Dérivation efficace des cellules d'épithélium pigmentaire de la rétine à partir de cellules souches

L’objectif global de cette procédure est de dériver de manière reproductible un épithélium pigmentaire rétinien de haute qualité, ou EPR, à partir de cellules souches. Ceci est accompli en cultivant d’abord des cellules souches pluripotentes inductibles jusqu’à la co-fluidité. Dans la deuxième étape, le milieu est modifié pour diriger les cellules vers le destin de l’EPR.

Ensuite, les cellules RPE sont isolées des autres cellules différenciées dans la boîte, puis les cultures sont développées jusqu’à ce qu’un nombre suffisant de cellules soit obtenu. En fin de compte, la pigmentation foncée et les morphologies pavées des cultures peuvent être utilisées pour confirmer que les cellules EPR atteignent la différenciation terminale. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la différenciation spontanée, est que l’ajout de facteurs définis accélère la différenciation, le temps et augmente le rendement de l’EPR.

À ce jour, des milliers de rongeurs ont été guéris à l’aide de cellules EPR, dérivées de diverses maladies dégénératives rétiniennes IPSA. Cependant, si nous traduisons cela de manière efficace et efficiente dans le traitement des humains dans les cliniques avec ces maladies, il est absolument impératif que nous développions des protocoles reproductibles bien établis, qui nous fourniront une haute qualité, un nombre élevé de ventes de RPE et IPS La présentation visuelle de cette méthode est essentielle est qu’une seule personne peut travailler au microscope sous le capot à un moment donné, ce qui rend l’étape d’isolement difficile à visualiser. Mitchell Prince, un technicien de recherche de mon laboratoire, va maintenant faire la démonstration du protocole associé aux aspects de la culture numérique de la procédure Pour diriger la différenciation de la culture RPE dérivée de cellules souches, la lignée de cellules souches d’intérêt sur une couche de cellules nourricières embryonnaires de souris à deux fois 10 aux six cellules par puits d’une plaque à six puits, Laissez les colonies atteindre la fluidité Cof, puis passez à des alimentations quotidiennes avec différenciation.

Milieu complété par du nicotinamide. Après trois semaines, commencez à ajouter des actifs dans un ou un IDE aux alimentations pour améliorer la différenciation de l’EPR. Deux semaines plus tard, revenez au milieu de différenciation et au nicotinamide seul, en arrêtant les tétées quotidiennes.

Une fois que les indicateurs de pH du milieu cessent de jaunir le lendemain de l’alimentation, retournez la culture dans l’incubateur jusqu’à ce que des œillets de cellules pigmentées apparaissent et soient suffisamment gros pour être coupés et retirés. Pour isoler les œillets pigmentés, la couche suivante consiste à utiliser les puits d’une plaque de 24 puits avec une matrice sans xéno qui imite l’environnement cellulaire naturel. Ensuite, remplissez autant de puits de la plaque à 24 puits avec des milieux de différenciation que nécessaire.

Et dans une hotte de culture cellulaire, utilisez une lunette de dissection et un scalpel pour hacher chaque œillet pigmenté au bas de la plaque d’origine en deux à six morceaux et saisissez les parties pigmentées avec une pince tranchante, puis transférez un à deux morceaux pigmentés dans chacun.24. Incubez bien la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant trois à cinq jours jusqu’à ce que les cellules adhèrent. Ensuite, commencez à changer de support trois fois par semaine.

Développez les cellules pendant trois à quatre semaines dans le milieu de différenciation. Continuer à nourrir les cellules trois fois par semaine jusqu’au passage. L’EPR ajoute 200 microlitres de solution de dissociation cellulaire préchauffée non trypsine à 37 degrés Celsius pour détacher les cellules.

Après cinq à huit minutes, arrêtez la réaction avec un milieu de différenciation frais, puis remettez les cultures en suspension dans des suspensions unicellulaires avec une pipette de 200 microlitres, en regroupant les colonies avec peu de cellules. Ensuite, transférez les colonies dissociées dans des tubes de 15 millilitres et faites tourner les cellules. Resus mettant en suspension les pastilles dans trois millilitres de milieu de différenciation transfère chacun les colonies dans chaque puits d’une plaque à six puits codée par matrice contenant trois millilitres supplémentaires de milieu de différenciation par puits.

Ensuite, élargissez les cellules pendant une à deux semaines jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à environ 90 % et détachez à nouveau les cellules dans un millilitre de solution de dissociation comme nous venons de le démontrer. Cette heure. À l’aide d’une pipette de 1000 microlitres pour remettre les cellules en suspension, transférez la solution unicellulaire dans un tube conique de 50 millilitres.

Et puis, après avoir fait tourner à nouveau les cellules, suspendez la pastille. En 18 millilitres de différenciation, le milieu remplit enfin les cellules dans un récipient de culture codé matricielle pour obtenir le nombre maximum de cellules souhaitées dans le nombre minimum de passages pour une analyse plus poussée en aval, les colonies pigmentées commencent à apparaître après cinq à sept semaines de culture de lignées de cellules souches pluripotentes inductibles. Ces colonies peuvent continuer à croître pendant des semaines pendant que les cultures sont maintenues.

Une fois qu’ils ont atteint une taille suffisante, ils peuvent être excisés manuellement. L’excision soigneuse pour éviter la contamination par des cellules non EPR facilite grandement la génération de cultures EPR suffisamment pures. Une fois maîtrisés, un grand nombre de cellules EPR peuvent être dérivées en huit à 12 semaines si la technique est correctement exécutée.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de ne pas contaminer les cultures lors de la fabrication des milieux et de l’alimentation des cellules. Après avoir regardé cette vidéo, nous espérons que beaucoup d’entre vous seront en mesure de produire un grand nombre de cellules RPE de haute qualité à partir d’IPS. Espérons que cela facilitera une traduction plus rapide du laboratoire au chevet du patient et offrira des thérapies cellulaires aux patients souffrant de maladies néovasculaires dégénératives rétiniennes actuellement incurables.