Méthode de isolé Ex Vivo Lung perfusion dans un modèle rat: Leçons tirées élaboration d'un programme EVLP Rat

L’objectif global de cette procédure est de mettre en place un modèle cohérent de perfusion pulmonaire ex vivo chez le rat qui donnera des résultats reproductibles. La première étape consiste à canuler la trachée et à commencer la ventilation mécanique. Ensuite, l’artère pulmonaire et l’oreillette gauche sont canulées.

La dernière étape consiste à retirer le bloc cœur-poumon de la cavité thoracique et à le placer dans le circuit de perfusion pulmonaire ex vivo. En fin de compte, des capteurs de pression, des transducteurs de poids et un analyseur de gaz du sang sont utilisés pour montrer l’état du poumon en temps réel en mesurant la pression artérielle pulmonaire et d’autres paramètres. La profusion pulmonaire ex vivo est une technologie remarquable qui nous a permis d’élargir le bassin de donneurs pour la transplantation pulmonaire.

Nous prévoyons que grâce à cette technologie qui servira de plate-forme pour l’évaluation des organes, nous pourrons améliorer la qualité des organes amenés à la transplantation et les résultats globaux de la transplantation. Ici, au laboratoire Copper, nous avons inventé l’expression armer l’organe, c’est-à-dire évaluer, remodeler ou réparer, puis modifier l’organe pour améliorer la qualité et ainsi améliorer les résultats de la transplantation. Nous avons développé un modèle robuste et reproductible de perfusion pulmonaire ex vivo chez le rat petit animal.

À travers cette vidéo, nous vous montrerons les étapes clés et critiques pour développer ce modèle de perfusion pulmonaire ex vivo, qui pourra ensuite servir de plate-forme pour la recherche sur la perfusion et la transplantation. Commencez par configurer le circuit EVLP et faites circuler le huit perfusé chaud dans tout le système. Réglez le bain d’eau chaude, l’échangeur de chaleur et le thorax artificiel à 37 degrés Celsius.

Faites passer un gaz d’oxygénation désoxygénée à travers le huit PERFUSE dans le filtre à gaz pour s’assurer qu’il contient environ 6 % d’oxygène dissous pour l’expérience. Après avoir ouvert le programme d’acquisition de données, connectez le transducteur de pression artérielle pulmonaire, la trachée, le transducteur de pression différentielle, le débit respiratoire, le transducteur de pression différentielle, le transducteur de poids pulmonaire et le transducteur de vitesse de pompe au convertisseur analogique-numérique. Enfin, installez la table d’opération et préparez tous les outils et fournitures d’opération nécessaires à la procédure.

Après avoir vérifié la sédation par l’orteil, pincez, placez l’animal anesthésié en position couchée sur la table d’opération. Commencez à enregistrer les données à l’aide du programme d’acquisition de données. Lorsque vous êtes prêt, entrez dans la cavité abdominale et injectez de l’héparine dans la veine cave inférieure.

En suivant les procédures standard, canulez la trachée et connectez la canule à un circuit de ventilation. Allumez le ventilateur mécanique pour commencer à ventiler mécaniquement les poumons. Ensuite, rétractez la cavité thoracique pour exposer les poumons en prenant soin d’éviter de les toucher.

Retirez le thymus et déplacez le contenu abdominal d’un côté pour exposer soit la veine cave inférieure, soit la veine mésentérique. Après l’euthanasie, placez une suture en soie derrière l’artère pulmonaire et l’aorte. En préparation de la fixation de la canule de l’artère pulmonaire, faites une incision de deux à trois millimètres sur la surface antérieure de la voie d’éjection ventriculaire droite et insérez la canule dans l’artère pulmonaire principale.

Fixez avec une suture en soie, retirez les caillots du système vasculaire pulmonaire en perfusant environ 15 millilitres d’une solution électrolytique à faible teneur en potassium positif à travers l’artère pulmonaire et à travers l’apex du cœur. Placez ensuite une suture en soie derrière le cœur et autour des ventricules. Pour dilater la valve mitrale et faciliter la canulation, insérez une petite paire de pinces chirurgicales dans l’apex à travers la valve mitrale et dans l’oreillette gauche.

Lorsque vous êtes prêt, insérez une canule dans l’apex à travers la valve mitrale et dans l’oreillette gauche. Fixez la canule de l’oreillette gauche avec la suture en soie. Ensuite, connectez la canule de l’artère pulmonaire au circuit EVLP.

Assurez-vous que la conduite d’entrée provenant du circuit est amorcée avec huit perfusés. Pour empêcher l’air de pénétrer dans le cœur et les poumons, allumez la pompe péristaltique principale et réglez-la à basse vitesse. Cela permettra à huit perfusés de traverser l’artère pulmonaire et de sortir par le ventricule gauche dans la cavité thoracique.

Surveillez la pression de l’artère pulmonaire pour vous assurer qu’elle ne monte pas en pointe, indiquant un blocage ou une mauvaise canulation. Lorsque vous êtes prêt, éteignez la pompe péristaltique. Connectez la canule de l’artère pulmonaire au circuit de perfusion pulmonaire ex vivo.

Ne connectez pas la canule de l’oreillette gauche au circuit tant que le bloc cœur-poumon n’a pas été retiré du corps. Retirez le bloc cœur-poumon en clampant l’œsophage avec un hémostatique et en coupant sous la pince afin que l’œsophage puisse être utilisé pour soulever les structures cardiopulmonaires brutalement, disséquer les tissus environnants et couper l’aorte descendante et les vaisseaux auxiliaires pour libérer le bloc cœur-poumon tout en le soulevant via l’œsophage. Transectez la trachée pour libérer le bloc cœur-poumon et placez-le à l’endroit désigné sur le circuit EVLP.

Connectez ensuite la canule de l’oreillette gauche à la conduite d’évacuation et démarrez la pompe péristaltique. Pour enregistrer les données de ventilation et surveiller la pression, retirez rapidement la conduite de ventilation du haut de l’appareil EVLP et fixez le boîtier avec les capteurs de pression. Ensuite, réinsérez la conduite de ventilation sur le dessus de l’appareil EVLP.

Assurez-vous que le piège à bulles est correctement rempli de huit perfusés. Pour éviter d’introduire des bulles d’air dans les poumons pendant les 15 premières minutes, modifiez lentement les paramètres de ventilation et de perfusion jusqu’aux niveaux expérimentaux souhaités. Augmentez également le débit de perfusion au débit et à la pression souhaités pendant cette phase initiale de montée en puissance.

Il est recommandé de programmer le ventilateur pour qu’il produise des respirations latérales intermittentes afin de faciliter le mouvement du liquide hors de l’espace pulmonaire et de retarder l’apparition de l’œdème. Définir le temps zéro comme le temps pendant lequel les paramètres de ventilation sont à un volume courant de quatre millilitres par kilogramme positif. Pression expiratoire finale à deux centimètres.

Les paramètres H2O et de perfusion sont à leurs niveaux attendus et restent constants. Si vous le souhaitez, prélevez huit échantillons de Perfuse dans de l’azote liquide et notez l’heure à laquelle les échantillons ont été prélevés. Une fois l’expérience terminée, isolez tous les morceaux anatomiques nécessaires à la collecte et congelez-les dans de l’azote liquide ou placez-les dans une solution de fixation pour des études plus approfondies.

Le poids pulmonaire des rats Sprague dolly mâles n’a pas changé de manière significative pendant les 60 minutes de perfusion pulmonaire ex vivo après les 10 premières minutes. Il n’y avait pas non plus de changement dans la pression artérielle pulmonaire. De même, la résistance vasculaire pulmonaire n’a pas été modifiée pendant toute la durée de l’étude.

Après une heure de ventilation à des volumes courants élevés et à un peep élevé, les concentrations de cytokines pro-inflammatoires ont augmenté dans le huit PERFUSE, tandis que les concentrations de cytokines anti-inflammatoires sont restées inchangées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension des étapes clés nécessaires à l’établissement d’un modèle de profusion pulmonaire chez le rat chez le petit animal ex Viva dans votre laboratoire.