Imagerie intravitale de axonales Interactions avec microglie et les macrophages de souris dans une colonne dorsale Crush blessures

L’objectif général de cette procédure est d’observer le mouvement et l’interaction entre les microglies, les monocytes et d’autres types de cellules dans la moelle épinière blessée. Ceci est accompli en créant d’abord des souris chimères de moelle osseuse qui auront soit une microglie résidente, soit des macrophages dérivés de la moelle osseuse marqués avec un marqueur fluorescent. La deuxième étape consiste à produire une blessure par écrasement de la colonne dorsale dans la moelle épinière.

Ensuite, les animaux sont rouverts et la moelle épinière est stabilisée. Pour l’imagerie multiphotonique, l’étape finale consiste à prendre des images uniques ou des films en accéléré à l’intérieur de la lésion. En fin de compte, l’analyse des images montre le mouvement cellulaire et l’interaction cellulaire avec les substrats environnants. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux techniques traditionnelles, telles que la culture cellulaire et les tissus fixés, sont que les cellules peuvent être imagées dans leur environnement complexe naturel chez l’animal vivant.

Pour cette chirurgie, utilisez des animaux chimériques ou double transgéniques. Voir le protocole de texte sur la façon de marquer les cellules résidentes ou dérivées de la moelle osseuse après l’induction de l’anesthésie, maintenez-le avec un à 2 % de fluor ISO pour une fréquence respiratoire d’environ 60 à 100 respirations par minute. Maintenant, appliquez des pommades oculaires et confirmez un plan chirurgical d’anesthésie avec un pincement de l’orteil.

Préparez-vous à l’opération en rasant d’abord la zone ciblée de la moelle épinière, puis en essuyant la peau avec des gommages à la povidone iodée et à 70 % d’alcool, drapez l’animal et faites un trou pour accéder au site chirurgical. Ensuite, disposez les outils de l’autoclave sur un champ stérile. Cela comprend une pince numéro quatre qui est fixée à un millimètre entre les dents et a des marques à un millimètre des pointes.

Maintenant, on pourrait ouvrir la peau sur la ligne médiane à l’aide de ciseaux à iris, exposant la musculature. Procédez à la chirurgie sous un microscope à dissection. Le long de la ligne médiane, coupez les muscles du dos où ils s’attachent aux processus spinaux dorsaux dans le but d’exposer la colonne vertébrale.

Il s’agit de couper les trapèzes et les ligaments du grand dorsal. Ensuite, retirez les muscles rotateurs entre les apophyses transverses et l’apophyse dorsale pour révéler la lame de la vertèbre spécifique ciblée pour l’ablation. Ici, T 10 est exposé.

Procédez en insérant les pointes des jurés de l’OI dans l’espace au-dessus et en dessous du processus. Soulevez ensuite légèrement pour vous assurer que les pointes sont bien en place et pas trop profondes. Fermez ensuite les jurés RO pour retirer la lame.

Maintenant, retirez toutes les petites parties de la vertèbre restante, élargissant ainsi l’ouverture. À l’aide d’une aiguille de calibre 30, percez deux trous espacés d’un millimètre dans la dure-mère pour créer un point d’accès pour la pince fixe. Insérez ensuite la pince fixe à un angle de 90 degrés à travers la dure-mère, en gardant les marques sur les dents au-dessus de la dure-mère.

Maintenant, pincez et fermez la pince pendant 10 secondes. Appuyez deux fois de plus pendant dix secondes et retirez la pince. Ensuite, trempez un morceau de gélatine résorbable, une éponge compressée dans une solution saline et couvrez le site de la blessure avec.

Fermez le muscle sur l’éponge de gélatine à l’aide du numéro quatre, des sutures de course synthétiques non nylon. Utilisez ensuite des clips de bobinage de cinq millimètres pour fixer la peau. Complétez la procédure par une injection sous-cutanée de 10 microlitres de bupivacaïne dans 490 microlitres de solution saline pour un milligramme par kilogramme.

Injectez ensuite cinq microlitres de buprénorphine dans le muscle fessier pour 100 microgrammes par kilogramme. En postopératoire. Réchauffez l’animal et surveillez-le jusqu’à ce qu’il reprenne conscience. Pour rouvrir l’animal pour l’imagerie, induisez l’anesthésie comme précédemment, puis retirez les clips de plaie selon les instructions et les instructions du fabricant.

Si nécessaire, appliquez un produit dépilatoire sur la zone autour de l’incision. Cette fois, appliquez des gommages supplémentaires à la povidone iodée et à 70 % d’alcool. Maintenant, rouvrez la peau le long de l’incision précédente.

Retirez les sutures restantes et ouvrez les muscles avec une pince à l’aide de ciseaux au besoin. Sous le microscope à dissection, utilisez les ciseaux pour faire des poches pour les pinces de la moelle épinière le long des apophyses transversales sur la vertèbre, un niveau au-dessus de la laminectomie et un niveau en dessous de la laminectomie. Insérez les pinces du stabilisateur de la moelle épinière autour de chaque vertèbre et serrez les pinces.

Ajustez les pinces de manière à ce que la moelle épinière soit parallèle à la plate-forme d’imagerie et que le tissu soit stable. Si vous voyez un artefact respiratoire, ajustez les pinces pour minimiser le mouvement. Couvrez ensuite les pinces et la paraforme.

Ensuite, retirez délicatement la mousse de gel à l’aide d’une pince. Retirez autant que possible. De plus, enlevez tout tissu cicatriciel épais sur les méninges qui peut être présent.

Une fois que toute la mousse de gel est retirée, couvrez la moelle épinière avec une solution saline. Si un saignement est noté, utilisez une éponge de gélatine pour arrêter le saignement. Si nécessaire, utilisez la cautérisation pendant la cautérisation.

Veillez à ne pas toucher la moelle épinière et gardez-la recouverte de sérum physiologique et de mousse de gel. Créez maintenant un puits pour retenir le fluide d’immersion, scellez la peau et les tissus avec un adhésif cyanoacrylate. Ensuite, construisez un puits d’acrylique dentaire entre les deux pinces.

Laissez le temps au puits de durcir. Une fois durci, remplissez le puits de LCR artificiel. Continuez à surveiller les saignements pendant ces étapes.

À ce stade, injectez éventuellement des matrices fluorescentes dans la veine de la queue. Pour mettre en évidence les vaisseaux sanguins pendant l’imagerie, utilisez un brin DExT fluorescent au-dessus de 70 kilodaltons de points quantiques ou des lectines marquées par fluorescence. Pendant l’imagerie, maintenez la souris à 37 degrés Celsius dans un environnement contrôlé Sur la scène du microscope, les étapes les plus critiques pour une préparation réussie sont de s’assurer que la moelle épinière est propre, qu’elle ne saigne pas et qu’il n’y a pas d’artefact respiratoire visible.

Périodiquement pendant l’imagerie, vérifiez le niveau d’anesthésie en surveillant la respiration de l’animal, qui doit être comprise entre 60 et 100 respirations par minute. Corrigez l’anesthésie en ajustant les niveaux de fluor ISO. Après l’imagerie, renvoyez l’animal sur le site chirurgical, retirez les pinces vertébrales et retirez l’acrylique de la peau.

La souris peut alors être fermée pour une imagerie ultérieure à la fin de la chirurgie initiale ou être euthanasiée cinq jours après la blessure. Les sites d’insertion des forceps sont toujours visibles, mais la lésion a commencé à augmenter en taille en raison d’une blessure secondaire causée par l’inflammation. Les axones situés à l’extrémité de la lésion se sont rétractés du site initial de la lésion.

Parallèlement, un afflux important de cellules CX trois C un positif, soit des microglies ou des macrophages, peut être observé s’infiltrant dans et autour de la lésion d’écrasement pour discerner le comportement de ces cellules dans le microenvironnement de la lésion, un modèle de chimère de rayonnement a été utilisé en premier. Les cellules progénitrices de la moelle osseuse d’une souris CX trois CR une GFP positive ont été remplacées par des cellules donneuses non fluorescentes, de sorte que seule la microglie résidente du SNC positive à la GFP serait visible. Deuxièmement, les cellules progénitrices de la moelle osseuse d’une souris non fluorescente ont été remplacées par des cellules de moelle osseuse d’une souris CX trois CR et une GFP positive pour visualiser les cellules dérivées de la moelle osseuse.

Avant la blessure, les seules cellules positives à la GFP dérivées de la moelle osseuse détectées étaient en grande partie paravasculaires, qui ont été signalées comme étant continuellement remplacées à partir de la moelle osseuse après la blessure par écrasement. CX trois C une GFP positive sont augmentées le long de l’intérieur des vaisseaux sanguins entourant la lésion. De plus, le centre de la lésion était rempli de macrophages infiltrants CX trois CR et un GFP positif.

En utilisant cette technique, différents animaux transgéniques peuvent être utilisés afin de marquer d’autres populations de cellules fluorescentes afin d’identifier leurs interactions à la fois au sein de la moelle épinière et dans d’autres modèles de maladies.