Une Ex vivo Modèle de T-Cell Attaque de Oligodendrocyte dirigée dans aigus tranches cérébrales
5 février 2015
Pour aborder les mécanismes de démyélinisation et d’apoptose neuronale dans les lésions corticales des troubles inflammatoires démyélinisants, différents modèles animaux sont utilisés. Nous décrivons ici une approche ex vivo en utilisant des lymphocytes T CD8+ spécifiques des oligodendrocytes sur des coupes de cerveau, entraînant la mort oligodendrogliale et neuronale. Les applications potentielles et les limites du modèle sont discutées.
L’objectif général de cette procédure est d’étudier une attaque dirigée par des oligodendrocytes des lymphocytes T CD huit ex vivo. Ceci est accompli en isolant d’abord les cellules T CD huit de la rate de souris. La deuxième étape consiste à préparer des coupes de cerveau aiguës.
Ensuite, les tranches de cerveau sont incubées avec les cellules T CD 8 activées pendant une période pouvant aller jusqu’à six heures, suivies d’une cryoconservation et d’études histologiques. En fin de compte, la microscopie d’immunofluorescence peut être utilisée pour étudier l’emplacement des lymphocytes T ainsi que l’apoptose des oligodendrocytes. Le principal avantage de cette méthode par rapport aux techniques existantes comme l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un modèle animal de sclérose légère, est que les neurones endommagent.
Après la CD, l’attaque oligodendrocytaire médiée par huit peut être étudiée en détail. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuroimmunologie, telles que le trafic de cellules immunitaires dans les tissus ou la dégénérescence des neurones et des oligodendrocytes. La démonstration de la procédure sera faite par Alexander Hamman, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Cinq jours avant de préparer les coupes de cerveau, les cellules T de l’OT One stimulent les cellules T pour activer les cellules.
Tout d’abord, suivez le protocole des voyants pour enlever la rate de plusieurs souris transgéniques O OT one. Recueillir les rates dans un milieu fraîchement préparé et supplémenté. Ensuite, créez une suspension à cellule unique en écrasant les rates à travers une passoire de 70 microns, puis centrifugez la suspension à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Après la centrifugation, videz le surnageant et remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de tampon de chlorure d’ammonium et de potassium. Laissez les cellules incuber dans ce tampon pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour lyser les globules rouges. Terminez ensuite la réaction en ajoutant 10 millilitres de milieu supplémenté à quatre degrés Celsius.
Ensuite, collectez à nouveau les cellules en les faisant tourner comme avant. Ensuite, collectez les cellules granulées, résilez-les, suspendez-les dans un milieu et comptez-les lorsque leur densité est connue. Transférez les cellules dans une plaque de 12 puits à 30 millions de cellules par puits.
Ajoutez ensuite un milieu avec de l’OVA et de l’interleukine deux et incubez les cellules pendant quatre jours. Après quatre jours, ajoutez plus d’interleukine deux à une concentration de 500 unités par millilitre. Ensuite, incubez les cellules pour un autre jour.
Maintenant, à l’aide d’un kit d’isolement de lymphocytes T positifs pour CD huit, purifiez les lymphocytes T O OT un des cellules cultivées. Brièvement. Les cellules huit positives non CD sont appauvries à l’aide d’un cocktail d’anticorps et sont séparées à l’aide d’une colonne magnétique. Ce faisant, préparez l’échantillon sur de la glace et assurez-vous que la réaction n’implique que des cellules uniques, de sorte que la colonne n’est pas bloquée.
Comptez ensuite les cellules. Pour cette expérience. Avoir des souris transgéniques de huit à 10 semaines, O-D-C-O-V-A, et des témoins noirs de l’âge et du sexe correspondants.
Comme d’habitude, hébergez les souris dans un environnement exempt d’agents pathogènes avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Après avoir anesthésié une souris, utilisez une pince à la patte arrière pour évaluer le niveau d’anesthésie, puis euthanasiez-la immédiatement. Maintenant, positionnez une souris ventralement et désinfectez le cuir chevelu et décapitez-le.
Ensuite, coupez rapidement le cuir chevelu, ouvrez le crâne et retirez le cerveau. Fixez le cerveau en place à l’aide de colle et transférez-le sur une plaque vibrante. Remplissez ensuite l’assiette de sérum physiologique glacé.
Une fois préparé, coupez des tranches de 300 microns. Transférez les tranches dans les puits individuels d’une plaque de 12 ou 24 puits remplie de LCR A. Ensuite, ajoutez soigneusement un demi-million de cellules T à chaque tranche.
Un demi-million de cellules activées Personalized fournit une bonne interaction cellulaire cellulaire. Une fois les cellules, les cellules commencent à migrer dans la tranche. Dans le même temps, la quantité de cellules n’est pas trop élevée pour induire une réaction excessive, de sorte que le comptage d’une seule cellule est possible.
Après avoir rempli tous les puits, incubez la co-culture jusqu’à huit heures après l’incubation, récoltez les tranches et intégrez-les dans le composé OCT. Ensuite, congelez les tranches incorporées dans de l’azote liquide et stockez-les à moins 20 degrés Celsius pour des études histologiques plus approfondies. Après l’incubation de coupes cérébrales avec des lymphocytes T positifs CD dirigés vers des oligodendrocytes, les oligodendrocytes ont subi une apoptose.
Les neurones ont également subi une apoptose. Les premiers signes d’apoptose ont été observés après trois heures d’incubation et étaient robustes après huit heures. L’apoptose était plus observée dans les cellules O-D-C-O-V-A exposées aux cellules T OT One que dans toute autre condition.
À la suite de cette procédure, des méthodes supplémentaires peuvent être appliquées pour répondre à des questions concernant le comportement migratoire des lymphocytes T ou l’implication des canaux ioniques dans votre propre ptose de laboratoire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des tranches de cerveau aiguës et de les co-cultiver avec des lymphocytes T.
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Aperçu
Cette étude examine les mécanismes de la démyélinisation et de l'apoptose neuronale dans les lésions corticales à l'aide d'un modèle ex vivo utilisant des lymphocytes T CD8+ spécifiques des oligodendrocytes. Cette approche permet d'analyser la mort des oligodendroglies et des neurones dans un environnement contrôlé.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Immunologie
- Troubles neurodégénératifs
Contexte
- La démyélinisation est une caractéristique clé des affections inflammatoires démyélinisantes.
- Les lymphocytes T CD8+ jouent un rôle dans la réponse immunitaire affectant les oligodendrocytes.
- La compréhension de ces interactions peut guider les stratégies thérapeutiques.
- Les modèles existants pourraient ne pas reproduire intégralement les lésions neuronales observées dans ces affections.
Objectif de l'étude
- Étudier les effets des attaques des lymphocytes T CD8+ sur les oligodendrocytes en conditions ex vivo.
- Évaluer l'apoptose neuronale résultante dans un environnement contrôlé.
- Discuter des applications potentielles et des limites de ce modèle.
Méthodes utilisées
- Isolation de cellules T CD8 + à partir de rates de souris.
- Préparation de tranches cérébrales aiguës pour l'expérimentation.
- Incubation des tranches cérébrales avec des cellules T CD8 + activées pendant jusqu'à six heures.
- Utilisation de la microscopie en immunofluorescence pour analyser la localisation des cellules T et l'apoptose des oligodendrocytes.
Résultats principaux
- Mis en évidence une mort des oligodendrocytes et des neurones suite à l'exposition aux lymphocytes T.
- Mis en avant les avantages de ce modèle par rapport aux méthodes traditionnelles.
- Apporté des éclairages sur la dynamique des lésions neuronales induites par le système immunitaire.
- Identifié des limites potentielles dans la traduction des résultats aux conditions in vivo.
Conclusions
- Le modèle ex vivo simule efficacement les lésions des oligodendrocytes médiées par les lymphocytes T.
- Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour explorer des interventions thérapeutiques.
- Cette approche peut améliorer la compréhension des maladies démyélinisantes.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Ce modèle ex vivo permet une détection mécanistique des risques associés aux immunothérapies ciblant les oligodendrocytes, en isolant les lésions neuronales induites par les lymphocytes T CD8+ dans des tranches aiguës de cerveau. Il facilite la validation des cibles en découverte neuroinflammatoire en fournissant des mesures quantitatives et résolues dans le temps de l'apoptose des oligodendrocytes et des neurones. Cette approche améliore la fiabilité prédictive en phase précoce de découverte en dissociant les effets directs sur les oligodendrocytes de la neurodégénérescence secondaire, dans un système pertinent pour la maladie.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques concernant les mécanismes d'attaque spécifiques des lymphocytes T CD8+ dirigés contre les oligodendrocytes dans les lésions de la substance grise.
- Valeur opérationnelle : Permet une détection biologique des risques en isolant la mort neuronale collatérale comme conséquence directe de l'activité immunitaire ciblant les oligodendrocytes.
- Valeur scientifique : Renforce la confiance prédictive grâce à des mesures d'apoptose résolues dans le temps (début à 3 heures, marquée à 8 heures) dans les conditions O-D-C-O-V-A par rapport aux conditions témoins.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés (coupes cérébrales aiguës avec myéline et neurones) pour le criblage en aval d'immunomodulateurs.
- Valeur opérationnelle : Assure la standardisation des tests grâce à des périodes d'incubation définies (jusqu'à 8 heures) et à des lectures reproductibles de l'apoptose par microscopie en immunofluorescence.
- Valeur scientifique : Met en évidence la prête-à-l'emploi du criblage par l'apoptose quantifiable des oligodendrocytes et des neurones, utilisée comme variable dépendante pour l'évaluation des composés.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Aborde la pertinence pathologique en modélisant les lésions de la substance grise corticale et sous-corticale dans les troubles inflammatoires démyélinisants.
- Valeur opérationnelle : Décrit la continuité translationnelle, allant de l'élucidation des mécanismes ex vivo au perfectionnement des modèles précliniques pour les thérapeutiques des maladies démyélinisantes.
- Valeur scientifique : Met l'accent sur la valeur prédictive de réduction des risques en permettant l'analyse mécanistique des chronologies des lésions neuronales induites par le système immunitaire.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Place la méthode dans le continuum de la découverte, allant de la validation de la cible à l'identification de composés candidats, en soutenant la vérification d'hypothèses et la clarification des voies en neuroimmunologie.
- Biologie de la découverte : Explique comment la méthode permet de tester des hypothèses sur les mécanismes des lymphocytes T dirigés contre les oligodendrocytes et de clarifier les voies impliquées dans la neurodégénérescence d'origine immunitaire.
- Criblage : Décrit la préparation normalisée de tranches de cerveau et des lectures quantitatives de l'apoptose, assurant une évaluation fiable des composés.
- Analytique : Met en évidence les mesures de l'apoptose des oligodendrocytes et des neurones par microscopie en immunofluorescence comme paramètres clés pour comparer différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Relie la méthode à la continuité préclinique en modélisant la pathologie des lésions de la substance grise, pertinente pour la progression des maladies démyélinisantes.
- Réutilisation en entreprise : Présente la méthode comme une capacité réutilisable pour une validation itérative de cibles parmi divers candidats immunomodulateurs dans la découverte de traitements contre les neuroinflammations.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive, validation des cibles et réduction de l'ambiguïté mécanistique dans la communication croisée oligodendrocyte-neurone durant une attaque immunitaire.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité de la co-culture aiguë de tranches cérébrales avec un dosage défini de lymphocytes T (0,5 million de cellules par tranche).
- Valeur stratégique : Meilleures décisions d'aller/arrêt, efficacité du capital et réduction précoce des risques biologiques en phase tardive grâce à l'isolement précoce des mécanismes de neurodégénérescence collatérale.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation et décisions d'avancement ajustées au risque, basées sur des données d'apoptose résolues dans le temps dans des systèmes de matière grise pertinents pour la maladie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Expertise scientifique requise en neuro-immunologie, préparation de tranches de cerveau et microscopie en immunofluorescence.
- Les besoins en instrumentation et en infrastructure analytique comprennent un vibratome, un cryostat, une microscopie à fluorescence et des kits d'isolement de lymphocytes T.
- Exigences de standardisation entre équipes concernant la viabilité des tranches, les protocoles d'activation des lymphocytes T et les seuils de quantification de l'apoptose.
- Considérations d'adaptation selon les systèmes modèles, incluant les souches transgéniques par rapport aux souches sauvages et les co-cultures de cellules immunitaires humanisées.
- Les limitations pratiques appuyées par les données sources incluent la contrainte ex vivo limitant les études dynamiques à long terme, ainsi qu'une variabilité potentielle de la qualité des tranches affectant la reproductibilité.
