Internalisation et l'Observation des Biomolécules Fluorescent In Living micro-organismes par électroporation

L’objectif de cette procédure est d’internaliser et de visualiser des biomolécules telles que de l’ADN ou des protéines marquées au fluor organique à l’intérieur de micro-organismes vivants à l’aide d’une méthode basée sur l’électroporation. Ceci est accompli en incubant d’abord des cellules électrocompétentes avec des biomolécules marquées par fluorescence avant de les transférer dans un vétérinaire d’électroporation. En appliquant une tension élevée à travers le vete, les formations de pores transitoires sur la paroi cellulaire et la membrane cellulaire permettront une diffusion biomoléculaire dans les cellules.

Ensuite, les cellules sont incubées dans un milieu riche pour leur permettre de récupérer avant que les biomolécules non internalisées en excès ne soient éliminées. Enfin, les cellules sont transférées sur un tampon nutritif minimal à faible fluorescence, puis une lamelle en verre est recouverte sur le dessus pour former un agrosandwich en verre. En fin de compte, la microscopie essence est utilisée pour analyser l’emplacement, le modèle de diffusion et les propriétés dynamiques des biomolécules marquées à l’intérieur des cellules vivantes.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons réalisé les limites de l’imagerie de cellules vivantes. En raison du glitch rapide des protéines photofluorescentes telles que la GFP, nous avons pensé qu’en chargeant des cellules vivantes avec des biomolécules marquées avec une force fluoro organique, nous transplanterions des micro-organismes vivants. Les principaux avantages de cette force sont la luminosité, la stabilité de la photo et la petite taille.

Nous espérons ensuite suivre la localisation et la diffusion de l’ADN ou des protéines dans leur environnement natif sur des échelles de temps beaucoup plus longues, ce qui correspondrait à de nombreux processus biologiques importants. Le principal avantage de ces techniques par rapport aux méthodes existantes, telles que la microinjection, est qu’elles peuvent également être appliquées à des micro-organismes plus petits que le diamètre d’une aiguille de micro-injection typique. Un avantage supplémentaire de l’électroporation est qu’un grand nombre de cellules peuvent être chargées en même temps avec des biomolécules fluorescentes et visualiser en parallèle celles faisant de l’électroporation une technique particulièrement fréquentée par l’œil.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la diffusion et du comportement dynamique des biomolécules marquées par fluorescence in vivo, elle peut également être appliquée dans d’autres contextes tels que pour électroder des biomolécules qui ne sont pas marquées, mais elle peut, par exemple, déclencher une réponse physiologique lorsqu’elle est internalisée par la cellule Pour construire des tampons aros pour les bactéries ou la levure microscopie fluorescente commencer par préparer des milieux à faible fluorescence, Ensuite, faites fondre rapidement une solution de 2 % d’aros dans de l’eau distillée avec un micro-ondes de laboratoire. Ajoutez un volume correspondant de rose HA chaude dans le support et pipetez doucement le mélange de haut en bas. Pour éviter la formation de bulles, pipetez immédiatement environ 200 microlitres du mélange sur une lamelle de microscope de taille standard.

Laissez la lamelle sur le banc pendant une minute à température ambiante jusqu’à ce que le gel se solidifie ou que le stockage temporaire soit placé sur une deuxième lamelle nettoyée sur le tampon frais et appliquez doucement une pression du haut vers la rose d’œuf, en commençant par un stock de biomolécules fluorescentes préparées dans un tampon à faible force ionique. Transférez jusqu’à cinq microlitres de biomolécules dans une aliquote de 20 microlitres de bactéries compétentes ou 50 microlitres de cellules de levure compétentes. La quantité de biomolécules fluorescentes incubées avec les cellules est directement corrélée à la quantité de biomolécules internalisées par cellule.

Après l’électroporation, incubez le mélange sur de la glace jusqu’à 10 minutes. Dans le même temps, sélectionnez un type d’électroporation avec un espacement approprié des électrodes et refroidissez sur de la glace. Transférez le mélange de cellules dans le vete pré-refroidi.

Tapotez doucement le vete plusieurs fois pour éliminer les bulles de la solution. Enlevez toute humidité du vétérinaire avec une serviette en papier et placez le vétérinaire dans l’électrofiltre. Appliquez une impulsion à haute tension aux cellules juste après ce processus.

Vérifiez que la constante de temps affichée sur l’électromètre est comprise entre quatre et six millisecondes. Des constantes de temps plus faibles sont souvent dues à la présence d’un excès de sel ou de bulles dans le qve, et cela peut diminuer ou inhiber complètement l’absorption de biomolécules dans les cellules. Des impulsions de tension plus élevées améliorent la charge de la cellule, mais peuvent également affecter la viabilité de la cellule immédiatement après l’électroporation.

Ajoutez 500 microlitres de milieu riche et transférez les cellules dans un tube frais de 1,5 millilitre. Laissez la membrane cellulaire se rétablir en incubant les bactéries à 37 degrés Celsius ou les levures à 29 degrés Celsius pendant deux à 10 minutes. Après l’incorporation de la biomolécule et la récupération de la croissance, faites tourner les cellules pendant une minute dans une centrifugeuse pré-refroidie à quatre degrés Celsius et jetez l’agent Reese en décubitus dorsal.

Suspendez le granulé dans 500 microlitres de tampon et répétez les processus de centrifugation et d’élimination et de suspension du réusob. Trois fois de plus. Ces étapes de lavage permettront d’éliminer toutes les traces de biomolécules non internalisées de la suspension cellulaire.

Dans le cas d’une protéine marquée, l’internalisation et l’étape de purification supplémentaire sont effectuées en pipetant la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre équipé d’un filtre à membrane de 0,22 micron sur le dessus. Séparez les cellules du tampon par centrifugation tout en vous assurant qu’il reste suffisamment de liquide au-dessus du filtre pour éviter que les cellules ne se dessèchent et jetez la fraction d’écoulement. Sous le filtre, ajoutez 500 microlitres de PBS frais sur les cellules et répétez la combinaison d’un spin down suivi d’une édition PBS fraîche.

Deux fois de plus. Effectuez une dernière rotation à 3 300 G pendant une minute. Pour éliminer le lavage PBS précédent, remettez les cellules en suspension avec 150 microlitres de PBS.

Enfin, retirez le couvercle supérieur du tampon aros précédemment fabriqué. Chargez les cellules sur le tampon en pipetant 10 microlitres de suspension de cellule dans le sens de la goutte. Après avoir placé une nouvelle lamelle nettoyée sur le tampon surélevé, les cellules sandwich sont maintenant prêtes pour la microscopie fluorescente.

Les contrôles négatifs tels que les contrôles non classés, qui ont été incubés avec des biomolécules marquées ou les cellules vides, qui n’ont pas été électro-notées ni incubées, doivent également être préparés en parallèle avec tous les échantillons chargés, les cellules chargées peuvent être imagées sur n’importe quel microscope à fluorescence approprié. Alors que le mode d’imagerie à champ large permet l’imagerie et l’analyse au niveau cellulaire, l’éclairage est optimal pour l’observation et le suivi d’une molécule unique. Pour éviter un photoblanchiment excessif des biomolécules, assurez-vous que tous les éclairages laser sur scène sont plutôt éteints ou bloqués par un filtre opaque avant le chargement de l’échantillon.

De plus, désactivez le gain de l’appareil photo E-M-C-C-G pour éviter d’endommager l’appareil photo en raison d’une surexposition. Pour une configuration de microscope inversé, placez le sandwich de tampon Aris sur la platine du microscope avec le côté recouvert de la cellule vers le bas vers l’objectif inférieur. Ensuite, allumez la lumière halogène du côté supérieur et faites la mise au point sur les cellules en mode de microscopie à lumière blanche transmise avant d’allumer le laser, prenez une photo des cellules en mode de transmission de la lumière blanche.

Cette photo sera utilisée comme carte de référence de position qui corrélera entre les régions de fluorescence biomoléculaire et les emplacements réels des cellules dans le même champ de vision. Pour mesurer la viabilité, utilisez un objectif chauffant réglé à la température optimale et enregistrez des images séquentielles du même champ de vision sous un éclairage à lumière blanche toutes les 30 minutes sans déplacer la platine, éteignez l’éclairage supérieur et protégez votre échantillon de toutes les autres sources de lumière ambiante dans le laboratoire. Allumez ensuite la caméra CCD et commencez l’acquisition des données.

Commencez à enregistrer l’ion fluorescent juste avant d’allumer l’éclairage laser. Après avoir effectué la microscopie fluorescente, commencez l’analyse des données en ouvrant toutes les photos avec un logiciel de traitement d’image tel que Image J pour commencer à normaliser tous les paramètres fondamentaux de l’image tels que la luminosité ou le contraste sur toutes les images en appuyant sur le bouton de réglage et en sélectionnant la propagation à toutes les autres images. La première option permet de déterminer qualitativement si le chargement de la cellule a réussi, car les cellules chargées doivent être significativement plus brillantes que les cellules non électroporées utilisées comme contrôle négatif pour une image donnée.

Utilisez l’outil de sélection à main levée et encerclez différentes régions de fluorescence avec des polygones dessinés à la main. Comparez l’intensité de fluorescence entre tous les polygones pertinents en choisissant l’option de mesure dans le menu d’analyse. Répétez ce processus manuellement ou à l’aide d’un script automatisé pour extraire l’intensité par pixel de toutes les cellules de chaque échantillon et des contrôles négatifs.

Lorsqu’une pile électronominale est chargée d’une ou plusieurs biomolécules fluorescentes, son intensité d’émission moyenne sera supérieure à l’intensité moyenne d’un échantillon de contrôle négatif. Pour évaluer la viabilité cellulaire, comptez manuellement le pourcentage de cellules en division intactes par les cellules non divisées et endommagées. Dans un même champ de vision pour lequel des données ont été enregistrées toutes les 30 minutes sur plusieurs divisions, il n’est pas toujours possible de compter directement le nombre de biomolécules internalisées par cellule, notamment lorsque les biomolécules diffusent rapidement ou lorsque les cellules sont chargées de plus de cinq biomolécules marquées.

L’analyse du photoblanchiment cellulaire permet d’évaluer le nombre de biomolécules marquées par cellule dans de telles conditions. À l’aide du bouton de sélection à main levée, tracez le contour d’une cellule fluorescente donnée et extrayez et tracez la fluorescence brute de la cellule en fonction du temps dû aux effets de photoblanchiment. Le graphique de l’intensité en fonction du temps sera une courbe décroissante exponentielle, les cellules fortement chargées, mais pour les cellules contenant moins de 10 biomolécules, des étapes claires devraient être distinguées.

Calculez l’autofluorescence moyenne après photoblanchiment en faisant la moyenne des valeurs d’intensité fluorescente brute près de la partie arrière plate de l’expérience, qui pourrait être, par exemple, à partir des 50 à 100 dernières images de la série time-lapse. Après avoir déterminé l’intensité de base et l’intensité de la ligne de base, calculez l’intensité du photoblanchiment en fonction du temps en soustrayant l’autofluorescence de base des données de fluorescence brutes, puis bloquez les données d’intensité de photoblanchiment résultantes et quantifiez la hauteur de chaque étape manuellement ou à l’aide d’un algorithme. Ce processus doit être répété pour plusieurs cellules présentant plus de 100 pas au total afin d’obtenir une estimation précise de la hauteur moyenne des pas, cette valeur correspond à l’intensité unitaire du fluoro quatre due au blanchiment d’un seul fluoro quatre.

Enfin, le nombre de molécules internalisées par cellule peut être calculé en divisant l’intensité cellulaire soustraite de la ligne de base au temps égale à zéro par le fluoro unitaire. Quatre intensités pour ce protocole d’électroporation. La quantité d’ADN ou de protéine marquée par fluorescence qui peut être internalisée dans les bactéries ou les levures peut être contrôlée en ajustant la quantité de sondes d’ADN présentes dans le tampon d’électroporation.

Lorsque le taux d’internalisation biomoléculaire est élevé, la durée de vie du photoblanchiment de la biomolécule marquée, que l’on peut trouver en traçant d’abord l’intensité fluorescente en fonction du temps, puis en extrayant sa constante de temps exponentielle, donne des informations sur la photostabilité des colorants in vivo. Dans le cas de faibles taux d’incorporation, la quantification de l’intensité fluorescente fournira un moyen d’estimer le nombre total de biomolécules dans une cellule donnée. L’électroporation peut également être utilisée pour incorporer des protéines dans des bactéries ou des levures.

Dans le cas d’une protéine marquée par fluorescence. Étant donné que les fluorophores libres eux-mêmes peuvent être internalisés très efficacement, il est important d’éliminer tous les fluorophores libres et non covalents en excès du stock de protéines. Enfin, les molécules doublement marquées par nos molécules peuvent également être internalisées à l’aide de notre méthode pour permettre l’observation de l’empreinte d’une seule molécule dans des cellules vivantes pendant plusieurs secondes.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de préparer et d’analyser également les échantillons de contrôle tels que les cellules non électroélectriques, qui sont incubées avec une biomolécule marquée, ou les cellules vides, qui ne sont ni électroporées ni incubées avec une molécule marquée. Ces contrôles nous permettent d’évaluer le niveau d’autofluorescence cellulaire et l’absence d’étapes de lavage, et sont donc nécessaires pour évaluer si l’expérience d’électroporation a été réussie après ses développements. Cette technique a ouvert de nouvelles voies aux chercheurs dans le domaine de la biophysique et de la troisième biologie pour explorer la diffusion et le comportement dynamique des biomolécules marquées dans les microorganismes vivants.

Et ce, sur une échelle de temps d’un à deux ordres de grandeur plus longue qu’avec des protéines autofluorescentes telles que les GFP. Il a transféré la flexibilité du marquage organique d in vivo, rendant les expériences de menace de molécule unique beaucoup plus réalisables pour l’étude de la dynamique intra et intermoléculaire dans les cellules vivantes.