Name: Mesure de la dégradation de lARNm Tarifs en Saccharomyces cerevisiae Utilisation Rpb1-1 Les souches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Découvrez comment mesurer les taux de dégradation de l'ARNm chez Saccharomyces cerevisiae en utilisant des souches Rpb1-1 sensibles à la température. Cette méthode par hybridation Northern permet d'étudier la stabilité des ARNm et la régulation de l'expression génique.

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La recherche dans le laboratoire de l’auteur est soutenue par le programme de recherche avancée Norman Hackerman du Texas Higher Education Coordinating Board et des fonds de démarrage de l’Université Baylor.

1. Croissance de cellules de levure <ol><li> Sélectionner des souches de levure appropriées pour être utilisées pour les mesures de taux d&#39;ARNm de la pourriture. Pour inhiber la transcription en utilisant l&#39;allèle sensible de l&#39;ARN polymérase II de température, utiliser des souches de levure abritant la mutation rpb1-1 1. Obtenir cette souche de levure à partir d&#39;un laboratoire qui a déjà une, ou le générer en laboratoire en utilisant des techniques standard si un contexte génétique spécifique est requise 9. </li><li> Utilisant une technique stérile, préparer des milieux de levure utilisant des procédures standard 10. Si aucune sélection ne est nécessaire, préparer des milieux riches tels que YPD. En variante, la préparation des milieux sélectifs si les cellules de levure sont transformées par des plasmides et la sélection est requise. Autoclave les médias. </li><li> Cultiver les cellules de levure à 28 ° C, qui est la température permissive pour cette souche de levure. Pour ce faire, en deux étapes: <ol><li> Pour la première O / N, croître les cellules de levure dans 5 ml de milieu de croissance à saturation.</li><li> Mettre en place le deuxième O / N à la fin du deuxième jour. Pour la deuxième O / N, inoculer des quantités différentes de cellules de levure à partir de la première O / N dans 100 à 150 ml de milieu de croissance (allant de 100 ul à 1 ml, 2 ml ou plus, selon le moment où les cellules de levure doivent être récolté le jour suivant). Effectuez cette opération pour se assurer que l&#39;une des cultures est à la bonne OD 600 le lendemain. </li></ol></li></ol> 2. récolter les cellules de levure <ol><li> Préparation pour récolter les cellules de levure. Le calendrier de cette étape est critique; étiqueter tous les tubes nécessaires et de rassembler tout l&#39;équipement et les matériaux requis en un seul endroit. Préchauffer un bain d&#39;eau à 39 ° C et préchauffer 15 deux tubes à essai ml de milieu de croissance à 28 ° C et à 60 ° C. REMARQUE: Le volume de support 15 ml de la croissance peut varier en fonction du nombre de points dans le temps les cellules doivent être récoltées. </li><li> Récolter les cellules de levure lorsqu&#39;ils atteignent une DO 600 de 0,4 à 0,7. Transfer les cellules à 4 - 6 ml stériles 50 bouteilles à bouchon à vis. Centrifuger à 7500 xg dans une centrifugeuse à haute vitesse pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension les boulettes dans les médias 15 ml de croissance qui a été équilibrage à 28 ° C. Regrouper les cellules de levure dans une fiole de 250 ml stérile et pour équilibrer les ~ 5 min à la température de croissance de 28 ° C. </li><li> Après que les cellules de levure avoir équilibré à la température de croissance, ajouter immédiatement les 15 ml du milieu de croissance équilibrée à 60 ° C pour élever la température à 39 ° C (la température non permissive) et placer immédiatement la fiole dans le bain d&#39;eau à 39 ° . Assurez-vous que le milieu de culture reste dans le bain-marie de 39 ° tout au long des étapes restantes de récolte des cellules afin de se assurer que la transcription est éteint. </li><li> Récolter les cellules à différents moments après avoir placé le ballon dans le bain d&#39;eau 39 C °. Pour le premier point de temps, récolter les cellules immédiatement après plaçant le ballon à 39 ans &amp; #176; C. Récolter un 3 ml aliquote et distribuer le 3 ml en deux, 1,5 ml microtubes. Pellet les cellules pendant 10 secondes dans une mini centrifugeuse ou picofuge avec une décélération rapide et verser le surnageant. </li><li> Geler immédiatement le culot dans un bain de glace carbonique / éthanol ou dans l&#39;azote liquide. Désignez le premier point, les cellules sont récoltées à comme point de temps zéro de temps. </li><li> Expérimentalement déterminer les points dans le temps, les cellules sont récoltées à la suite d&#39;une expérience pilote, en fonction des ARNm d&#39;intérêt. Normalement, les cellules de levure récolte aux points de temps suivants: 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 et 35 min (figure 2B). Si la demi-vie de l&#39;ARNm ne peut pas être déterminée en utilisant les points de temps mentionnées ci-dessus, ajuster ces points dans le temps. Par exemple, pour ARNm avec des demi-vies courtes prévues, utiliser plus courtes fois des points, (ce est à dire, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 et 18 min) et pour ARNm avec longues demi-vies prévues, prolonger les points de temps. </li><li> Après que les cellules sont harvested, rangez-les dans un congélateur à -80 ° C jusqu&#39;à l&#39;extraction de l&#39;ARN est réalisée. </li></ol> 3. Extraire l&#39;ARN à partir des cellules de levure <ol><li> Pour la partie d&#39;extraction d&#39;ARN du protocole, utilisez RNase techniques gratuits à prévenir la dégradation de l&#39;ARN par RNases. Préparer RNase solutions libres, la verrerie et les articles en plastique à être utilisés dans l&#39;extraction de l&#39;ARN. </li><li> Extraire l&#39;ARN à partir de cellules de levure selon des protocoles standards. Typiquement, utiliser la méthode de phénol chaud 12. En variante, en utilisant des kits qui peuvent être utilisés pour extraire l&#39;ARN à partir de cellules de levure. </li><li> Déterminer la quantité et la pureté de l&#39;ARN, habituellement par mesure de l&#39;absorbance à 260 A et 280 A de 2 ul d&#39;ARN en utilisant une Nanodrop. Déterminer la concentration de l&#39;ARN à partir de l&#39;A 260. Sur la base de la concentration, diluer l&#39;ARN à 1 ug / ul d&#39;eau traitée au DEPC à l&#39;aide. NOTE: Le rapport de la A 260 / A 280 fournit des informations sur les til pureté de l&#39;ARN. Un échantillon d&#39;ARN est pur si le rapport A 260 / A 280 est de 2,0 ± 0,1. </li></ol> 4. Analyse Northern Blot REMARQUE: Utilisez des transferts de Northern pour quantifier les niveaux d&#39;ARNm et obtenir des informations sur la taille des transcriptions. En outre, utiliser des transferts de Northern pour détecter ARNm qui produisent des isoformes multiples de la même ARNm. <ol><li> Préparation d&#39;un gel d&#39;agarose-formaldéhyde à 1,0%. Exécutez des quantités égales de l&#39;ARN de l&#39;échantillon sur le gel de formaldéhyde agarose par électrophorèse selon des protocoles standard 12. Exécuter une échelle d&#39;ARN à côté des échantillons d&#39;ARN et l&#39;utiliser pour déterminer la taille de l&#39;ARN qui sont détectés sur le transfert de Northern. Avant de transférer l&#39;ARN séparé sur gel d&#39;agarose-formaldéhyde à une membrane, couper la voie à l&#39;échelle de l&#39;ARN à partir du gel et de visualiser en utilisant du bromure d&#39;éthidium. NOTE: En variante, l&#39;ensemble du gel peut être coloré avec du bromure d&#39;éthidium avant le transfert de l&#39;ARN. </li><li> Unéchantillons près la ARN ont migré vers une distance appropriée sur le gel, transférer l&#39;ARN à une membrane en utilisant des techniques gratuits RNase. Utilisez l&#39;une des plusieurs protocoles disponibles pour transférer ARN aux membranes 12-13. Pour transférer l&#39;ARN à une membrane, la membrane à couper à peu près la même taille que le gel. Transfert de l&#39;ARN selon des protocoles standards 12. </li><li> UV réticuler les ARN sur la membrane en utilisant un agent de réticulation aux UV suivant les instructions du fabricant. Sinon, faire cuire la membrane dans un four réglé à 80 ° C pendant 1 heure. Stocker la membrane à -20 ° C dans un sac plastique indéfiniment jusqu&#39;à ce qu&#39;elle soit hybridée à des sondes spécifiques. NOTE: La membrane sèche peut aussi être stockée à température ambiante entre papiers filtres. </li></ol> 5. hybrident sondes complémentaires à l&#39;ARN d&#39;intérêt à la membrane REMARQUE: Un moyen de détecter l&#39;ARNm de la membrane est d&#39;hybrider des sondes d&#39;ADN marquées de 32 p. ATTENTION: Researchers travaillant avec 32 P ont besoin d&#39;utiliser des procédures de protection pour éviter la contamination. Suivez les directives institutionnelles sur l&#39;utilisation de matières radioactives. <ol><li> Préparation de la sonde d&#39;ADN par marquage de 25 à 50 ng de l&#39;ADN à hybrider à la membrane selon des protocoles standards 12. Générer le fragment d&#39;ADN par PCR ou digestion du plasmide. Déterminer l&#39;activité spécifique de la sonde d&#39;ADN en comptant 1 ul de la sonde d&#39;ADN radiomarquée après les nucleotides non incorporés sont éliminés 12. </li><li> Préchauffer le tampon de préhybridation / hybridation à 42 ° C. Utilisation ~ 10 ml du tampon de préhybridation / hybridation par 100 cm 2 de la membrane 12. </li><li> Hybrider 1-5 x 10 6 cpm de sonde d&#39;ADN radiomarquée par ml de tampon d&#39;hybridation à la membrane O / N dans un four d&#39;hybridation pour détecter l&#39;ARNm d&#39;intérêt 12. Assurez-vous que lors de l&#39;hybridation de la rotation du four est de l&#39;hybridation dans une direction quiprovoque la totalité de la membrane à être exposée à la solution d&#39;hybridation, pour assurer une hybridation appropriée. </li><li> Laver la membrane deux fois à température ambiante pendant 15 min avec 50 ml de SSPE 2x et une heure à 65 ° C avec 50 ml de SSPE 2x / 2% de SDS pendant 15 minutes 12. Enveloppez la membrane dans une pellicule plastique pour se assurer qu&#39;il ne se dessèche pas ou contaminer l&#39;écran de phosphore. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un compteur Geiger, estimer l&#39;intensité de la radioactivité sur la membrane. NOTE: Cette estimation se assure que la membrane est exposée à l&#39;écran de phosphore pour le laps de temps approprié. Utilisez des temps plus longs d&#39;exposition pour les membranes avec de faibles quantités de radioactivité. </li><li> Pour des transferts de Northern, utiliser un contrôle de chargement pour confirmer que des quantités égales d&#39;ARN sont chargées sur chaque spot. Pour ce faire, enlever la membrane et reprobe avec un ARN qui ne est pas affectée par le processus en cours d&#39;examen. Bande de la membrane en la plaçant dans un plateau en verre contenant 200 ml de solution d&#39;extraction bouillante (0,1% SDS / 0,01 XSSC) pendant 2 min. Verser la solution de décapage et répétez la procédure cinq fois 12. NOTE:. Un exemple d&#39;un ARN utilisé comme témoin de chargement est SCR1 SCR1 est une transcription ARN polymérase III qui est stable et abondante SCR1 ARN abondance ne devrait pas changer de façon significative pendant de courtes périodes de l&#39;ARN polymérase II d&#39;inhibition.. </li></ol> 6. Quantifier l&#39;ARN qui est lié à la membrane NOTE: Pour quantifier la quantité de radioactivité sur la membrane, la membrane exposer à un écran de phosphore. Après le temps d&#39;exposition approprié, balayer l&#39;écran de phosphore en utilisant un phosphorimager. <ol><li> Balayez l&#39;écran phosphore en suivant les instructions fournies par le fabricant de la phosphorimager. </li><li> Quantifier l&#39;ARNm à chaque point de temps. Quantifier les niveaux d&#39;ARNm en utilisant le logiciel ImageQuant ou logiciel associé. Normaliser l&#39;ARNm à chaque point de contrôle de chargement de temps. Si SCR1 a été utilisé comme le chargementle contrôle, à normaliser les northerns demi-vie à SCR1. </li><li> La demi-vie de l&#39;ARNm est calculé en divisant la quantité d&#39;ARNm restant à chaque point de temps par la quantité d&#39;ARNm présente au point de temps 0 (le point de temps initial). Graphiquement la ARNm pour cent restants en fonction du temps sur un terrain semi-logarithmique (figure 2C). Calculer la demi-vie d&#39;ARNm par l&#39;équation suivante: t 1/2 = -0,693 / k (négative 0,693) </li><li> k est la pente de la droite de meilleur ajustement et t 1/2 est la demi-vie de l&#39;ARNm. </li></ol>

<ol><li>Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+RNA+polymerase+conditional+mutant+that+rapidly+ceases+mRNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).</li>
<li>Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+mRNA+stability+and+length+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).</li>
<li>Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mode+of+action+of+thiolutin%2C+an+inhibitor+of+macromolecular+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 Forthcoming.</li>
<li>Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Comparison+of+stable+and+unstable+mRNAs+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 Forthcoming.</li>
<li>Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Analysis+of+mRNA+Stability+Using+Transcription+Inhibitors+and+Microarrays+Reveals+Postranscriptional+Control+of+Ribosome+Biogenesis+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors.</a> Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).</li>
<li>Tani, H., Akimitsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+technology+for+determining+RNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells.</a> RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).</li>
<li>Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+inhibitor+thiolutin+blocks+mRNA+degradation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast.</a> Yeast. 25, 85-92 (2008).</li>
<li>Kervestin, S., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMD%3A+a+multifaceted+response+to+premature+translational+termination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">NMD: a multifaceted response to premature translational termination.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).</li>
<li>Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Polymerase+II+subunit+composition%2C+stoichiometry+and+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation.</a> Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).</li>
<li>Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , John Wiley and Sons, Inc.. (1998).</li>
<li>Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+affects+relative+nonsense+mRNA+accumulation+in+wild-type+and+upf+mutant+yeast+strains+Current+Genetics%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics).</a> 43, 171-177 (2003).</li>
<li>Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Nonsense-Mediated+mRNA+Decay+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae.</a> Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).</li>
<li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+mRNA+Decay+Rate+in+Saccharomycescerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêt financier concurrent.

L&#39;inhibition de la synthèse de l&#39;ARNm et de surveillance chiffre d&#39;affaires de l&#39;ARNm en l&#39;absence de nouvelle synthèse est une méthode qui est fréquemment utilisé pour mesurer ARNm taux de décroissance. Dans S. cerevisiae, la mesure du taux de décroissance de l&#39;ARNm en empêchant la transcription de l&#39;allèle sensible à l&#39;aide de l&#39;ARN polymérase II de la température est une des méthodes les plus fréquemment utilisés. Ce procédé inhibe spécifiquement l&#39;ARN polymerase II. L...

La transcription et la décadence de l&#39;ARNm spécifiques sont déterminants cruciaux de l&#39;expression des gènes. Le taux de la synthèse et la décomposition des ARNm spécifiques détermine le niveau de cette ARNm particulier l&#39;état d&#39;équilibre. Les niveaux de l&#39;état d&#39;équilibre des ARNm régissent l&#39;abondance d&#39;ARNm et de déterminer combien de chaque ARNm est disponible pour la synthèse des protéines. Mesures de ARNm demi-vies sont largement utilisés pour déterminer le taux d&#39;ARNm de décroissance. ARNm spécifique désintégration à des vitesses différentes qui sont liées aux caractéristiques de l&#39;ARNm, la fonction de la protéine codée par l&#39;ARNm et les conditions environnementales. Selon la technique utilisée pour déterminer les taux de NMD, les mesures de taux désintégration peuvent être déterminés soit globalement ou pour transcriptions des entretiens individuels. Dans la levure S. cerevisiae, les techniques les plus couramment utilisés pour mesurer les taux de NMD globale comprennent l&#39;utilisation d&#39;une souche de levure hébergeant l&#39;allèle sensible de l&#39;ARN polymérase II et transc chimique températureinhibiteurs riptional tels que thiolutine et 1,10-phénanthroline 1-5. Ces méthodes peuvent également être utilisés pour mesurer les taux de NMD individuelle 4. D&#39;autres méthodes peuvent également être utilisés pour mesurer les taux d&#39;ARNm de désintégration. Ces méthodes comprennent approche de l&#39;étiquetage de l&#39;état d&#39;équilibre ou de l&#39;utilisation de molécules d&#39;ARNm qui sont exprimés à partir d&#39;un promoteur régulé qui est exprimé uniquement dans certaines conditions. Chacune de ces techniques a des avantages et des limites. La technique décrite ici utilise l&#39;allèle sensible de l&#39;ARN polymérase II de la température. Cette méthode utilise S. cerevisiae comme modèle, mais peut être modifiée et utilisée dans d&#39;autres systèmes utilisant des techniques d&#39;inhibition de la transcription spécifiques 6. ARNm mesures demi-vie en utilisant l&#39;allèle sensible de l&#39;ARN polymérase II de température sont largement utilisés pour les deux mesures de l&#39;ensemble du génome et individuels de la dégradation des ARNm 4-5. Cette technique nécessite l&#39;utilisation d&#39;un spécific souche de levure qui abrite un allèle sensible de l&#39;ARN polymérase II, de rpb1-1 une température. La justification de cette technique est que l&#39;exposition de la souche de levure sensible de la température à la température non permissive inhibe la synthèse de l&#39;ARNm. Par la suite, la décomposition de l&#39;ARNm pré-existante est contrôlée à différents points de temps après la transcription a été inhibée. La disparition de l&#39;ARNm pré-existante est contrôlée par extraction de l&#39;ARN à partir des cellules de levure à différents points dans le temps après la transcription a été coupé. Les points de temps au cours de laquelle les cellules de levure sont récoltées sont prédéterminés par une expérience pilote, et dépendent des transcriptions et le système à l&#39;étude. Points de temps plus rapides sont utilisés pour les transcriptions de courte durée, tandis que les points de temps plus longues sont utilisées pour les transcriptions plus vécu. Par la suite, la décomposition de l&#39;ARNm est contrôlée soit par analyse Northern blot, la PCR quantitative ou RNAseq. Mesure de la demi-vie d&#39;ARNm en utilisant un température allèle sensible de l&#39;ARN polymérase II a ses avantages. Tout d&#39;abord, cette technique est facile et simple. Deuxièmement, une fois la souche de levure est acquis ou généré en laboratoire les ARNm mesures demi-vie peuvent être déterminées dans différentes conditions de croissance; permettant de déterminer l&#39;influence de l&#39;environnement sur la dégradation de l&#39;ARNm. Troisièmement, les taux d&#39;ARNm de désintégration peuvent être surveillés échelle du génome. L&#39;utilisation d&#39;autres techniques d&#39;inhibition de la transcription a aussi des avantages et des inconvénients. Par exemple, l&#39;utilisation d&#39;un promoteur inductible nécessite le sous-clonage pour générer un ARNm qui est sous le contrôle du promoteur régulé. Thiolutine ne est pas facilement disponible et est coûteux lorsqu&#39;ils sont disponibles. En outre, le mode d&#39;action de thiolutine ne est pas complètement comprise et il a été rapporté pour affecter d&#39;autres processus cellulaires, y compris l&#39;inhibition de la dégradation des ARNm 7. Alternativement, la 1,10-phénanthroline, est plus facilement disponible. En outre, toutes les techniques utilisées pour inhiber la transcription peut perturb fonction cellulaire et peut affecter différents ARNm de façons distinctes. Un enquêteur doit déterminer la méthode la plus appropriée à utiliser dans leurs conditions expérimentales pour obtenir des résultats les plus fiables. Pour déterminer quelle méthode est la plus appropriée pour leur application, un chercheur doit identifier les transcriptions et la fonction des protéines codées par les transcriptions objet d&#39;une enquête. Les mesures les plus fiables des taux d&#39;ARNm de décroissance sont ceux qui sont déterminés en utilisant plusieurs techniques et de montrer le même taux de décroissance. Aucune technique ne est toujours la meilleure, et la technique la plus appropriée dépend de la situation spécifique. De nombreuses études dans S. cerevisiae ont mesuré les taux de NMD dans diverses conditions et origines génétiques. Les conditions que les taux d&#39;ARNm de désintégration sont mesurées en dépendent l&#39;expérience spécifique à l&#39;étude. Mesure ARNm taux de décomposition dans des environnements cellulaires différents détermine si les conditions étanta examiné préférentiellement affecter les taux d&#39;ARNm spécifiques de désintégration. Les taux d&#39;ARNm de désintégration peuvent également varier en fonction de la souche de levure utilisée. Par exemple, ARNm taux de décomposition peuvent être déterminées dans les cellules de levure de type sauvage et des cellules de levure avec une voie non fonctionnel dégradation de l&#39;ARNm de nonsense-mediated (NMD). Cette voie de dégradation de l&#39;ARNm se trouve dans tous les organismes eucaryotes qui ont été examinés à ce jour et il déclenche la dégradation des ARNm qui se terminent prématurément traduction 8. NMD a été initialement identifiée comme une voie qui dégrade ARNm avec des codons de terminaison prématurés ou codons non-sens, mais est maintenant reconnue comme une voie qui réglemente également l&#39;expression de non-nonsense contenant ARNm naturelles. ARNm qui sont des cibles de la voie sont rapidement dégradées dans les cellules de levure avec une voie de NMD fonctionnel et stabilisées dans des cellules de levure avec une voie de NMD non fonctionnel. Ainsi, les demi-vies d&#39;ARNm qui sont des cibles directes de cette voie sont plus courts en levure de type sauvage cells rapport aux cellules de levure avec une voie NMD non fonctionnel.

<table><tbody><tr><td>Centrifugeuse à grande vitesse</td><td>Eppendorf</td><td>22628169</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrifugeuse</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>Membrane Genescreen Plus</td><td>PerkinElmer</td><td>50-905-0169</td><td></td></tr><tr><td>Four d’hybridation</td><td>Fisher Scientific</td><td>95-0030-01</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-8000</td><td></td></tr><tr><td>Écran au phosphore</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9564-78</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon phosphorimager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29004080</td><td></td></tr><tr><td>réticulant UV</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>80-6222-31</td><td>Alternativement, la membrane peut être cuite dans un four réglé à 80&deg ; pendant 1 heure</td></tr><tr><td>Tampon de préhybridation/hybridation NorthernMax&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>AM8677</td><td></td></tr><tr><td>Souches de levure porteuses de la mutation</td><td></td> rpb1-1 <td>Les souches de levure peuvent être obtenues à partir d’un laboratoire ou créées avec un contexte</td><td></td> spécifique</tr></tbody></table>

mesure de la dégradation de l&#39;arnm tarifs en<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em&gt; utilisation<em&gt; rpb1-1</em&gt; les souches

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

les niveaux de l&#39;état d&#39;équilibre ARNm varient en fonction des conditions environnementales. La régulation des niveaux d&#39;accumulation de l&#39;état d&#39;équilibre de l&#39;ARNm de sorte que la quantité correcte de protéine est synthétisée dans des conditions de croissance spécifiques de la cellule. Une approche pour mesurer ARNm taux de décroissance est l&#39;inhibition de la transcription et de suivi suite à la disparition de l&#39;ARNm déjà présent. Le taux de dégradation de l&#39;ARNm peut alors être quantifiée, et une demi-vie précise peut être déterminée en utilisant plusieurs techniques. Dans S. cerevisiae, des protocoles permettant de mesurer la demi-vie de l&#39;ARNm ont été développés et comprennent l&#39;inhibition de la transcription de l&#39;ARNm en utilisant des souches abritant un allele sensible de l&#39;ARN polymerase II, de rpb1-1 température. D&#39;autres techniques de mesure de demi-vie de l&#39;ARNm comprennent des inhibiteurs de la transcription de la transcription tels que thiolutine ou 1,10-phénanthroline, ou en variante, en utilisant des inhibiteurs de ARNm qui sont sous le contrôle d&#39;un promoteur régulabletel que le promoteur inductible par le galactose et le système TET-off. Ici, nous décrivons la mesure de S. taux de décroissance cerevisiae ARNm en utilisant l&#39;allèle sensible de l&#39;ARN polymérase II de température. Cette technique peut être utilisée pour mesurer les taux d&#39;ARNm des ARNm individuels ou l&#39;ensemble du génome désintégration.

<html> La capacité de ce protocole pour mesurer avec précision ARNm taux de décroissance dépend de l&#39;inhibition de la transcription, la récolte de cellules de levure au niveau des points de temps appropriés, et l&#39;utilisation des techniques sans RNase lors de l&#39;extraction de l&#39;ARN et transfert de Northern. Palpage de deux ARNm de commande connus pour être instables et stables, respectivement, fournit l&#39;assurance que l&#39;expérience a fonctionné. Par exemple, ceci peut être accompli par sondage avec un...

Le niveau de l&#39;état d&#39;équilibre des ARNm spécifiques est déterminée par le taux de synthèse et de la décomposition de l&#39;ARNm. Taux de dégradation de l&#39;ARNm pangénomiques ou les taux d&#39;ARNm spécifiques de désintégration peuvent être mesurés en déterminant ARNm demi-vies. Ce protocole met l&#39;accent sur ​​la mesure du taux d&#39;ARNm de désintégration dans Saccharomyces cerevisiae.

Mesure de la dégradation de l&#39;ARNm Tarifs en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Utilisation<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Les souches

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

L’objectif global de l’expérience suivante est de mesurer les taux de désintégration de l’ARNm chez la levure Saccharomyces visi. Ceci est accompli en cultivant d’abord des cellules de levure pour loger la phase à la température permissive. Ensuite, les cellules sont déplacées à une température plus élevée dans laquelle la synthèse totale de l’ARNm est inhibée.Les échantillons de levure sont ensuite récoltés à des moments prédéterminés pour chaque échantillon. L’ARN total est extrait, séparé par électrophorèse sur gel, et transféré dans une membrane. Enfin, l’hybridation nord est effectuée pour déterminer tout changement dans les niveaux d’ARNm en fonction du temps.En fin de compte, ce protocole peut être utilisé pour mesurer les taux de désintégration de l’ARNm d’ARNm individuels ou à l’échelle du génome dans différentes conditions de croissance. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la désintégration de l’ARN, telles que les taux de désintégration de l’ARN OD varient selon les conditions cellulaires et les antécédents génétiques. Megan Pelli, une étudiante diplômée de mon laboratoire, fera la démonstration de cette procédure.Pour commencer, p

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L'ARN cellulaire total donne un mauvais modèle pour l'étude des changements à court terme dans la synthèse d'ARN et de la décomposition ainsi que les cinétiques de maturation de l'ARN. Ici, nous décrivons marquage métabolique des ARN transcrits récemment avec 4 thiouridine suivie par biotinylation et purification thiol-spécifique des ARN transcrits nouvellement permettant de surmonter ces limitations.

Marquage métabolique de l&#39;ARN récemment transcrits pour une grande résolution profil d&#39;expression génique de l&#39;ARN de synthèse, le traitement et Decay en culture cellulaire

Les taux de mutation chez les jeunes Saccharomyces cerevisiae cellules mesurées par des tests de fluctuation sont utilisés pour prédire la fréquence des mutations de cellules mères de différents âges de réplication. Tri magnétique et la cytométrie en flux est ensuite utilisé pour mesurer la fréquence des mutations réelles et l'âge des cellules mères afin d'identifier les écarts par rapport à la fréquence des mutations prévues.

La combinaison de tri magnétique des cellules mères et Tests de fluctuation à Analyser instabilité du génome cours mitotique vieillissement cellulaire dans Saccharomyces cerevisiae

Nous décrivons ici un test biologique robuste pour quantifier le taux relatif de protéolyse par le système ubiquitine-protéasome. La lecture du test est le taux de croissance de la levure en culture liquide, qui dépend des niveaux cellulaires d’une protéine rapporteure comprenant un signal de dégradation fusionné à un marqueur métabolique essentiel.

Croissance dosage à base de Reporter-une analyse systématique de la dégradation des protéines

Nous présentons ici un protocole utilisant RNA-seq pour surveiller les niveaux d’ARNm au fil du temps au cours de la réponse à l’hypoxie des cellules de S. cerevisiae . Cette méthode peut être adaptée pour analyser l’expression des gènes au cours de toute réaction cellulaire.

Mesurer les niveaux d’ARNm au fil du temps au cours de la levure s. cerevisiae réponse à l’hypoxie

Les auteurs décrivent un protocole pour générer la prolifération et quiescentes fibroblastes dermiques humains primaires, surveillance des taux de décomposition de transcription et d’identifier les gènes différentiellement en décomposition.

Déterminer le taux de décroissance de Genome-wide transcription dans les fibroblastes humains proliférantes et repos

Régulation traductionnelle joue un rôle important dans le contrôle de l’abondance de la protéine. Nous décrivons ici une méthode de haut débit pour l’analyse quantitative de la traduction dans la levure Saccharomyces cerevisiae.

Genome-wide Quantification de la traduction dans la levure de bière par Ribosome profilage

Le protocole décrit ici est basé sur la quantification de Génome-large d’ARNm nouvellement synthétisées purifiée à partir de cellules de levure marquées avec 4-thio-uracile. Cette méthode permet de mesurer la synthèse d’ARNm dételée de désintégration de l’ARNm et, par conséquent, donne une mesure précise de la transcription de l’ARN polymérase II.

Saccharomyces cerevisiae Métabolique marquage avec 4-thio-uracile et la Quantification des nouvellement synthétisé ARNm comme un Proxy pour l’activité de l’ARN polymérase II

Ribonucléotides sont parmi les plus abondantes nucléotides non-canoniques incorporés dans le génome au cours de la réplication de l’ADN nucléaire eucaryote. Si pas correctement supprimé, ribonucléotides peuvent provoquer de mutagenèse et dommages à l’ADN. Nous présentons ici deux approches expérimentales qui sont utilisés pour évaluer l’abondance de l’incorporation de ribonucléotide dans l’ADN et de ses effets mutagènes.

Incorporation de ribonucléotide Experimentation : Strand spécifiques détection des ribonucléotides dans le génome de la levure et mutagénèse induite par la ribonucléotide de mesure

La réticulation cinétique et l’analyse de l’ADNc est une méthode qui permet d’étudier la dynamique des interactions protéine-ARN dans les cellules vivantes à haute résolution temporelle. Ici, le protocole est décrit en détail, y compris la croissance des cellules de levure, la réticulation UV, la récolte, la purification des protéines et les étapes de préparation de la bibliothèque de séquençage de nouvelle génération.

Surveillance de la dynamique d’interaction protéine-ARN in vivo à haute résolution temporelle à l’aide de χCRAC

Ici, nous introduisons et décrivons une méthode non radioactive et non invasive pour évaluer la synthèse de la protéine de novo in vivo, en utilisant le nématode Caenorhabditis elegans et la récupération de fluorescence après photobleaching (FRAP). Cette méthode peut être combinée avec des écrans génétiques et/ou pharmacologiques pour identifier de nouveaux modulateurs de synthèse protéique.

Évaluation des taux de synthèse des protéines de novo à Caenorhabditis elegans

Ce protocole mesure quantitativement la stabilité et la demi-vie des ARN amplificateurs intergéniques et intragéniques dans les cellules souches embryonnaires de souris grâce au traitement à l’Actinomycine D, RT-qPCR et analyse de régression non linéaire. Des stratégies de normalisation spécifiques à la position sont intégrées pour modéliser avec précision la dynamique de désintégration de l’ARNe, de manière dépendante du contexte.

Évaluation quantitative optimisée de la stabilité de l’ARN d’amélioration dans les cellules souches embryonnaires de souris

Découvrez comment mesurer les taux de dégradation de l'ARNm chez Saccharomyces cerevisiae en utilisant des souches Rpb1-1 sensibles à la température. Cette méthode par hybridation Northern permet d'étudier la stabilité des ARNm et la régulation de l'expression génique.

Mesure de la dégradation de l'ARNm Tarifs en

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