Détection et analyse de l'ADN dommages souris muscle squelettique In Situ Utilisation de la méthode TUNEL
16 décembre 2014
Cette vidéo décrit la dissection, le traitement des tissus, le sectionnement et le marquage TUNEL par fluorescence du muscle squelettique de la souris. Il décrit également une méthode d’analyse semi-automatisée de l’étiquetage TUNEL.
L’objectif global de cette procédure est de détecter les cassures de l’ADN et la mort cellulaire dans C deux. Ceci est accompli par des coupes de tissu au premier perme pour permettre aux réactifs tunnel de pénétrer dans le noyau cellulaire. Ensuite, l’enzyme TDT est utilisée pour attacher de manière covalente les DTP à trois extrémités premières des cassures de l’ADN dans ces cellules.
Ensuite, le DUTP est marqué à l’aide d’une sonde fluorescente. En fin de compte, le signal positif tunnel est quantifié dans des coupes de tissus reflétant la fréquence relative des cassures de l’ADN dans les cellules. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le transfert de Southern ou l’immunohistochimie, est qu’elle est relativement rapide et qu’elle permet d’éliminer le bruit et l’autofluorescence.
Commencez par fixer les membres postérieurs isolés dans 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS dans un tube de 15 millilitres pour permettre la fixation pendant quatre à au maximum 24 heures à quatre degrés Celsius. Seulement deux heures sont nécessaires si le tissu est embryonnaire. Cependant, après la fixation, remplacez la solution par 10 % de saccharose pour cryoprotéger le tissu et l’incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius.
Le lendemain, changez la solution pour du saccharose stérile filtré à 30 % et continuez l’incubation pendant la nuit ou jusqu’à ce que les membres postérieurs coulent au fond du tube. Lors de l’encastrement, il est important que les membres postérieurs soient complètement immergés dans le milieu d’encastrement. Les moules d’enrobage peuvent être placés directement sur de la glace carbonique ou en isop pentane sur de la glace carbonique pour congeler le support.
Lors de la cryosection. Les blocs coupent des sections de transfert de 10 microns d’épaisseur ou plus fines, les sections plus épaisses ne seront pas pénétrées par les réactifs de marquage en tunnel. Collectez ces sections minces sur des lames de verre à revêtement de gélatine ou de liaison vectorielle à température ambiante.
Très rapidement, transférez les lames sur de la glace sèche pour les ranger. Décongelez d’abord une lame de section de tissu congelé à température ambiante et laissez-la sécher pendant 16 à 64 heures. Une fois la lame à température ambiante, réhydratez la section dans un bocal d’accouplement rempli de PBS pendant 10 minutes.
Répétez cette étape de réhydratation une fois, puis séchez soigneusement la lame avec une lingette de laboratoire sans perturber la section de tissu pour perméer la section, placez la lame dans une chambre d’humidité et pipetez 50 microlitres de réactifs commerciaux à base de saponine non protéolytique sur la section. Ne pipetez pas directement sur les sections car elles pourraient se détacher ou être endommagées. Placez ensuite un petit morceau de film para sur la section pour étaler le réactif.
Si des bulles se forment, réappliquez le film para. Laissez la diapositive incuber pendant une heure après une heure. Retirez les réactifs à l’aide de deux lavages de cinq minutes dans du PBS et séchez-le soigneusement.
À côté de l’étiquette des cassures d’ADN par TDT, utilisez un kit disponible dans le commerce. Tout d’abord, créez le tampon XTDT et pipetez sur la section. Ensuite, incubez la lame pendant cinq minutes dans la chambre d’humidification.
Deuxièmement, préparez un mélange d’étiquetage TDT selon les instructions du kit ou une diapositive de contrôle positif. Ajoutez de l’ADN au mélange d’étiquetage TDT. Pour une lame de contrôle négative, omettez l’enzyme TDT du mélange.
Maintenant, à l’aide d’une lingette, retirez autant de tampon que possible de la lame et pipetez-la sur le mélange d’étiquetage. 50 microlitres devraient suffire. Encore une fois, étalez la solution avec du paraform sans faire de bulles.
Laissez la lame incuber dans la chambre pendant une heure maintenant à 37 degrés Celsius. Troisièmement, faites le tampon un x stop selon les instructions du kit. Après avoir retiré le mélange d’étiquetage avec la lingette de laboratoire, ajoutez entre deux et 300 microlitres de mélange stop pour couvrir complètement la section.
Ensuite, incubez la lame pendant cinq minutes dans la chambre. Aucun film para n’est utilisé dans cette étape. Pour retirer le tampon d’arrêt, utilisez deux lavages de deux minutes dans PBS.
Maintenant, pipetez 50 microlitres de solution d’étiquetage à la fluorescéine fraîchement préparée. Sur la lame, appliquez du perfil et incubez pendant 20 minutes dans la chambre, mais maintenant dans l’obscurité. Retirez la solution d’étiquetage en un seul lavage de deux minutes dans du PBS pendant le lavage, diluez quelques crochets.
3, 3, 3, 2, 5, 8 à un microgramme par millilitre en PBS. Après les lavages, couvrez les sections dans un à 200 microlitres de la solution de crochets diluée. Ensuite, incubez la lame pendant cinq minutes, à l’abri de la lumière pour retirer les crochets à tacher, utilisez trois lavages de cinq minutes en PBS.
Ensuite, séchez soigneusement la lame avec une lingette de laboratoire et appliquez une lamelle pour l’imagerie. Imagez la section à l’aide de filtres dpi, fitzy et Texas red pour séparer les signaux de coloration des crochets, de coloration tunnel et d’autofluorescence en trois canaux de fausses couleurs en une seule image. Normalisez et conservez les mêmes paramètres d’imagerie entre toutes les lames afin qu’elles puissent être facilement comparées.
N’utilisez pas de paramètres d’exposition ou de gain automatiques pour la référence anatomique. Utilisez une image en fond clair d’une section adjacente d’un membre postérieur colorée par h et e dans le logiciel d’analyse d’image. Fermez le canal du tunnel.
Tracez ensuite manuellement le contour de la zone musculaire à quantifier à l’aide des autres canaux. Convertissez la zone tracée en masque. Ensuite, rallumez le canal du tunnel et ajustez le seuil d’intensité minimum pour exclure le signal autofluorescent.
Utilisez la même limite de seuil sur toutes les sections analysées dans l’étude. Ensuite, convertissez les pixels de seuil en masque. Dans chaque image, combinez le masque de zone musculaire et le masque tunnel de seuil.
Cela fait une représentation du signal du tunnel dans la zone musculaire tracée. Quantifiez maintenant le masque combiné pour déterminer le nombre d’objets positifs en tunnel et la surface totale des pixels du signal tunnel dans le muscle. Utilisez ces valeurs pour l’analyse statistique.
Les objets positifs en tunnel à faible grossissement peuvent apparaître comme des fragments irréguliers brillants dans le muscle squelettique. Cependant, à un grossissement plus élevé, certains objets positifs en tunnel avec la morphologie apoptotique classique devraient être observés si le type de mort cellulaire impliquait cette apoptose. Le témoin positif avec des ADNs D ajoutés doit présenter un signal positif tunnel abondant et distribué uniformément dans tous les tissus.
Dans la section. Le témoin négatif sans enzyme TDT doit avoir un bruit de fond de faible intensité et ne montrer qu’une autofluorescence. Avec le protocole décrit, il a été constaté que les globules rouges osseux et les cellules endothéliales contribuaient au signal autofluorescent dans les sections préparées des membres supérieurs.
Le signal positif du véritable tunnel était beaucoup plus intense. Il pourrait être isolé du signal autofluorescent à l’aide d’un seuil d’intensité de pixel. Une autre option pour isoler le signal tunnel consistait à soustraire numériquement le canal d’autofluorescence rouge du canal tunnel.
En utilisant cette technique, la mort des cellules musculaires squelettiques. Dans un modèle murin d’AS a été évalué, le marquage tunnel a révélé plus de cellules apoptotiques chez les souris AS âgées de cinq jours que chez les témoins. En quantifiant la coloration en tunnel, cette observation s’est avérée statistiquement significative pour plusieurs groupes musculaires du membre postérieur.
Une fois maîtrisée, la technique du tunnel peut être réalisée en quatre heures environ pour générer des résultats quantitatifs fiables.
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Aperçu
Ce vidéo décrit une méthode permettant de détecter les cassures de l'ADN et la mort cellulaire dans le muscle squelettique de souris par marquage TUNEL. Elle précise les étapes de dissection, de traitement des tissus et d'analyse semi-automatisée associées à cette technique.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Histologie
Contexte
- Comprendre les cassures de l'ADN est essentiel pour l'étude de la mort cellulaire.
- Le marquage TUNEL est une méthode spécifique pour détecter ces cassures.
- Les méthodes traditionnelles peuvent être plus lentes et moins spécifiques.
- Cette technique vise à améliorer la rapidité et la précision de la détection.
Objectif de l'étude
- Fournir une méthode fiable pour quantifier les cassures de l'ADN dans des sections de tissus.
- Approfondir la compréhension des mécanismes de mort cellulaire.
- Proposer une alternative plus rapide aux méthodes existantes.
Méthodes utilisées
- Disséction du muscle squelettique de souris.
- Traitement des tissus pour préparer les échantillons à l'analyse.
- Marquage TUNEL basé sur la fluorescence pour détecter les cassures de l'ADN.
- Analyse semi-automatisée pour quantifier les signaux positifs au TUNEL.
Résultats principaux
- Détection réussie des cassures de l'ADN dans le tissu musculaire.
- Quantification des signaux positifs au test TUNEL reflétant la mort cellulaire.
- Mise en évidence de la rapidité et de la spécificité de la méthode.
- Comparaison avec les méthodes traditionnelles mettant en lumière ses avantages.
Conclusions
- La méthode de marquage TUNEL est efficace pour l'étude de la mort cellulaire.
- Cette approche peut améliorer la recherche en biologie musculaire.
- Elle fournit un outil précieux pour les études futures sur les lésions de l'ADN.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
La détection des lésions de l'ADN dans le muscle squelettique fournit des informations mécanistiques sur les voies de mort cellulaire pertinentes pour les modèles de maladies neuromusculaires et l'évaluation de l'efficacité thérapeutique. La méthode TUNEL permet une mesure quantitative et reproductible de l'apoptose dans des sections tissulaires, soutenant la validation de cibles et l'identification de candidats dans la découverte préclinique. En isolant le vrai signal de l'autofluorescence par soustraction numérique de canaux, le test améliore la fiabilité prédictive de la confirmation des mécanismes pathologiques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en confirmant les lésions de l'ADN comme mécanisme pathologique dans les modèles de maladie.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle de cibles grâce à la mesure directe de la mort cellulaire dans les tissus pertinents.
- Valeur prédictive : Facilite le tri du portefeuille en quantifiant l'efficacité des interventions thérapeutiques en matière d'apoptose in vivo.
Développement de criblages et de tests
- Prêt pour les tests : Produit des mesures quantitatives normalisées du signal positif au TUNEL pour les campagnes de criblage de composés.
- Reproductibilité : La quantification semi-automatisée assure une détection cohérente du signal entre les sections et les groupes expérimentaux.
- Réduction du bruit : La soustraction numérique des canaux exclut l'autofluorescence, améliorant ainsi la sensibilité et la fiabilité du test.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Appliqué à des modèles murins de SMA pour évaluer la mort des cellules musculaires squelettiques, démontrant une utilité translationnelle.
- Dérisquage mécanistique : Confirme l'implication de l'apoptose dans la mort cellulaire, réduisant l'ambiguïté dans l'analyse des voies.
- Continuité préclinique : Soutient les décisions d'avancement ajustées au risque en reliant la modulation de la cible à des résultats phénotypiques.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible à l'identification de composés précurseurs, en passant par les tests d'efficacité préclinique, en fournissant des lectures quantitatives de l'apoptose qui orientent les décisions de poursuite ou d'abandon.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en détectant les cassures de l'ADN et en précisant les mécanismes de mort cellulaire dans le muscle squelettique.
- Écrantage : Fournit des résultats quantitatifs prêts à l'analyse pour évaluer les effets de composés sur l'apoptose au niveau tissulaire.
- Analytique : Génère des masques de signal basés sur des seuils et des décomptes d'objets permettant des comparaisons statistiques entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes à la validation préclinique par la modélisation de l'apoptose pertinente pour la maladie dans le muscle de souris.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme reutilisable fondée sur la fluorescence pour la détection de l'apoptose dans divers types de tissus et modèles de maladies.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique entourant les voies de mort cellulaire.
- Valeur opérationnelle : Assure la standardisation et la reproductibilité grâce à des paramètres d'imagerie fixes et à une quantification semi-automatisée.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en permettant des décisions précoces de poursuite ou d'abandon fondées sur des données, en fonction de l'efficacité de l'apoptose.
- Impact sur le portefeuille : Facilite la priorisation ajustée au risque en quantifiant l'impact thérapeutique sur les lésions de l'ADN et la mort cellulaire.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en histologie, en sectionnement tissulaire et en microscopie à fluorescence.
- Dépend d'un cryostat, d'un microscope à fluorescence et d'un logiciel d'analyse d'images doté de fonctions de séparation des canaux.
- Exige une standardisation des protocoles de fixation, d'inclusion et de sectionnement entre les équipes.
- Doit tenir compte de l'autofluorescence spécifique aux tissus provenant de sources telles que les globules rouges, l'os et les cellules endothéliales.
- Limité par les artefacts induits par le traitement des tissus, qui peuvent affecter l'efficacité de l'enzyme TdT et le rapport signal sur bruit.
