Name: Dérivation efficace des cellules dépithélium pigmentaire de la rétine à partir de cellules souches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Découvrez une méthode efficace pour dériver des cellules d'épithélium pigmentaire rétinien à partir de cellules souches pluripotentes induites. Ce protocole accélère la différenciation et augmente le rendement cellulaire pour la recherche en médecine régénérative.

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Nous tenons à remercier les personnes suivantes : Drs Tim Krohne et Eyal Banin (ainsi que Dr. Mandy Lehmann et David Friedlander) pour leur aide généreuse dans le développement des protocoles de différenciation. Dr. Felicitas Bucher a fourni de l’aide pour différencier les cellules RPE utilisées dans cette étude. Nous remercions également le National Eye Institute (subventions NEI EY11254 et EY021416), le California Institute for Regenerative Medicine (subvention CIRM TR1-01219) et le Lowy Medical Research Institute (LMRI) pour le financement très généreux de ce projet.

1. différenciation dirigée des cellules souches dérivées RPE Remarque: Toutes les étapes d&#39;incubation sont effectuées à 37 ° C dans 5% de CO 2 <ol style="margin-left: 40px;"><li> Maintenir les lignes ou les hanches (hES nourrir quotidienne) dans les médias de maintenance (MM; Tableau 1). Une fois que les lignes ont atteint les normes suffisantes de contrôle de la qualité, les maintenir sur une couche de cellules nourricières de souris embryonnaires (MEF) ensemencé à une densité de 250 000 / puits d&#39;une plaque de six. Cultures sans Xeno-peuvent également être générés suivant le protocole établi par Tucker et al. 40. </li><li> Autoriser les colonies de cellules souches pour atteindre la confluence. </li><li> Mettre aux médias de différenciation avec nicotinamide (DM / NIC; Tableau 1); nourrir tous les jours. </li><li> Après trois semaines de culture, passer aux médias de différenciation avec nicotinamide et soit activine-A ou IDE-1 (DM / NIC / AA ou DM / NIC / IDE1; Tableau 1) pour améliorer la différenciation des RPE. </li&gt; <li> Après cinq semaines de culture, revenir au DM / NIC. Tétées quotidiennes ne sont plus nécessaires une fois que les indicateurs de pH dans l&#39;arrêt de médias jaunir le jour après le repas. </li><li> Attendez îlots de cellules pigmentées à comparaître qui sont assez grand pour être coupé et enlevé (voir les figures 2D-F et 3A). </li></ol> 2. Isolating pigmentées îlots <ol style="margin-left: 40px;"><li> Enduire les puits d&#39;une plaque de 24 puits avec une matrice qui imite l&#39;environnement naturel des cellules (est préférable gratuitement xéno-). REMARQUE: lames de la cornée et tranchants, pinces à pointe fine sont très utiles pour la cueillette. La totalité de la feuille de cellules différenciées peut se détacher alors que la cueillette. Évitez cela en travaillant avec soin et initialement prélèvement de colonies dans le centre de l&#39;assiette. </li><li> Remplissez autant de puits de la plaque de 24 puits avec les médias de différenciation (DM; Tableau 1) que nécessaire. Cette décision dépendra du nombre de colonies pigmentéesrecueillis. </li><li> Dans une hotte de culture cellulaire avec un microscope à dissection, couper manuellement îlots pigmentées. Hacher chaque îlot au bas de la plaque d&#39;origine en utilisant un scalpel dans environ 6/2 pièces et saisir les parties pigmentées avec des pinces coupantes. </li><li> Transfert 1-2 pièces pigmentées dans chaque 24 puits. </li><li> Ne pas changer de support pendant 3-5 jours jusqu&#39;à ce que les cellules adhèrent, puis commencer à changer de support trois fois par semaine. (Se ils ne adhèrent pas après cette heure, la probabilité est bon qu&#39;ils ne le sera jamais). </li><li> Développer cellules pendant 3-4 semaines dans les médias de différenciation (DM; Tableau 1) - Une image d&#39;une culture typique est montré à la figure 3B. Les cellules peuvent toujours pas remplir la totalité de bien, mais attendre plus longtemps ne semble pas aider. Nourrir les cellules trois fois par semaine. </li><li> Après environ trois semaines, supprimer manuellement des amas de cellules blanches en bouquets si nécessaire avec des pinces coupantes. Ne faites pas cette étape si cela est nécessaire - il est facile d&#39;introduire des contaminants. Il est idéal pourtenter d&#39;obtenir plus purs populations de RPE des colonies pigmentées d&#39;origine à l&#39;étape 1.6. </li></ol> 3. Le repiquage de cellules souches dérivées RPE <ol style="margin-left: 40px;"><li> Détacher les cellules avec 200 ul d&#39;une solution de dissociation cellulaire (de préférence pas trypsine un réactif qui peut être inactivée par dilution est préférable) pour 5-8 minutes à 37 ° C, et l&#39;inactiver par dilution avec du DM. Utiliser une pipette de 200 pi pour laver toutes les cellules et de les remettre en suspension (Si le bien sélectionné ne contient que quelques cellules, envisager la mise en commun des cellules de deux 24-puits). </li><li> Centrifugeuse (800 g pendant 5 min), éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 3 ml de milieu de DM. </li><li> Re-cellules d&#39;une plaque (ou deux) 24-puits dans une matrice revêtue de 6 puits dans 3 ml de DM par puits (1: 5 expansion). </li><li> Développer pendant 1-2 semaines jusqu&#39;à ce que les cellules sont ~ 90% de confluence; une image d&#39;une culture pure entièrement différenciée est représenté sur la figure 3C. </li><li> Détacher les cellules avec 1 ml cellule dsolution issociation pendant environ 5-8 min à 37 ° C, l&#39;inactiver par dilution avec DM, utilisez 1000 pipette ul pour laver toutes les cellules, et les remettre en suspension. </li><li> Isoler (800 g pendant 5 min), éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 18 ml de milieu de DM. </li><li> Re-cellules de la plaque 6 puits une dans chaque matrice six puits revêtus 6 dans 3 ml de DM par puits (1: 6 expansion) ou revêtue d&#39;un ballon de 75 cm 2 (1: 7,5 expansion). </li><li> Répétez les étapes 3.4 à 3.8 que nécessaire jusqu&#39;à ce que suffisamment de cellules sont obtenues. REMARQUE: Essayez de recueillir autant de colonies que possible pour l&#39;expansion plutôt que de planifier pour amplifier les cultures via des passages depuis chaque passage induit RPE dédifférenciation. </li></ol>

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<li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+fibroblasts+into+retinal+pigment+epithelium-like+cells+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Protei.%2C+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human fibroblasts into retinal pigment epithelium-like cells by defined factors.</a> Protei., & Cell. 5 (1), 48-58 (2013).</li>
</ol>

Aucun des auteurs n’a de divulgation commerciale à déclarer.

Dans ce manuscrit, nous décrivons les étapes pour générer efficacement un grand nombre de cultures iPS-RPE pures. Nous avons montré précédemment en utilisant ce protocole de différenciation dirigée avec activine A que nous pouvons générer iPS-RPE qui ressemblent fortement hRPE basée sur la transcriptomique, protéomique, métabolomique et fonctionnalité, et qu&#39;ils retarder la dégénérescence rétinienne lorsqu&#39;ils sont implantés chez des rats RCS 12,31,32 . Le processus de génération iPS-RPE prend du temp...

Les différents types de cellules qui occupent la rétine sont organisés dans une architecture fonctionnelle. Les photorécepteurs à l’arrière de la rétine sont responsables de la conversion de la lumière en impulsions électriques par phototransduction. Cependant, la phototransduction ne peut se produire sans les efforts coordonnés d’autres types de cellules voisines, notamment la glie de Mueller et les cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Une monocouche de cellules EPR sépare la rétine sensorielle du choriocapillaire, la principale source d’approvisionnement en sang des photorécepteurs, et est idéalement située pour contrôler plusieurs fonctions importantes pour l’homéostasie des photorécepteurs. En fait, l’EPR et les photorécepteurs sont si codépendants qu’ils sont largement considérés comme une seule unité fonctionnelle. (Pour un examen de toutes les diverses fonctions de l’EPR, voir Strauss, 20051.) La mort ou le dysfonctionnement des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien peut induire la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), la principale cause de perte de vision permanente dans les pays industrialisés2-4. 
DMLA est une maladie multifactorielle de l’EPR, des photorécepteurs et de la vascularisation choroïdienne ; les facteurs de risque sont divers et comprennent des combinaisons d’influences environnementales et génétiques5,6. Les traitements de la DMLA sont très limités, mais une thérapie potentielle prometteuse est le remplacement des cellules EPR7,8. Bien que les résultats aient été mitigés, la transplantation de cellules EPR chez les patients atteints de DMLA (et chez d’autres patients atteints de dégénérescence rétinienne) ainsi que dans des modèles de dégénérescence rétinienne chez les rongeurs, a le potentiel de prévenir transitoirement une atrophie significative des photorécepteurs9-23. (Le modèle animal couramment utilisé pour ces études sont des rats du Royal College of Surgeons (RCS), qui hébergent une mutation du gène MerTK. Cette mutation rend les cellules EPR incapables de phagocytoser les segments externes des photorécepteurs et favorise la dégénérescence rétinienne24.) Bien que les taux de survie rapportés des EPR implantés dans l’espace sous-rétinien des rats et des souris RCS varient considérablement, il est possible qu’ils survivent pendant plusieurs mois ou années9,10,12,20. 
 cellules RPE peuvent être obtenues en nombre suffisant pour la transplantation en les dérivant de cellules souches pluripotentes9-14,25-28. Plusieurs groupes indépendants ont démontré que ces cellules fonctionnent de manière similaire à leurs homologues somatiques, et des études à long terme suggèrent qu’elles sont sûres lors de leur implantation dans des modèles de maladies chez le rat et la souris9,10,12,14,19,20,25,29-32. L’utilisation de cellules souches pluripotentes induites au lieu de cellules souches embryonnaires peut être avantageuse, car les problèmes éthiques et les défis immunologiques associés à l’EPR allogénique peuvent être évités33,34. Une autre application passionnante de la technologie iPS est la modélisation des maladies35. La capacité d’interroger un grand nombre de cellules EPR dérivées de patients atteints de maladies EPR pourrait être inestimable pour comprendre leurs bases moléculaires. Ce type d’étude a été réalisé récemment avec un patient atteint de la maladie de Best et pourrait ouvrir la voie à des études similaires sur les maculopathies héréditaires36. 
La dérivation de l’EPR à partir de cellules souches est un processus relativement simple et peut être réalisée entièrement dans des conditions exemptes de xéno. La stratégie la plus simple consiste à dériver spontanément des monocouches de cellules EPR, cependant, le rendement peut être considérablement amélioré en utilisant des techniques de différenciation dirigée. Mais ces techniques impliquent l’utilisation de facteurs protéiques exogènes qui peuvent être coûteux et souvent générés par des bactéries ou d’autres sources non humaines10,12,37. Dans nos études, nous avons suivi un protocoleétabli 10 qui utilise le nicotinamide et l’activine A, un facteur de signalisation qui s’est avéré suffisant pour la spécification de l’EPR38. Ici, nous démontrerons que la petite molécule IDE-1 peut remplacer adéquatement l’activine A, réduisant ainsi les coûts et atténuant les préoccupations associées à l’utilisation de protéines recombinantes39. De plus, nous utilisons un remplacement de sérum sans xéno, et nous cultivons les cellules RPE différenciatrices sur un substrat synthétique sans xéno. Il a été démontré précédemment que les cellules EPR se différencient très efficacement en utilisant cette approche40.
Lorsqu’elles sont différenciées en monocouche, nous visualisons des colonies pigmentées contenant des cellules EPR dès cinq semaines12. Une fois qu’ils atteignent une taille suffisante, ils peuvent être excisés manuellement et transférés dans une autre parabole pour l’expansion. Les cellules EPR sont connues pour se dédifférencier à chaque passage, et l’utilisation de tout ce qui a plus de cinq passages doit être évitée (nous constatons qu’un nombre suffisant de cellules pour la caractérisation et la transplantation dans des modèles animaux peut facilement être généré après deux ou trois passages). Une fois complètement différenciées, nous employons plusieurs techniques pour caractériser les cellules anatomiquement et fonctionnellement afin de nous assurer qu’elles serviront de substituts adéquats pour l’EPR malade. La description de ces techniques, et le protocole d’implantation de l’iPS-RPE dans l’espace sous-rétinien des rongeurs, dépassent le cadre de cet article méthodologique et ont déjà été publiés12,32,41. 
Bien que l’élaboration de protocoles standardisés pour une dérivation efficace de l’iPS-RPE soit clairement importante pour les cliniques, il reste également d’importants travaux précliniques à effectuer sur des modèles animaux. L’immunogénicité des cellules dérivées d’iPS suscite des inquiétudes, et plusieurs techniques d’implantation différentes, y compris l’implantation de cellules sur des substrats artificiels, sont à l’étude42,43. Pour ces raisons, nous pensons que la publication de protocoles standardisés est bénéfique pour faciliter les études cliniques et précliniques. Surtout si des comparaisons directes seront faites de cellules iPS-RPE dérivées dans différents laboratoires par différents groupes de recherche.

<table><tbody><tr><td>Couteau cornéen&nbsp ;</td><td>Surgipro</td><td>SPOI-070</td><td>couteau x 1</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>500 ml x 4&nbsp ;</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco’s, 1X sans Ca ou Mg</td><td>VWR</td><td>45000-434</td><td>500 ml x 6</td></tr><tr><td>Sérum fœtal de bovin, régulier (inactivé par la chaleur)</td><td>VWR</td><td>45000-736</td><td>500 ml x 1</td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0021</td><td>100 & micro ; g x 1</td></tr><tr><td>IDE-1</td><td>Stemgent</td><td>04-0026</td><td>2 mg x 1</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td>500 ml x 1&nbsp ;</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement Life</td><td>Technologies</td><td>10828-028</td><td>500 ml x 1</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>MEM Solution d’acides aminés non essentiels 100X&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td>100 g x 1</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-148</td><td>20 ml x 1</td></tr><tr><td>Activine A&nbsp ;</td><td>PeproTech</td><td>120-14E</td><td>10 & micro ; g x 2</td></tr><tr><td>Synthemax-T Surface 6 Puits Plaques</td><td>Corning</td><td>3877</td><td>Case(12) x 1</td></tr><tr><td>TrypLE-Express Enzyme (1X), sans rouge de phénol&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>12604-021</td><td>500 ml x 1&nbsp ;</td></tr><tr><td>Système de filtre à vide/bouteille de stockage, 0,1 & micro ; M Pore, 500ml&nbsp ;</td><td>Étui 431475 Corning</td><td></td><td>(12) x 1&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

dérivation efficace des cellules d&#39;épithélium pigmentaire de la rétine à partir de cellules souches

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Aucun remède n’a été découvert pour la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), la principale cause de perte de vision chez les personnes de plus de 55 ans. La DMLA est une maladie multifactorielle complexe dont l’étiologie est inconnue, bien que l’on pense généralement qu’elle survient en raison de la mort ou d’un dysfonctionnement de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), une monocouche de cellules qui sous-tend la rétine et fournit un soutien essentiel aux photorécepteurs. Les stratégies de remplacement des cellules EPR peuvent être très prometteuses pour apporter un soulagement thérapeutique à un large sous-ensemble de patients atteints de DMLA, et des cellules EPR qui ressemblent fortement aux cellules humaines primaires (hRPE) ont été générées dans plusieurs laboratoires indépendants, y compris le nôtre. De plus, les utilisations de l’iPS-RPE ne se limitent pas aux thérapies cellulaires, mais ont également été utilisées pour modéliser les maladies de l’EPR. Ces types d’études peuvent non seulement élucider les bases moléculaires des maladies, mais aussi servir d’outils inestimables pour le développement et l’essai de nouveaux médicaments. Nous présentons ici un protocole optimisé pour la différenciation dirigée de l’EPR à partir de cellules souches. L’ajout de nicotinamide et d’Activin A ou d’IDE-1, une petite molécule qui imite ses effets, à des moments précis, améliore considérablement le rendement des cellules EPR. En utilisant cette technique, nous pouvons dériver un grand nombre d’EPR à faible passage en aussi peu que trois mois.

Les étapes décrites dans ce manuscrit, comme représenté sur la figure 1, peuvent être utilisés pour générer facilement RPE partir de cellules souches tel que présenté antérieurement 10,12. Après avoir maintenu les lignes iPS pour plusieurs semaines, des colonies pigmentées commencent à apparaître dans les colonies après 5-7 semaines (7 semaines vieilles cultures sont présentées à la figure 2A-C). Ces colonies peuvent continuer à croître pendant des semaines que les cultures s...

Les cellules d’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de cellules souches peuvent être utilisées pour de multiples applications, notamment des thérapies cellulaires pour la dégénérescence rétinienne, la modélisation de maladies et des études de médicaments. Nous présentons ici un protocole simple pour dériver de manière reproductible l’EPR à partir de cellules souches.

Dérivation efficace des cellules d&#39;épithélium pigmentaire de la rétine à partir de cellules souches

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

L’objectif global de cette procédure est de dériver de manière reproductible un épithélium pigmentaire rétinien de haute qualité, ou EPR, à partir de cellules souches. Ceci est accompli en cultivant d’abord des cellules souches pluripotentes inductibles jusqu’à la co-fluidité. Dans la deuxième étape, le milieu est modifié pour diriger les cellules vers le destin de l’EPR.Ensuite, les cellules RPE sont isolées des autres cellules différenciées dans la boîte, puis les cultures sont développées jusqu’à ce qu’un nombre suffisant de cellules soit obtenu. En fin de compte, la pigmentation foncée et les morphologies pavées des cultures peuvent être utilisées pour confirmer que les cellules EPR atteignent la différenciation terminale. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la différenciation spontanée, est que l’ajout de facteurs définis accélère la différenciation, le temps et augmente le rendement de l’EPR.À ce jour, des milliers de rongeurs ont été guéris à l’aide de cellules EPR, dérivées de diverses maladies dégénératives rétiniennes IPSA. Cependant, si nous traduisons cela de manière efficace et efficiente dans le traitement des humains dans les cliniques avec ces maladies, il est absolument impératif que nous développions des protocoles reproductibles bien établis, qui nous fourniront une haute qualité, un nombre élevé de ventes de RPE et IPS La présentation visuelle de cette méthode est essentielle est qu’une seule personne peut travailler au microscope sous le capot à un moment donné, ce qui rend l’étape d’isolement difficile à visualiser. Mitchell Prince, un technicien de recherche de mon laboratoire, va maintenant faire la démonstration du protocole associé aux aspects de la culture numérique de la procédure Pour diriger la différenciation de la culture RPE dérivée de cellules souches, la lignée de cellules souches d’intérêt sur une couche de cellules nourricières embryonnaires de souris à deux fois 10 aux six cellules par puits d’une plaque à six puits, Laissez les colonies atteindre la fluidité Cof, puis passez à des alimentations quotidiennes avec différenciation.Milieu complété par du nicotinamide. Après trois semaines, commencez à ajouter des actifs dans un ou un IDE aux alimentations pour améliorer la différenciation de l’EPR. Deux semaines plus tard, revenez au milieu de différenciation et au nicotinamide seul, en arrêtant les tétées quotidiennes.Une fois que les indicateurs de pH du milieu cessent de jaunir le lendemain de l’alimentation, retournez la culture dans l’incubateur jusqu’à ce que des œillets de cellules pigmentées apparaissent et soient suffisamment gros pour être coupés et retirés. Pour isoler les œillets pigmentés, la couche suivante consiste à utiliser les puits d’une plaque de 24 puits avec une matrice sans xéno qui imite l’environnement cellulaire naturel. Ensuite, remplissez autant de puits de la plaque à 24 puits avec des milieux de différenciation que nécessaire.Et dans une hotte de culture cellulaire, utilisez une lunette de dissection et un scalpel pour hacher chaque œillet pigmenté au bas de la plaque d’origine en deux à six morceaux et saisissez les parties pigmentées avec une pince tranchante, puis transférez un à deux morceaux pigmentés dans chacun.24. Incubez bien la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant trois à cinq jours jusqu’à ce que les cellules adhèrent. Ensuite, commencez à changer de support trois fois par semaine.Développez les cellules pendant trois à quatre semaines dans le milieu de différenciation. Continuer à nourrir les cellules trois fois par semaine jusqu’au passage. L’EPR ajoute 200 microlitres de solution de dissociation cellulaire préchauffée non trypsine à 37 degrés Celsius pour détacher les cellules.Après cinq à huit minutes, arrêtez la réaction avec un milieu de différenciation frais, puis remettez les cultures en suspension dans des suspensions unicellulaires avec une pipette de 200 microlitres, en regroupant les colonies avec peu de cellules. Ensuite, transférez les colonies dissociées dans des tubes de 15 millilitres et faites tourner les cellules. Resus mettant en suspension les pastilles dans trois millilitres de milieu de différenciation transfère chacun les colonies dans chaque puits d’une plaque à six puits codée par matrice contenant trois millilitres supplémentaires de milieu de différenciation par puits.Ensuite, élargissez les cellules pendant une à deux semaines jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à environ 90 % et détachez à nouveau les cellules dans un millilitre de solution de dissociation comme nous venons de le démontrer. Cette heure. À l’aide d’une pipette de 1000 microlitres pour remettre les cellules en suspension, transférez la solution unicellulaire dans un tube conique de 50 millilitres.Et puis, après avoir fait tourner à nouveau les cellules, suspendez la pastille. En 18 millilitres de différenciation, le milieu remplit enfin les cellules dans un récipient de culture codé matricielle pour obtenir le nombre maximum de cellules souhaitées dans le nombre minimum de passages pour une analyse plus poussée en aval, les colonies pigmentées commencent à apparaître après cinq à sept semaines de culture de lignées de cellules souches pluripotentes inductibles. Ces colonies peuvent continuer à croître pendant des semaines pendant que les cultures sont maintenues.Une fois qu’ils ont atteint une taille suffisante, ils peuvent être excisés manuellement. L’excision soigneuse pour éviter la contamination par des cellules non EPR facilite grandement la génération de cultures EPR suffisamment pures. Une fois maîtrisés, un grand nombre de cellules EPR peuvent être dérivées en huit à 12 semaines si la technique est correctement exécutée.Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de ne pas contaminer les cultures lors de la fabrication des milieux et de l’alimentation des cellules. Après avoir regardé cette vidéo, nous espérons que beaucoup d’entre vous seront en mesure de produire un grand nombre de cellules RPE de haute qualité à partir d’IPS. Espérons que cela facilitera une traduction plus rapide du laboratoire au chevet du patient et offrira des thérapies cellulaires aux patients souffrant de maladies néovasculaires dégénératives rétiniennes actuellement incurables.

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Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Dans cette vidéo, nous allons démontrer comment isoler des cellules souches rétiniennes de l'épithélium ciliaire de l'oeil de la souris et les faire grandir dans la culture pour former clonale sphères de la rétine. Les sphères qui sont isolées possèdent les propriétés cardinales des cellules souches: l'auto-renouvellement et multipotentiality.

L&#39;isolement des cellules souches rétiniennes de l&#39;Oeil de la souris

Le profil des souches d'origine humaine pluripotentes (iPS), l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de l'homme induit-souches pluripotentes (iPS) (iPS-RPE), et RPE fœtale microARN (miARN), ont été comparés.

Profils MicroRNA d&#39;expression de cellules iPS humaines, l&#39;épithélium pigmentaire rétinien Derived From iPS, et fœtale épithélium pigmentaire rétinien

Nous présentons ici un protocole accepté par la communauté en format multimédia pour l’injection sous-rétinienne d’un bolus de cellules EPR chez le rat et la souris. Cette approche peut être utilisée pour déterminer les potentiels de sauvetage, les profils d’innocuité et les capacités de survie des cellules EPR greffées lors de l’implantation dans des modèles animaux de dégénérescence rétinienne.

Exécution sous-rétinienne injections chez les rongeurs de produire des cellules de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien Suspension

L'objectif de ce rapport est de décrire les protocoles de dériver l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPS) en utilisant différentes tailles de corps embryoïdes.

Découlant épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à partir de souches pluripotentes induites (iPS) de différentes tailles de corps embryoïdes

Ce protocole décrit comment produire les cellules épithéliales pigmentaire rétinien (EPR) de cellules souches pluripotentes. La méthode utilise une combinaison de facteurs de croissance et de petites molécules pour diriger la différenciation des cellules souches en RPE immature en quatorze jours et RPE mature et fonctionnel après trois mois.

Rapide, réalisée la différenciation des cellules épithéliales pigmentaire rétinien de cellules souches pluripotentes humaines embryonnaires ou induit

Nous présentons ici un protocole afin de différencier les cellules (pre) de l’épithélium pigmentaire rétinien des cellules souches pluripotentes humaines portant le patient dérivé des mutations. Les lignées de cellules mutantes peuvent servir pour des analyses fonctionnelles dont immunoblotting, immunofluorescence et patch clamp de. Cette approche de la maladie-dans-un-plat contourne la difficulté d’obtenir des cellules humaines natifs de RPE.

Différenciation, l’entretien et l’analyse des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien humain : un modèle de maladie-dans-un-plat pour les Mutations BEST1

Les auteurs décrivent une méthode pour un tissu rétinien composé de cellules épithéliales pigmentaire rétinien dérivés des cellules souches pluripotentes humaines cultivées sur le dessus des membranes amniotiques humaines et de sa préparation pour les greffes dans des modèles animaux de l’ingénieur.

Ingénierie de tissu d’épithélium pigmentaire rétinien Transplantation-convient dérivées de cellules souches embryonnaires humaines

Nous décrivons ici un système d’induction organoïde rétinienne optimisé, qui convient à diverses lignées de cellules souches pluripotentes humaines pour générer des tissus rétiniens avec une reproductibilité et une efficacité élevées.

Système d’induction organoïde rétinienne pour la dérivation de tissus rétiniens 3D à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Le primate non humain (PSN) est un modèle idéal pour étudier les thérapies cellulaires rétiniennes humaines en raison des similitudes anatomiques et génétiques. Ce manuscrit décrit une méthode de transplantation sous-maculaire de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dans l’œil NHP et des stratégies pour prévenir les complications peropératoires associées à la manipulation maculaire.

Transplantation d’épithélium pigmentaire rétinien dans un modèle de primate non humain pour les maladies dégénératives de la rétine

Cette étude fournit un protocole détaillé pour la cryoconservation efficace des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules souches humaines.

Cryoconservation de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules souches embryonnaires humaines au stade optimal

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) agit comme une barrière cruciale entre la choroïde et la rétine, favorisant la santé et la fonction des types de cellules rétiniennes, telles que les photorécepteurs. Nous décrivons ici un protocole simple et efficace pour isoler et cultiver l’EPR murin adulte.

Méthode simplifiée d’isolement et de culture de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes de souris adultes

Découvrez une méthode efficace pour dériver des cellules d'épithélium pigmentaire rétinien à partir de cellules souches pluripotentes induites. Ce protocole accélère la différenciation et augmente le rendement cellulaire pour la recherche en médecine régénérative.

Dérivation efficace des cellules d'épithélium pigmentaire de la rétine à partir de cellules souches

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