L'échelle du génome interaction protéine-protéine Le dépistage par Protein-fragment complémentation Assay (PCA) dans les cellules vivantes

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les partenaires d’interaction protéique d’une protéine d’intérêt à l’aide du test de complémentation du fragment de protéine DI hydro folate réductase, ou D-H-F-R-P-C-A. Ceci est accompli en condensant d’abord la collection DH FFR F trois ou en faisant l’éloge des réseaux de colonies à haute densité. Ensuite, la souche d’appât est fabriquée avec l’éventail d’éloges sur un milieu riche.

Dans la dernière étape, les diploïdes résultant de ces accouplements sont sélectionnés. In fine, la reconstitution du DHFR est quantifiée en mesurant la taille des colonies sur milieu PCA sélectif, ce qui donne un signal proportionnel à la quantité de complexe proie appât reconstituée dans les cellules. Les implications de cette technique s’étendent au traitement de maladies telles que le cancer, comme c’est le cas par le recâblage des réseaux d’interaction protéique.

Que les mutations peuvent conduire à de telles maladies. Le matin de l’intervention, stérilisez la plate-forme robotique en trempant d’abord les outils PIN cinq fois pendant 10 secondes dans la station de bain d’eau pour éliminer tout amas de cellules résiduelles. Ensuite, faites tremper l’outil PIN deux fois d’avant en arrière dans la station de brosse et deux fois dans la station de nettoyage ainsi pendant 20 secondes chaque trempage pour retirer les cellules restantes pendant que les outils PIN sont nettoyés.

Allumez la lampe UV pendant cinq minutes pour stériliser un robot. Enceinte puis après le dernier lavage, séchez les outils PIN dans la station de séchage d’air pendant 25 secondes. Condensez la collection A-D-H-F-R sur 16 tableaux de 384 souches ici.

Un tableau 384 peut être subdivisé en quatre quadrants d’intérêt égal, chacun composé de 96 positions dans une disposition matricielle deux par deux pour un total de quatre quadrants. Pour ce faire pour chaque matrice 384, imprimez quatre plaques de glycérol sur les quatre quadrants d’un plateau omni contenant YPD plus 250 microgrammes par millilitre. L’hygromycine B, à l’aide de l’outil à 96 broches pour ce faire, insérez 4 plaques à 96 puits contenant le contrôle négatif LDH FFR F trois entre les 60 plaques de glycérol de la collection DHFR trois afin d’avoir un ensemble final de 64 plaques qui remplissent exactement quatre 1 536 arrays.

Ensuite, insérez 4 plaques à 96 puits contenant le LDH FFR F trois contrôles négatifs entre les 60 autres plaques pour obtenir un ensemble final de 64 plaques qui remplissent exactement 4 15 36 réseaux avant d’ajouter des cellules aux plaques sources, mouillez les broches stérilisées dans 35 millilitres d’eau stérile dans un plateau omni dans la station humide. Incuber les matrices à 37 degrés Celsius pendant deux jours, puis condenser la collection en quatre matrices de 1 536 souches. Imprimez quatre tableaux de 384 souches sur chacune des quatre plaques de destination.

À l’aide de l’outil à goupille 384. Stérilisation de l’outil PIN entre chaque cycle de réplication, comme nous venons de le démontrer après une autre incubation de deux jours. Normalisez la taille de la colonie en reproduisant les quatre réseaux sur le milieu YPD sélectionné à l’aide d’un outil à 1 536 broches et incubez les plaques pendant 48 heures supplémentaires.

Pour un débit élevé. D-H-F-R-P-C-A : inoculez d’abord une culture de la souche d’appât dans 20 millilitres de YPD liquide et de ricine CIO dans un tube de 50 millilitres et incubez les cellules pendant deux jours à 30 degrés Celsius en agitant à 250 tr/min. Lorsque la culture a atteint la saturation.

Placez cinq millilitres de suspension cellulaire sur un plateau omni YPD plus moucheron, et laissez les cellules absorber à la surface après cinq à 10 minutes, retirez l’excès de liquide et incubez la culture à 30 degrés Celsius après deux jours. À l’aide de l’outil à 1 536 broches, imprimez la souche d’appât sur 12 plaques YPD en utilisant chaque parcelle de pelouse pas plus de quatre fois. Ensuite, à l’aide de l’outil à 1 536 broches, imprimez à nouveau le tableau approprié pour la collection DHFR F trois sur le dessus des cellules d’appât.

Laissez les souches s’accoupler pendant deux autres jours d’incubation, puis sélectionnez les cellules diploïdes en imprimant les colonies sur des plateaux omni contenant YPD plus hydromycine B et nortine. Incuber les diploïdes pendant deux jours de plus à 30 degrés Celsius, puis répéter la sélection comme cela vient d’être démontré un jour après le début de l’incubation. Verser les assiettes avec des milieux contenant du méthotrexate le lendemain.

Utilisez l’outil à 1 536 broches pour imprimer des cellules diploïdes sur le milieu de méthotrexate et incubez les plaques pendant quatre jours de plus dans des sacs en plastique pour empêcher les cultures de se dessécher. Le troisième jour de l’incubation. Versez un deuxième lot de plateaux omni contenant du milieu MTX comme nous venons de le démontrer le lendemain, allumez la lumière du robot et utilisez une plate-forme robotique pour imager les plaques afin de diminuer la croissance de fond des souches PCA et d’augmenter la résolution quantitative, répliquez les cellules sur le deuxième lot de support MTX pour effectuer un deuxième tour de sélection MTX comme cela vient d’être démontré.

Enfin, après avoir acquis des images du deuxième ensemble de plaques, analysez les réseaux de colonies avec le logiciel approprié, en recueillant les informations sur la taille des colonies pour chaque position de chaque réseau. Le seuil défini avec les trois contrôles LDH FFR F peut être utilisé comme seuil empirique pour déterminer les résultats à haut niveau de confiance. Les interacteurs physiques connus de l’appât peuvent ensuite être récupérés à partir de bases de données telles que Biogrid et superposés aux données.

Par exemple, ici, cinq des huit résultats à haut niveau de confiance ont déjà été signalés comme des interacteurs NUP 82, parmi lesquels d’autres NUP 16 et NUP 1 59 ont été déterminés comme faisant partie du sous-complexe NUP 82. Les données indiquent également que la protéine membranaire approximative PEX 30 peut représenter une nouvelle interaction physique de Nup 82, comme l’a confirmé l’utilisation de D-H-F-R-P-C-A à un faible débit : deux des autres partenaires d’interaction détectés. Il a été déterminé que les nouveaux 20 et 85 ne faisaient pas partie du nouveau sous-complexe 82, illustrant la capacité de D-H-F-R-P-C-A à détecter les interactions à l’intérieur et entre les sous-complexes de complexes plus grands.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’utiliser le support Freshly Report pour éviter tout dépannage lors des étapes d’impression, et d’inclure les contrôles nécessaires pour s’assurer que le support PCA final permet la croissance uniquement des cellules démontrant la complémentation DHFR.