td><td>chlorure de potassium</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>P9144</td><td>hydrogénocarbonate de potassium</td></tr><tr><td>L-Glutamine Gibco</td><td></td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck</td><td>1.05886.0500</td><td>sulfate de magnésium</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td>chlorure</td></tr> <tr><td>de sodiumNaH2PO4 * H2O</td><td>Merck</td><td>1.06346.0500</td><td>hydrogénophosphate de sodium</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td>hydrogénocarbonate de sodium</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1.09137.1000</td><td>hydroxyde de sodium</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>213330</td><td>chlorure d’ammonium</td></tr><tr><td>Acide aminé non essentiel</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>OVA (257-264)</td><td>Genscript</td><td>RP10611</td><td>ovalbumine</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Merck</td><td>1.07687.1000</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

une ex vivo modèle de t-cell attaque de oligodendrocyte dirigée dans aigus tranches cérébrales

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

La mort des oligodendrocytes accompagnée de la destruction des neurones et des axones sont des signes histopathologiques typiques des lésions de la substance grise corticale et sous-corticale dans les troubles inflammatoires démyélinisants comme la sclérose en plaques (SEP). Dans ces troubles, on trouve principalement des lymphocytes T CD8+ de spécificité présumée pour les antigènes liés à la myéline et aux oligodendrocytes, de sorte que l’apoptose neuronale dans les lésions de la matière grise peut être un effet collatéral de ces cellules. Différents types de modèles animaux sont établis pour étudier les mécanismes sous-jacents des processus physiopathologiques mentionnés. Cependant, bien qu’ils imitent certains aspects de la SP, il est impossible de disséquer le mécanisme exact et l’évolution temporelle de la mort cellulaire neuronale « collatérale ». Pour aborder ce cours, nous montrons ici un protocole pour étudier les mécanismes et la réponse temporelle des lésions neuronales suite à une attaque de lymphocytes T CD8+ dirigée par des oligodendrocytes. Pour cibler uniquement la gaine de myéline et les oligodendrocytes, des lymphocytes T CD8+ spécifiques des oligodendrocytes activés in vitro sont transférés dans des coupes cérébrales isolées de manière aiguë. Après une période d’incubation définie, la myéline et les lésions neuronales peuvent être analysées dans différentes régions d’intérêt. Les applications potentielles et les limites de ce modèle seront discutées.

Après une incubation de coupes de cerveau avec des cellules T d'oligodendrocytes dirigée CD8 +, les oligodendrocytes ainsi que les neurones subissent une apoptose (figures 2A et 1C, respectivement). Signes histologiques de l'apoptose (par exemple, la caspase-3, Tunel) peuvent être détectés plus tôt après 3 heures d'incubation. La période d'incubation ne doit pas être plus long que 8 heures afin de garantir une bonne qualité de la préparation et des résultats reproductibles. Les cellu...

Pour aborder les mécanismes de démyélinisation et d’apoptose neuronale dans les lésions corticales des troubles inflammatoires démyélinisants, différents modèles animaux sont utilisés. Nous décrivons ici une approche ex vivo en utilisant des lymphocytes T CD8+ spécifiques des oligodendrocytes sur des coupes de cerveau, entraînant la mort oligodendrogliale et neuronale. Les applications potentielles et les limites du modèle sont discutées.

Une Ex vivo Modèle de T-Cell Attaque de Oligodendrocyte dirigée dans aigus tranches cérébrales

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

L’objectif général de cette procédure est d’étudier une attaque dirigée par des oligodendrocytes des lymphocytes T CD huit ex vivo. Ceci est accompli en isolant d’abord les cellules T CD huit de la rate de souris. La deuxième étape consiste à préparer des coupes de cerveau aiguës.Ensuite, les tranches de cerveau sont incubées avec les cellules T CD 8 activées pendant une période pouvant aller jusqu’à six heures, suivies d’une cryoconservation et d’études histologiques. En fin de compte, la microscopie d’immunofluorescence peut être utilisée pour étudier l’emplacement des lymphocytes T ainsi que l’apoptose des oligodendrocytes. Le principal avantage de cette méthode par rapport aux techniques existantes comme l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un modèle animal de sclérose légère, est que les neurones endommagent.Après la CD, l’attaque oligodendrocytaire médiée par huit peut être étudiée en détail. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuroimmunologie, telles que le trafic de cellules immunitaires dans les tissus ou la dégénérescence des neurones et des oligodendrocytes. La démonstration de la procédure sera faite par Alexander Hamman, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Cinq jours avant de préparer les coupes de cerveau, les cellules T de l’OT One stimulent les cellules T pour activer les cellules.Tout d’abord, suivez le protocole des voyants pour enlever la rate de plusieurs souris transgéniques O OT one. Recueillir les rates dans un milieu fraîchement préparé et supplémenté. Ensuite, créez une suspension à cellule unique en écrasant les rates à travers une passoire de 70 microns, puis centrifugez la suspension à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Après la centrifugation, videz le surnageant et remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de tampon de chlorure d’ammonium et de potassium. Laissez les cellules incuber dans ce tampon pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour lyser les globules rouges. Terminez ensuite la réaction en ajoutant 10 millilitres de milieu supplémenté à quatre degrés Celsius.Ensuite, collectez à nouveau les cellules en les faisant tourner comme avant. Ensuite, collectez les cellules granulées, résilez-les, suspendez-les dans un milieu et comptez-les lorsque leur densité est connue. Transférez les cellules dans une plaque de 12 puits à 30 millions de cellules par puits.Ajoutez ensuite un milieu avec de l’OVA et de l’interleukine deux et incubez les cellules pendant quatre jours. Après quatre jours, ajoutez plus d’interleukine deux à une concentration de 500 unités par millilitre. Ensuite, incubez les cellules pour un autre jour.Maintenant, à l’aide d’un kit d’isolement de lymphocytes T positifs pour CD huit, purifiez les lymphocytes T O OT un des cellules cultivées. Brièvement. Les cellules huit positives non CD sont appauvries à l’aide d’un cocktail d’anticorps et sont séparées à l’aide d’une colonne magnétique. Ce faisant, préparez l’échantillon sur de la glace et assurez-vous que la réaction n’implique que des cellules uniques, de sorte que la colonne n’est pas bloquée.Comptez ensuite les cellules. Pour cette expérience. Avoir des souris transgéniques de huit à 10 semaines, O-D-C-O-V-A, et des témoins noirs de l’âge et du sexe correspondants.Comme d’habitude, hébergez les souris dans un environnement exempt d’agents pathogènes avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Après avoir anesthésié une souris, utilisez une pince à la patte arrière pour évaluer le niveau d’anesthésie, puis euthanasiez-la immédiatement. Maintenant, positionnez une souris ventralement et désinfectez le cuir chevelu et décapitez-le.Ensuite, coupez rapidement le cuir chevelu, ouvrez le crâne et retirez le cerveau. Fixez le cerveau en place à l’aide de colle et transférez-le sur une plaque vibrante. Remplissez ensuite l’assiette de sérum physiologique glacé.Une fois préparé, coupez des tranches de 300 microns. Transférez les tranches dans les puits individuels d’une plaque de 12 ou 24 puits remplie de LCR A. Ensuite, ajoutez soigneusement un demi-million de cellules T à chaque tranche.Un demi-million de cellules activées Personalized fournit une bonne interaction cellulaire cellulaire. Une fois les cellules, les cellules commencent à migrer dans la tranche. Dans le même temps, la quantité de cellules n’est pas trop élevée pour induire une réaction excessive, de sorte que le comptage d’une seule cellule est possible.Après avoir rempli tous les puits, incubez la co-culture jusqu’à huit heures après l’incubation, récoltez les tranches et intégrez-les dans le composé OCT. Ensuite, congelez les tranches incorporées dans de l’azote liquide et stockez-les à moins 20 degrés Celsius pour des études histologiques plus approfondies. Après l’incubation de coupes cérébrales avec des lymphocytes T positifs CD dirigés vers des oligodendrocytes, les oligodendrocytes ont subi une apoptose.Les neurones ont également subi une apoptose. Les premiers signes d’apoptose ont été observés après trois heures d’incubation et étaient robustes après huit heures. L’apoptose était plus observée dans les cellules O-D-C-O-V-A exposées aux cellules T OT One que dans toute autre condition.À la suite de cette procédure, des méthodes supplémentaires peuvent être appliquées pour répondre à des questions concernant le comportement migratoire des lymphocytes T ou l’implication des canaux ioniques dans votre propre ptose de laboratoire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des tranches de cerveau aiguës et de les co-cultiver avec des lymphocytes T.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo présente une technique ex vivo pour induire la mort des cellules cérébrales médiée par les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. Lors de l’obtention de coupes cérébrales, des lymphocytes T CD8+ activés dirigés contre les oligodendrocytes sont transférés sur les tranches pour cibler la gaine de myéline et les oligodendrocytes. Après l’incubation, les dommages à la myéline et la mort neuronale peuvent être évalués histologiquement dans les régions d’intérêt.

Une technique ex vivo pour induire la mort neuronale via des lymphocytes T CD8+ spécifiques des oligodendrocytes

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Imagerie confocale du mouvement mitochondrial dans les oligodendrocytes dans des cultures de coupes cérébrales organotypiques

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Cultures organotypique de tranche d&#39;étudier Oligodendrocyte Dynamics et myélinisation

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Un In Vitro Modèle pour l'étude de la physiopathologie cellulaire en cellules globoïdes Leucodystrophie

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Une autre approche pour étudier les événements primaires dans la neurodégénérescence utilisant des coupes de cerveau de Rat Ex Vivo

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Nous présentons ici une méthode pour préparer organotypique cultures tranche de cervelet de souris et de la gaine de myéline, la coloration par immunohistochimie approprié pour enquêter sur les mécanismes de la myélinisation et remyélinisation du système nerveux central.

Préparation et Immunostaining des cérébelleux Myélinisantes Organotypiques

Ce protocole démontre une méthode simple et robuste pour étudier la croissance in situ des axones et la dynamique des cônes de croissance. Il décrit comment préparer ex vivo des tranches de cerveau aiguës physiologiquement pertinentes et fournit un pipeline d’analyse convivial.

In situ Visualisation de la croissance des axones et de la dynamique des cônes de croissance dans des cultures de tranches cérébrales embryonnaires ex vivo aiguës

Découvrez un modèle ex vivo d'attaque des oligodendrocytes par les lymphocytes T CD8+ dans des tranches cérébrales aiguës. Cette méthode permet d'étudier la démyélinisation et l'apoptose neuronale en neuroimmunologie.

Une Ex vivo Modèle de T-Cell Attaque de Oligodendrocyte dirigée dans aigus tranches cérébrales

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