Name: Internalisation et lObservation des Biomolécules Fluorescent In Living micro-organismes par électroporation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Découvrez comment internaliser des biomolécules fluorescentes dans des micro-organismes vivants par électroporation. Cette méthode permet de visualiser l'ADN et les protéines in vivo pour étudier leur dynamique cellulaire.

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Nous remercions Stephan Uphoff pour les discussions. 
R.C. a été soutenu par le Linacre College de l’Université d’Oxford. A.P. a été soutenu par l’Office allemand d’échanges universitaires (DAAD), la Fondation académique nationale allemande et EPSRC. M.S. a été soutenu par le Wellcome Trust. A.N.K. a été soutenu par une subvention britannique BBSRC (BB/H01795X/1) et une subvention Starter du Conseil européen de la recherche (261227).

<ol><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Leake, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+and+turnover+in+single%2C+functioning+membrane+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li>
<li>Taniguchi, Y., Kawakami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+HaloTag+protein+to+covalent+immobilization+of+recombinant+proteins+for+single+molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Application of HaloTag protein to covalent immobilization of recombinant proteins for single molecule force spectroscopy.</a> Langmuir. 26, 10433-10436 (2010).</li>
<li>Xie, X. S., Choi, P. J., Li, G. W., Lee, N. K., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+approach+to+molecular+biology+in+living+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biophysics%22%5BJournal%5D)">Single-molecule approach to molecular biology in living bacterial cells.</a> Annual review of biophysics. 37, 417-444 (2008).</li>
<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+subcellular+RNA+sequencing+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed subcellular RNA sequencing in situ.</a> Science. 343, 1360-1363 (2014).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+microscopy+coming+of+age%3A+from+concepts+to+biological+impact%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Localization microscopy coming of age: from concepts to biological impact.</a> J Cell Sci. 126, 3505-3513 (2013).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Hao Chen, K., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localizationbased+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localizationbased super-resolution imaging.</a> Nat Meth. 8, 1027-1041 (2011).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Meth. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+molecules+at+cell+division+reveals+native+protein+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization.</a> Nat. Methods. 9, 480-482 (2012).</li>
<li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+Parallel+Single-Cell+RNA-Seq+for+Marker-Free+Decomposition+of+Tissues+into+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Massively Parallel Single-Cell RNA-Seq for Marker-Free Decomposition of Tissues into Cell Types.</a> Science. 343, 776-779 (2014).</li>
<li>Aldridge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHT-ChIP-seq%3A+a+completely+automated+robotic+protocol+for+high-throughput+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">AHT-ChIP-seq: a completely automated robotic protocol for high-throughput chromatin immunoprecipitation.</a> Genome Biol. 14, R124(2013).</li>
<li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).</li>
<li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nat. Methods. 7, 717-719 (2010).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+the+site-specific+modification+of+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo.</a> Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+incorporating+macromolecules+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A method for incorporating macromolecules into adherent cells.</a> J Cell Biol. 98, 1556-1564 (1984).</li>
<li>Clarke, M. S., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syringe+loading+introduces+macromolecules+into+living+mammalian+cell+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Syringe loading introduces macromolecules into living mammalian cell cytosol.</a> J Cell Sci. 102, 533-541 (1992).</li>
<li>Sakon, J. J., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+the+conformation+of+individual+proteins+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting the conformation of individual proteins in live cells.</a> Nat. Methods. 7, 203-205 (2010).</li>
<li>Taylor, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromagnetic+syringe%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Electromagnetic syringe.</a> IEEE Trans. Biomed. Eng. 25, 303-304 (1978).</li>
<li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Res. 16, 6127-6145 (1988).</li>
<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-845 (1982).</li>
<li>Sustarsic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+delivery+of+fluorescently+labeled+proteins+in+live+bacteria+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimized delivery of fluorescently labeled proteins in live bacteria using electroporation.</a> Histochem Cell Biol. , (2014).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat. Methods. 5, 159-161 (2008).</li>
<li>Sinha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+DNA-binding+proteins+for+sexual+commitment+and+development+in+Plasmodium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium.</a> Nature. 000, 1-5 (2014).</li>
<li>English, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+investigations+of+the+stringent+response+machinery+in+living+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E365-E373 (2011).</li>
<li>Crawford, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+intracellular+single-molecule+fluorescence+using+electroporated+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Long-lived intracellular single-molecule fluorescence using electroporated molecules.</a> Biophys J. 105, 2439-2450 (2013).</li>
<li>Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+DNA+repair+in+live+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule DNA repair in live bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 8063-8068 (2013).</li>
<li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Protein-DNA+Interactions+in+Live+Bacterial+Cells+Using+Photoactivated+Single-molecule+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Hohlbein, J., Gryte, K., Heilemann, M., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfing+on+a+new+wave+of+single-molecule+fluorescence+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Surfing on a new wave of single-molecule fluorescence methods.</a> Phys Biol. 7, 031001(2010).</li>
<li>Xie, X. S., Yu, J., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective+-+Living+cells+as+test+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Perspective - Living cells as test tubes.</a> Science. 312, 228-230 (2006).</li>
<li>Santoso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+transitions+in+DNA+polymerase+I+revealed+by+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 715-720 (2010).</li>
<li>Hohlbein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+landscapes+of+DNA+polymerase+I+and+mutator+derivatives+establish+fidelity+checkpoints+for+nucleotide+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Conformational landscapes of DNA polymerase I and mutator derivatives establish fidelity checkpoints for nucleotide insertion.</a> Nature communications. 4, 2131(2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

De nombreux paramètres peuvent être modifiés pendant l&#39;électroporation des cellules et d&#39;acquisition de données selon le système biologique d&#39;intérêt et la nature précise de l&#39;expérience (au niveau de la cellule ou molécule unique analyse). Par exemple, lorsque l&#39;ADN par électroporation dans des bactéries, 0,25 à 5 pmoles de fragments d&#39;ADN double brin marqués conduit à une faible efficacité d&#39;internalisation, ce qui permet la détection directe seule molécule (par exemple., Sans avoir besoin de photoblanchiment à l&#39;avance). Au-dessus de 5 pmol ADN double brin, les cellules ont tendance à être lourdement chargé, un régime mieux adapté pour l&#39;analyse unicellulaire. Tous les ADN marqués devraient également être préalablement purifié sur gel pour éliminer toute trace de colorant libre (fluorophore ne ayant pas réagi) de la solution ADN stock. En outre, les problèmes potentiels avec la dégradation de l&#39;ADN, en particulier pour des expériences smFRET, peuvent être réglés par des ADN avec des acides nucléiques non naturels, ou des motifs qui protègent exonucléase accessible terminaisons tels que des boucles en épingle à cheveux. Un autre adjustable paramètre dans électroporation est l&#39;intensité du champ appliqué pendant l&#39;électroporation. Faible intensité de champ (~ 1 kV / cm) conduira à une faible efficacité de chargement approprié pour les études à molécule unique. Intensités de champ plus élevée (jusqu&#39;à 1,8 kV / cm) augmenteront l&#39;efficacité de chargement; Cependant, il existe une corrélation inverse entre l&#39;intensité du champ et la viabilité des cellules après l&#39;électroporation (voir figure 4). Pour référence, une intensité de champ normal utilisé pour les bactéries et la levure est une électroporation à environ 1,5 kV / cm. La constante de temps représentant la durée de cette décomposition, est un paramètre pratique à suivre, car les gouttes de constante de temps dès que tout phénomène d&#39;arc se produit dans la cuvette. D&#39;après les réglages normaux, la constante de temps doit être supérieure à 4 ms; des valeurs inférieures conduiront à une faible efficacité de chargement ou de cellules endommagées, même non-chargées. La plupart des électroporateurs offrent d&#39;autres degrés de liberté (comme &quot;troncature d&#39;impulsion» ou «forme des impulsions&quot;) qui peut être modifiée pour accorder à la foisle chargement et la viabilité cellulaire. Nous avons appliqué cette méthode à la fois les bactéries et les levures, cependant procédures similaires devraient également permettre l&#39;internalisation des biomolécules marquées dans les cellules de mammifère en utilisant les paramètres de électroporateur appropriées depuis leur membrane est en fait moins complexe (unique bicouche lipidique) et depuis l&#39;électroporation a déjà été utilisé avec de telles cellules 21. Lorsque l&#39;internalisation des protéines marquées, tout colorant libre doit être retiré de la solution de protéine marquée des stocks électroporation préalable. Molécules de colorant libres, en raison de leur petite taille, peuvent être internalisés préférentiellement au cours des protéines d&#39;intérêt, et sont difficiles à distinguer lors de l&#39;analyse des données (malgré leur diffusion devrait plus rapide). A titre indicatif, pour un échantillon biologique de la protéine marquée pour être adapté à l&#39;électroporation, la quantité de colorant restant libre doit être inférieure à 2% (balayage à fluorescence détectée à l&#39;aide d&#39;une SDS-PAGE) 22. Ce procédé est particulièrement importante,que certaines molécules pourraient tenir à des membranes externes des bactéries ou des levures par électroporation. À cet égard, l&#39;échantillon de contrôle négatif doit afficher intensité de fluorescence par cellule nettement plus faible que les cellules électroporées, idéalement aussi bas que le niveau de cellules vides (cellules qui ne ont pas été incubées avec des biomolécules marquées par fluorescence, ni électroporation, figure 2) autofluorescence. Comme avec l&#39;ADNdb, l&#39;efficacité d&#39;internalisation des protéines marquées est liée à la quantité de biomolécules ajouté aux cellules avant l&#39;électroporation. Cependant, d&#39;autres paramètres, comme la taille et la charge, jouent un rôle dans l&#39;internalisation. Les petites protéines présentent des rendements élevés d&#39;internalisation, tandis que les protéines plus grandes (jusqu&#39;à 98 kDa) peut être internalisé avec succès, mais avec une efficacité plus faible (figure 5) 26. Le point isoélectrique de la protéine, les interactions potentielles avec la membrane cellulaire et d&#39;autres paramètres physico-chimiques aussiinfluence chargement cellulaire pendant électroporation. En conséquence, les utilisateurs ont besoin pour optimiser les expériences de leur propre système, sachant qu&#39;une forte concentration initiale de protéine marquée (&gt; 50 M) donnera la meilleure chance pour le chargement réussi. Électroporation propose également un nouvel outil de perturber et d&#39;analyser la fonction cellulaire en introduisant des protéines et d&#39;autres biomolécules dans les cellules (soit marqué ou non marqué). Les expériences de la T7 ARN polymerase (Figure 5C) présentent une telle exemples d&#39;une expérience dans laquelle on peut introduire une biomolécule qui peut modifier l&#39;expression de gènes in vivo en utilisant l&#39;électroporation. Lorsque la réalisation d&#39;expériences de fluorescence seule molécule, illumination TIR est généralement privilégiée par rapport à d&#39;autres modes d&#39;éclairage car il offre le meilleur rapport signal-sur-bruit en excitant seulement fluorophores dans une section mince dessus de la surface de lamelle (~ 100 nm). Cependant imagerie de diffusion à l&#39;intérieur des biomolécules marquées micro-organismes vivants peuvent reexiger un éclairage plus profond (jusqu&#39;à 0,8 um pour E. coli). Deeper illumination est réalisée en mode Hilo, tout en préservant un rapport signal-bruit. D&#39;autre part, l&#39;imagerie à grand champ est particulièrement important pour l&#39;analyse de photoblanchiment étapes, où l&#39;utilisateur est l&#39;estimation du nombre de molécules internalisées par photoblanchiment toute une cellule chargée avec une puissance laser élevée et en divisant l&#39;intensité initiale de la fluorescence de la cellule par l&#39;intensité unitaire produite par une seule molécule (l&#39;étape de photoblanchiment unique, figure 3). Imagerie Widefield est également nécessaire pour le suivi de la molécule à long terme afin de localiser les molécules diffusantes d&#39;intérêt même si leurs trajectoires couvrent le volume de cellule entière. Dans ce protocole, nous présentons comment électroporation, une technique standard pour les biologistes et de biochimistes pour délivrer des acides nucléiques dans les cellules, constitue une méthode simple pour délivrer biomolécules fluorescentes dans divers types de cellules. Thest nouvelle technique à haut débit offre un outil unique d&#39;observer des molécules marquées dans leur environnement natif. En d&#39;addition biomolécules marquées avec des fluorophores couvrant une large gamme de longueurs d&#39;onde, l&#39;électroporation peut délivrer des molécules modifiées par de nombreux groupes chimiques, tels que des nucleotides et des acides aminés non naturels, des chélateurs de métaux, des agents de réticulation, et les groupes de mise en cage. Si le système biologique d&#39;intérêt ne est pas indispensable au développement de la cellule, le gène codant pour la protéine cible peut également être supprimée (ou knocked-down), se assurer que les protéines observées après internalisation représentent tous (ou presque) de la piscine de protéine intracellulaire . En substance, l&#39;électroporation peut &quot;greffe&quot; la flexibilité de bioconjugués in vitro dans des cellules vivantes et donc bénéficier des efforts de la biologie synthétique, la biologie des systèmes, et dans la détection de molécule unique vivo.

La plupart des études de fluorescence à l'intérieur des cellules vivantes dépendent de fusions de protéines avec des protéines fluorescentes (MF), comme une GFP. Ces études permettent marqueurs fluorescents du nombre de copies, motif de diffusion ou la localisation des protéines impliquées dans des processus tels que l'expression du gène ou du transport membranaire 2-7. MF offrent la spécificité d'étiquetage haute, la mise en œuvre facile, et sont disponibles dans un grand inventaire des variantes avec divers photophysique et les propriétés chimiques 1. Cependant, fluorophores organiques restent le premier choix pour des expériences in vitro en raison de leur plus grande photostabilité (jusqu'à 100 fois plus stable que MF) 8,9, de petite taille (jusqu'à 100 fois plus petit volume que MF) et la facilité d'étiquetage intramoléculaire (principalement par l'utilisation de résidus de cysteine). Tous ces facteurs sont particulièrement importants pour la fluorescence seule molécule et FRET 10 études. Plusieurs méthodes d'internalisation Combincompris les avantages de l'étiquetage biologique et dans la détection in vivo ont été introduites au cours de la dernière décennie; Cependant, ces méthodes soit emploient relativement importantes polypeptides balises (tags par exemple, TMP, HALO, ou 20 kDa SNAP) 11-14, nécessitent l'utilisation d'acides aminés non naturels 15, ou sont limités à grandes cellules eucaryotes, seule membrane (par exemple. , gratter chargement, seringue chargement, la micro-injection) 16-19. Ce protocole décrit un roman, simple et à haut débit méthode d'internalisation que les couples les avantages de fluorophores organiques avec l'observation in vivo. Pour développer cette technique, nous avons adapté le procédé d'électroporation couramment utilisé pour transformer des cellules avec l'ADN plasmidique 20,21 afin de charger les micro-organismes tels que E. coli ou S. cerevisiae avec des biomolécules organiquement étiquetés. Le protocole se compose de quatre étapes simples: l'incubation des cellules avec des biomolécules marquées,l'électroporation, la récupération des cellules, et le lavage des cellules pour éliminer les biomolécules non-internalisé. Ici, nous présentons ce protocole d'électroporation, ainsi que les procédés d'imagerie cellulaire et d'analyse de données pour étudier la fluorescence à base de cellules et une seule molécule et FRET signaux. L'électroporation de décharge repose sur un champ électrique à haute tension à travers une faible ionique suspension de cellules de force pour former des pores de la membrane à travers laquelle transitoire biomolécules peuvent pénétrer dans les cellules (figure 1) 20,21. Tout comme avec la transformation de bactéries ou de la levure avec de l'ADN plasmidique, les cellules doivent être préparés avant l'électroporation pour assurer leur electrocompetency. Cette procédure, composé de plusieurs étapes de lavage avec de l'eau, augmente la perméabilité de la membrane et réduit la force ionique de la solution de cellules pour éviter un arc électrique dans la cuvette d'électroporation. Dans ce protocole, les cellules peuvent être préparés comme décrit ci-dessous (voir le protocole: 1.1) ou acheté d'un fournisseur commercials. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig1.jpg"> Figure 1: Représentation schématique du protocole d'internalisation De gauche à droite:. Ajouter quelques microlitres de biomolécules marquées à l'aliquote de cellules électrocompétentes (fragments d'ADN doublement marquée et les bactéries dans cet exemple); incuber 1 à 10 minutes sur de la glace et à transférer une cuvette d'électroporation de pré-refroidi; électroporer puis ajouter 0,5 à 1 ml de milieu riche pour les cellules immédiatement après; incuber à 37 ° C (ou la température requise par l'organisme, par exemple, 29 ° C pour les levures) pour laisser les cellules se rétablir; effectuer des 5 étapes de lavage pour enlever l'excédent non-internalisées molécules marquées; remettre en suspension le culot final dans 100-200 pi de tampon PBS et pipette 10 ul sur un tampon d'agarose; couvrir le pad avec une lamelle nettoyé et image sur un microscope à fluorescence (en mode grand champ ou en mode HILO). <p class='"jove_content"&gt;' cellules sont incub avec les biomol marqu juste avant qui peuvent effectu l standards trouv dans la plupart des laboratoires de biochimie. imm apr un milieu riche permet leur r laver>(Figure 1). L'excès de biomolécules marquées non-internalisées est d'abord éliminé par lavage dans un tampon contenant une concentration relativement élevée de sel et un peu de détergent (Voir PROTOCOLE: 3,3). La présence de sel perturbe interactions électrostatiques non spécifiques formés par des biomolécules marquées non internalisés qui autrement peuvent coller sur la membrane externe. De même, la présence de détergent dans le tampon de lavage perturbe interactions hydrophobes non spécifiques. Alors que l'ADN internalisation est simple (Figure 2), des précautions doivent être prises lors de l'internalisation des protéines marquées à l'aide de l'électroporation. Tout d'abord, le stock échantillon de protéines organiquement marqué pourrait encore contenir un petit pourcentage de colorant libre. Molécules de colorant libres sont beaucoup plus petites que les protéines et pourraient donc être internalisés préférentiellement. Pour se assurer que la grande majorité des molécules fluorescentes internalisés observées correspondent à la protéine d'intérêt, l'échantillon de protéine initiale doit contenir moins de 2% de colorant ~ libre (Figure 5) 22. L'excès de protéines marquées non-internalisées peut également tenir à la membrane cellulaire externe après l'électroporation; ce phénomène est spécifique à la protéine et doit être vérifié pour chaque nouvelle protéine. Nous vous proposons plusieurs options qui permettent l'élimination des protéines non-intériorisée de l'échantillon de cellules chargé (Voir PROTOCOLE: 3.3.3). Enfin, les cellules sont remises en suspension dans un petit volume de tampon phosphate et un tampon pipette sur agarose, ce qui permet leur image sur un microscope à fluorescence. Immobilisation sur des patins agarose est un simple et moyen efficace de l'imagerie des cellules sur une lamelle sans nuire à leur intégrité. Le tampon doit contenir un milieu de culture à faible fluorescence. Imagerie cellulaire peut être effectuée soit en champ large, totale fluorescence à réflexion interne (FRBR) ou en utilisant HILO (fortement inclinées et laminé feuille optique) microscopie. Dans la configuration HILO, le faisceau laser pénètre plus profondément dans l'échantillon que dans TIRF, mais ne se allume pas tant que la totalité de l'échantillon de grand champ, ce qui permet un plus grand rapport 23 signal-sur-bruit. En fonction de la résolution de la puissance du laser et le temps utilisé, les biomolécules peuvent être internalisés comptées (à l'aide de l'analyse pas à pas-photoblanchiment, figure 3), localisées, suivies ou 24-28. L'internalisation des constructions doublement marquée avec une paire de fluorophores de FRET permet la quantification de FRET tant au unicellulaire ou niveaux seule molécule (figure 6). Différents paramètres peuvent être modifiésen fonction de la sortie souhaitée et le système biologique étudié. Tout d'abord, la quantité de matière internalisé par la cellule peut être réglée en modifiant la concentration de biomolécules marquées ajouté aux cellules avant l'électroporation (figure 2). l'intensité de champ d'électroporation aura aussi une influence à la fois l'efficacité de chargement et la viabilité des cellules; comme prévu, tandis que l'efficacité de chargement augmente avec l'intensité du champ, la viabilité des cellules électroporées diminue (figure 4A). Les deux paramètres peuvent être quantifiés en enregistrant le pourcentage de charge et la division des cellules après l'électroporation. Ce dosage de la viabilité couplée à l'imagerie de fluorescence vérifie également l'observation des biomolécules internalisés dans les cellules vivantes et permet une observation continue sur plusieurs générations (figure 4B). En résumé, ce protocole permet l'internalisation des marquées par fluorescence des molécules ADN et de protéines dansE. coli ou S. 26 cerevisiae. Les molécules individuelles marquées avec des fluorophores organiques peuvent être suivis avec la résolution spatio-temporelle élevée pour des échelles de temps un ordre de grandeur plus de médecins de famille. Enfin, cette méthode est compatible avec grand champ, la FRBR et la détection confocale, ainsi que des systèmes d'excitation pulsés, comme ALEX (alternant excitation laser 28,29).

<table><tbody><tr><td>ElectroMax DH5-alpha Comptent cellules</td><td>Invitrogen</td><td>11319-019</td><td>ou toute autre bactérie ou levure électrocompetant commerciale ou de laboratoire.</td></tr><tr><td>EZ Rich Defined Madia</td><td>Teknova</td><td>M2105</td> Appareil d’électroporation à <td>micro-pulseur à faible fluorescence</td></tr><tr><td></td><td>Biorad</td><td>165-2100</td><td>ou tout électroporateur classique pour la transformation de micro-organismes</td></tr><tr><td>Agarose certifiée en biologie moléculaire Agarose</td><td>Biorad</td><td>161-3100</td><td>à faible fluorescence pour tampon d’agarose</td></tr><tr><td>Lamelles de microscope N° d’épaisseur 1,5</td><td>Menzel</td><td>BB024060SC</td><td>éliminer les particules de fond en chauffant les lames dans le four à 500 &deg ; C pour 1h</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence monomolécule</td><td>Construit</td><td></td> à la maison <td>décrit dans REFs</td></tr><tr><td>Logiciel de localisation</td> Logiciel MATLAB et C++ <td>écrit sur mesure, disponible en ligne</td><td></td><td>qui peut être adapté pour l’analyse de localisation.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Logiciel de suivi</td><td>Disponible en ligne</td><td></td><td>, implémentation MATLAB par Blair et Dufresne.&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

internalisation et l&#39;observation des biomolécules fluorescent in living micro-organismes par électroporation

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

La capacité d’étudier les biomolécules in vivo est cruciale pour comprendre leur fonction dans un contexte biologique. Une approche puissante consiste à fusionner des molécules d’intérêt avec des protéines fluorescentes telles que la GFP pour étudier leur expression, leur localisation et leur fonction. Cependant, la GFP et ses dérivés sont nettement plus grands et moins photostables que les fluorophores organiques généralement utilisés pour les expériences in vitro, ce qui peut limiter la portée de l’étude. 
Nous avons récemment introduit une méthode simple, polyvalente et à haut débit basée sur l’électroporation, permettant l’internalisation de biomolécules marquées avec des fluorophores organiques dans des micro-organismes vivants. Nous décrivons ici comment utiliser l’électroporation pour internaliser des fragments d’ADN marqués ou des protéines dans Escherichia coli et Saccharomyces cerevisiæ, comment quantifier le nombre de molécules internalisées à l’aide de la microscopie à fluorescence et comment quantifier la viabilité des cellules électroporées. Les données peuvent être acquises au niveau de la cellule unique ou de la molécule unique à l’aide de la fluorescence ou du FRET. La possibilité d’internaliser des molécules non marquées qui déclenchent une réponse physiologique observable in vivo est également présentée. Enfin, des stratégies d’optimisation du protocole pour des systèmes biologiques spécifiques sont discutées.

Les études de biomolécules in vivo sont cruciales pour comprendre la fonction moléculaire dans un contexte biologique. Nous décrivons ici une nouvelle méthode permettant l’internalisation de biomolécules fluorescentes, telles que l’ADN ou les protéines, dans des micro-organismes vivants. L’analyse des données in vivo enregistrées par microscopie à fluorescence est également présentée et discutée.

Internalisation et l&#39;Observation des Biomolécules Fluorescent In Living micro-organismes par électroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

L’objectif de cette procédure est d’internaliser et de visualiser des biomolécules telles que de l’ADN ou des protéines marquées au fluor organique à l’intérieur de micro-organismes vivants à l’aide d’une méthode basée sur l’électroporation. Ceci est accompli en incubant d’abord des cellules électrocompétentes avec des biomolécules marquées par fluorescence avant de les transférer dans un vétérinaire d’électroporation. En appliquant une tension élevée à travers le vete, les formations de pores transitoires sur la paroi cellulaire et la membrane cellulaire permettront une diffusion biomoléculaire dans les cellules.Ensuite, les cellules sont incubées dans un milieu riche pour leur permettre de récupérer avant que les biomolécules non internalisées en excès ne soient éliminées. Enfin, les cellules sont transférées sur un tampon nutritif minimal à faible fluorescence, puis une lamelle en verre est recouverte sur le dessus pour former un agrosandwich en verre. En fin de compte, la microscopie essence est utilisée pour analyser l’emplacement, le modèle de diffusion et les propriétés dynamiques des biomolécules marquées à l’intérieur des cellules vivantes.Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons réalisé les limites de l’imagerie de cellules vivantes. En raison du glitch rapide des protéines photofluorescentes telles que la GFP, nous avons pensé qu’en chargeant des cellules vivantes avec des biomolécules marquées avec une force fluoro organique, nous transplanterions des micro-organismes vivants. Les principaux avantages de cette force sont la luminosité, la stabilité de la photo et la petite taille.Nous espérons ensuite suivre la localisation et la diffusion de l’ADN ou des protéines dans leur environnement natif sur des échelles de temps beaucoup plus longues, ce qui correspondrait à de nombreux processus biologiques importants. Le principal avantage de ces techniques par rapport aux méthodes existantes, telles que la microinjection, est qu’elles peuvent également être appliquées à des micro-organismes plus petits que le diamètre d’une aiguille de micro-injection typique. Un avantage supplémentaire de l’électroporation est qu’un grand nombre de cellules peuvent être chargées en même temps avec des biomolécules fluorescentes et visualiser en parallèle celles faisant de l’électroporation une technique particulièrement fréquentée par l’œil.Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la diffusion et du comportement dynamique des biomolécules marquées par fluorescence in vivo, elle peut également être appliquée dans d’autres contextes tels que pour électroder des biomolécules qui ne sont pas marquées, mais elle peut, par exemple, déclencher une réponse physiologique lorsqu’elle est internalisée par la cellule Pour construire des tampons aros pour les bactéries ou la levure microscopie fluorescente commencer par préparer des milieux à faible fluorescence, Ensuite, faites fondre rapidement une solution de 2 % d’aros dans de l’eau distillée avec un micro-ondes de laboratoire. Ajoutez un volume correspondant de rose HA chaude dans le support et pipetez doucement le mélange de haut en bas. Pour éviter la formation de bulles, pipetez immédiatement environ 200 microlitres du mélange sur une lamelle de microscope de taille standard.Laissez la lamelle sur le banc pendant une minute à température ambiante jusqu’à ce que le gel se solidifie ou que le stockage temporaire soit placé sur une deuxième lamelle nettoyée sur le tampon frais et appliquez doucement une pression du haut vers la rose d’œuf, en commençant par un stock de biomolécules fluorescentes préparées dans un tampon à faible force ionique. Transférez jusqu’à cinq microlitres de biomolécules dans une aliquote de 20 microlitres de bactéries compétentes ou 50 microlitres de cellules de levure compétentes. La quantité de biomolécules fluorescentes incubées avec les cellules est directement corrélée à la quantité de biomolécules internalisées par cellule.Après l’électroporation, incubez le mélange sur de la glace jusqu’à 10 minutes. Dans le même temps, sélectionnez un type d’électroporation avec un espacement approprié des électrodes et refroidissez sur de la glace. Transférez le mélange de cellules dans le vete pré-refroidi.Tapotez doucement le vete plusieurs fois pour éliminer les bulles de la solution. Enlevez toute humidité du vétérinaire avec une serviette en papier et placez le vétérinaire dans l’électrofiltre. Appliquez une impulsion à haute tension aux cellules juste après ce processus.Vérifiez que la constante de temps affichée sur l’électromètre est comprise entre quatre et six millisecondes. Des constantes de temps plus faibles sont souvent dues à la présence d’un excès de sel ou de bulles dans le qve, et cela peut diminuer ou inhiber complètement l’absorption de biomolécules dans les cellules. Des impulsions de tension plus élevées améliorent la charge de la cellule, mais peuvent également affecter la viabilité de la cellule immédiatement après l’électroporation.Ajoutez 500 microlitres de milieu riche et transférez les cellules dans un tube frais de 1,5 millilitre. Laissez la membrane cellulaire se rétablir en incubant les bactéries à 37 degrés Celsius ou les levures à 29 degrés Celsius pendant deux à 10 minutes. Après l’incorporation de la biomolécule et la récupération de la croissance, faites tourner les cellules pendant une minute dans une centrifugeuse pré-refroidie à quatre degrés Celsius et jetez l’agent Reese en décubitus dorsal.Suspendez le granulé dans 500 microlitres de tampon et répétez les processus de centrifugation et d’élimination et de suspension du réusob. Trois fois de plus. Ces étapes de lavage permettront d’éliminer toutes les traces de biomolécules non internalisées de la suspension cellulaire.Dans le cas d’une protéine marquée, l’internalisation et l’étape de purification supplémentaire sont effectuées en pipetant la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre équipé d’un filtre à membrane de 0,22 micron sur le dessus. Séparez les cellules du tampon par centrifugation tout en vous assurant qu’il reste suffisamment de liquide au-dessus du filtre pour éviter que les cellules ne se dessèchent et jetez la fraction d’écoulement. Sous le filtre, ajoutez 500 microlitres de PBS frais sur les cellules et répétez la combinaison d’un spin down suivi d’une édition PBS fraîche.Deux fois de plus. Effectuez une dernière rotation à 3 300 G pendant une minute. Pour éliminer le lavage PBS précédent, remettez les cellules en suspension avec 150 microlitres de PBS.Enfin, retirez le couvercle supérieur du tampon aros précédemment fabriqué. Chargez les cellules sur le tampon en pipetant 10 microlitres de suspension de cellule dans le sens de la goutte. Après avoir placé une nouvelle lamelle nettoyée sur le tampon surélevé, les cellules sandwich sont maintenant prêtes pour la microscopie fluorescente.Les contrôles négatifs tels que les contrôles non classés, qui ont été incubés avec des biomolécules marquées ou les cellules vides, qui n’ont pas été électro-notées ni incubées, doivent également être préparés en parallèle avec tous les échantillons chargés, les cellules chargées peuvent être imagées sur n’importe quel microscope à fluorescence approprié. Alors que le mode d’imagerie à champ large permet l’imagerie et l’analyse au niveau cellulaire, l’éclairage est optimal pour l’observation et le suivi d’une molécule unique. Pour éviter un photoblanchiment excessif des biomolécules, assurez-vous que tous les éclairages laser sur scène sont plutôt éteints ou bloqués par un filtre opaque avant le chargement de l’échantillon.De plus, désactivez le gain de l’appareil photo E-M-C-C-G pour éviter d’endommager l’appareil photo en raison d’une surexposition. Pour une configuration de microscope inversé, placez le sandwich de tampon Aris sur la platine du microscope avec le côté recouvert de la cellule vers le bas vers l’objectif inférieur. Ensuite, allumez la lumière halogène du côté supérieur et faites la mise au point sur les cellules en mode de microscopie à lumière blanche transmise avant d’allumer le laser, prenez une photo des cellules en mode de transmission de la lumière blanche.Cette photo sera utilisée comme carte de référence de position qui corrélera entre les régions de fluorescence biomoléculaire et les emplacements réels des cellules dans le même champ de vision. Pour mesurer la viabilité, utilisez un objectif chauffant réglé à la température optimale et enregistrez des images séquentielles du même champ de vision sous un éclairage à lumière blanche toutes les 30 minutes sans déplacer la platine, éteignez l’éclairage supérieur et protégez votre échantillon de toutes les autres sources de lumière ambiante dans le laboratoire. Allumez ensuite la caméra CCD et commencez l’acquisition des données.Commencez à enregistrer l’ion fluorescent juste avant d’allumer l’éclairage laser. Après avoir effectué la microscopie fluorescente, commencez l’analyse des données en ouvrant toutes les photos avec un logiciel de traitement d’image tel que Image J pour commencer à normaliser tous les paramètres fondamentaux de l’image tels que la luminosité ou le contraste sur toutes les images en appuyant sur le bouton de réglage et en sélectionnant la propagation à toutes les autres images. La première option permet de déterminer qualitativement si le chargement de la cellule a réussi, car les cellules chargées doivent être significativement plus brillantes que les cellules non électroporées utilisées comme contrôle négatif pour une image donnée.Utilisez l’outil de sélection à main levée et encerclez différentes régions de fluorescence avec des polygones dessinés à la main. Comparez l’intensité de fluorescence entre tous les polygones pertinents en choisissant l’option de mesure dans le menu d’analyse. Répétez ce processus manuellement ou à l’aide d’un script automatisé pour extraire l’intensité par pixel de toutes les cellules de chaque échantillon et des contrôles négatifs.Lorsqu’une pile électronominale est chargée d’une ou plusieurs biomolécules fluorescentes, son intensité d’émission moyenne sera supérieure à l’intensité moyenne d’un échantillon de contrôle négatif. Pour évaluer la viabilité cellulaire, comptez manuellement le pourcentage de cellules en division intactes par les cellules non divisées et endommagées. Dans un même champ de vision pour lequel des données ont été enregistrées toutes les 30 minutes sur plusieurs divisions, il n’est pas toujours possible de compter directement le nombre de biomolécules internalisées par cellule, notamment lorsque les biomolécules diffusent rapidement ou lorsque les cellules sont chargées de plus de cinq biomolécules marquées.L’analyse du photoblanchiment cellulaire permet d’évaluer le nombre de biomolécules marquées par cellule dans de telles conditions. À l’aide du bouton de sélection à main levée, tracez le contour d’une cellule fluorescente donnée et extrayez et tracez la fluorescence brute de la cellule en fonction du temps dû aux effets de photoblanchiment. Le graphique de l’intensité en fonction du temps sera une courbe décroissante exponentielle, les cellules fortement chargées, mais pour les cellules contenant moins de 10 biomolécules, des étapes claires devraient être distinguées.Calculez l’autofluorescence moyenne après photoblanchiment en faisant la moyenne des valeurs d’intensité fluorescente brute près de la partie arrière plate de l’expérience, qui pourrait être, par exemple, à partir des 50 à 100 dernières images de la série time-lapse. Après avoir déterminé l’intensité de base et l’intensité de la ligne de base, calculez l’intensité du photoblanchiment en fonction du temps en soustrayant l’autofluorescence de base des données de fluorescence brutes, puis bloquez les données d’intensité de photoblanchiment résultantes et quantifiez la hauteur de chaque étape manuellement ou à l’aide d’un algorithme. Ce processus doit être répété pour plusieurs cellules présentant plus de 100 pas au total afin d’obtenir une estimation précise de la hauteur moyenne des pas, cette valeur correspond à l’intensité unitaire du fluoro quatre due au blanchiment d’un seul fluoro quatre.Enfin, le nombre de molécules internalisées par cellule peut être calculé en divisant l’intensité cellulaire soustraite de la ligne de base au temps égale à zéro par le fluoro unitaire. Quatre intensités pour ce protocole d’électroporation. La quantité d’ADN ou de protéine marquée par fluorescence qui peut être internalisée dans les bactéries ou les levures peut être contrôlée en ajustant la quantité de sondes d’ADN présentes dans le tampon d’électroporation.Lorsque le taux d’internalisation biomoléculaire est élevé, la durée de vie du photoblanchiment de la biomolécule marquée, que l’on peut trouver en traçant d’abord l’intensité fluorescente en fonction du temps, puis en extrayant sa constante de temps exponentielle, donne des informations sur la photostabilité des colorants in vivo. Dans le cas de faibles taux d’incorporation, la quantification de l’intensité fluorescente fournira un moyen d’estimer le nombre total de biomolécules dans une cellule donnée. L’électroporation peut également être utilisée pour incorporer des protéines dans des bactéries ou des levures.Dans le cas d’une protéine marquée par fluorescence. Étant donné que les fluorophores libres eux-mêmes peuvent être internalisés très efficacement, il est important d’éliminer tous les fluorophores libres et non covalents en excès du stock de protéines. Enfin, les molécules doublement marquées par nos molécules peuvent également être internalisées à l’aide de notre méthode pour permettre l’observation de l’empreinte d’une seule molécule dans des cellules vivantes pendant plusieurs secondes.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de préparer et d’analyser également les échantillons de contrôle tels que les cellules non électroélectriques, qui sont incubées avec une biomolécule marquée, ou les cellules vides, qui ne sont ni électroporées ni incubées avec une molécule marquée. Ces contrôles nous permettent d’évaluer le niveau d’autofluorescence cellulaire et l’absence d’étapes de lavage, et sont donc nécessaires pour évaluer si l’expérience d’électroporation a été réussie après ses développements. Cette technique a ouvert de nouvelles voies aux chercheurs dans le domaine de la biophysique et de la troisième biologie pour explorer la diffusion et le comportement dynamique des biomolécules marquées dans les microorganismes vivants.Et ce, sur une échelle de temps d’un à deux ordres de grandeur plus longue qu’avec des protéines autofluorescentes telles que les GFP. Il a transféré la flexibilité du marquage organique d in vivo, rendant les expériences de menace de molécule unique beaucoup plus réalisables pour l’étude de la dynamique intra et intermoléculaire dans les cellules vivantes.

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Internalisation et l'Observation des Biomolécules Fluorescent In Living micro-organismes par électroporation

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