Name: Exemple Stratégies Préparation de Spectrométrie de Masse Imagerie de culture cellulaire 3D Modèles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Apprenez à préparer des cultures cellulaires 3D pour l'imagerie par spectrométrie de masse MALDI MSI. Cette méthode permet de détecter protéines, lipides et métabolites sans marquage dans des modèles de cancer.

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Ce travail a été soutenu par la Walther Cancer Foundation dans le cadre du programme Advancing Basic Cancer Research de l’Institut de recherche sur le cancer Harper de l’Université de Notre Dame (DARW) et la subvention de démarrage 2011 de la Society for Analytical Chemists de Pittsburgh (ABH). Merci également au personnel de l’Unité de spectrométrie de masse et de protéomique pour les discussions utiles.

1. 3D Culture cellulaire et préparation pour l&#39;imagerie <ol><li> Culture d&#39;une lignée cellulaire appropriée, ce est à dire, la lignée cellulaire de carcinome du côlon HCT116, en deux dimensions, de la culture monocouche. </li><li> Cultiver les cellules HCT 116 dans un flacon T-25 avec les supports de McCoy 5A + 10% de sérum bovin fœtal dans un incubateur à CO2 à 5% jusqu&#39;à 50 à 70% de confluence, ce qui prend généralement quelques jours. </li><li> cellules de sortie avec une solution de trypsine-EDTA 0,25% et comptent une partie des cellules en utilisant un hémocytomètre et coloration au bleu trypan pour vérifier la densité et la viabilité cellulaire. </li><li> Après comptage, diluer les cellules avec du milieu complet pour obtenir une densité d&#39;ensemencement appropriée de 6000 cellules / puits, ou 30 000 cellules / ml. </li></ol> 2. Préparer Agarose Coated plaques à 96 puits <ol><li> Ajouter 0,19 g d&#39;agarose à 10 ml de milieu standard dans un tube conique de 50 ml (solution d&#39;agarose à 1,5% dans des milieux 10). Veiller à l&#39;incorporation par mélange doux. Autoclave l&#39;agarose dans un bain d&#39;eaupendant 20 min. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, aspirer 50 pi du mélange d&#39;agarose + supports dans les 60 puits centraux du fond 96 puits plaque de culture de plaque plane. Comme les puits au niveau des bords périphériques de la plaque ont des taux légèrement plus élevés d&#39;évaporation, ajouter 200 ul de phosphate 1x solution saline tamponnée (PBS) au lieu de l&#39;agarose à ces bords. </li><li> Une fois le mélange agarose a été ajouté dans les puits intérieurs, réglez la plaque de côté pour refroidir à 37 ~ ° C avant l&#39;addition des cellules. </li></ol> 3. Plutôt semences et la culture tridimensionnelle REMARQUE: Les cellules plus ou moins peuvent être ensemencées en fonction des exigences de la culture concernée, mais il a été déterminé que ces conditions conduisent à des structures 3D de culture de cellules d&#39;environ 1 mm de diamètre après 10 à 14 jours de culture (données non présentées) . <ol><li> Ajouter 200 ul de la solution de cellules appropriée (dilué pour contenir ~ 6000 cellules) de l&#39;agarose enduitePlaque de 96 puits. Couvrir la plaque et mettre dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 à 37 ° C pour la croissance cellulaire. </li><li> Changer de support de cellules un minimum de toutes les 48 heures, ou lorsque les médias semble changer de couleur. <ol><li> Changer médias en aspirant soigneusement l&#39;ancien médias à travers le petit culture cellulaire 3D (visible à l&#39;oeil nu par jour 2) au fond de l&#39;agarose. Ajouter 200 ul de milieu frais doucement sur la culture de cellules 3D. </li><li> (Étape optionnelle) Au cours de ces changements des médias, ajouter de chimiothérapie ou d&#39;autres médicaments pour les essais. Diluer le médicament de choix à la concentration finale avec les médias complètes et ajouter les nécessaires 200 pi dans chaque puits. </li><li> Surveiller 3D croissance de culture de cellules au microscope optique, jusqu&#39;à ce que les cultures de cellules 3D sont d&#39;environ 1 mm de diamètre. </li></ol></li></ol> 4. Récolte des cultures de cellules 3D <ol><li> Utilisez un 2 ml pipette sérologique pour enlever délicatement la culture cellulaire 3D du lit agarose. </li> &lt;li&gt; Lavez les cultures de cellules en 3D avec PBS en les pipetant doucement dans environ 1 ml de PBS dans une plaque à 24 puits en attente. </li><li> Transfert récolté des cultures de cellules 3D via une pipette sérologique de tubes à centrifuger de protéine ou d&#39;un métabolite extraction, ou de les incorporer dans un support de coupe pour aider à découper pour des applications d&#39;imagerie. </li></ol> 5. Intégrer les cultures de cellules en 3D dans de la gélatine <ol><li> Préparer une solution de ~ 175 mg / ml de gélatine dans de l&#39;eau de haute pureté (18 MQ préféré). 22,23 Mélanger la gélatine vigoureusement. Observez la solution devenir visqueux et difficile à manipuler. Placer le tube conique contenant de la gélatine dans un bain d&#39;eau à ~ 60 ° C et au chaud jusqu&#39;à ce que la solution devient limpide et facile à aspirer. REMARQUE: La solution de gélatine chaude durcit rapidement en se refroidissant, donc effectuer toutes les étapes suivantes rapidement avant de les congeler. </li><li> Après il est chauffé, prendre immédiatement la gélatine à la hotte de culture cellulaire. Garder le tube avec de la gélatine dans un beaker avec de l&#39;eau préchauffée à environ 60 ° C pour éviter le durcissement de la solution de gélatine. </li><li> En utilisant une pipette sérologique de 2 ml, déposer 0,6 ml de la solution de gélatine chaude dans le puits d&#39;une plaque à fond plat 24. Ce volume est suffisant pour couvrir le fond d&#39;une couche mince. Déposer doucement sur les cultures de cellules 3D immédiatement au-dessus de la couche de gélatine en utilisant une pipette de 2 ml différent pour éviter la rupture de la structure 3D. NOTE: Il faut veiller à ce stade de ne pas placer PBS dans la gélatine. Si cela se produit, cependant, enlever le PBS à partir du haut de la gélatine en utilisant une pipette de 200 pi. </li><li> Après que les cultures de cellules 3D sont placées sur la surface de la couche de gélatine, une pipette soigneusement autre 0,6 ml du mélange de gélatine chaude sur les cultures de cellules 3D, afin de ne pas perturber la position des cultures. Après la deuxième couche est placé, geler les cultures de cellules 3D gélatine intégré à -80 ° C. </li></ol> 6. Trancher et Thaw mont ee-gélatine intégrée des cultures cellulaires 3D pour l&#39;imagerie par spectrométrie de masse <ol><li> Retirer la plaque à 24 puits contenant les cultures de cellules 3D du congélateur. Chauffer le bas de la plaque avec la chaleur de votre main jusqu&#39;à une pince ou d&#39;un scalpel seront faites glisser doucement sur le côté du puits. </li><li> Glisser doucement la pince à épiler ou un scalpel, libérant la gélatine sans décongélation du centre. Prendre une goutte d&#39;eau sur le support de cryostat et l&#39;utiliser pour faire adhérer la gélatine disque sur le support. <ol><li> Des cultures de cellules 3D incorporés dans de la gélatine se prêtent le mieux à découper à -30 ° C. Nettoyez la lame de cryostat et le verre avec 70% d&#39;éthanol avant utilisation. Utilisez une autre partie de la lame ou une nouvelle lame pour chaque cellule disque 3D culture gélatine pour empêcher ternissement de la lame. </li></ol></li><li> Utilisation du cryostat, doucement face à l&#39;excès de gélatine jusqu&#39;à ce que les cultures de cellules 3D deviennent visibles. </li><li> À ce stade couper lentement les cultures de cellules en 3D avec un mouvement lisse 12-16 um sections. NOTE: Les facteurs critiques à trancher comprennent la distance du verre à la lame, l&#39;angle de la lame, la température du cryostat, et l&#39;angle du disque sur le support, de sorte que tous ceux-ci doivent être vérifiés pour se assurer des résultats cohérents. </li><li> Décongeler délicatement les tranches et les monter sur indium oxyde de titane (ITO) lames de verre revêtues d&#39;correctement étiquetés et rangez-la dans un dessiccateur. Utilisez les tranches aussi rapidement que possible pour une qualité maximale. </li></ol> 7. Demande de Matrix et la préparation d&#39;échantillons pour MALDI Imaging <ol><li> Avant imagerie MALDI, préparer tranches avec la matrice appropriée. <ol><li> Pour l&#39;analyse petite molécule, aucune des étapes de lavage sont généralement nécessaires. Pour la détection de la protéine intacte, laver les tranches dans 100% d&#39;acétone froid, le liquide de Carnoy, ou 70% / 95% d&#39;isopropanol pour éliminer les petites molécules telles que des lipides qui pourraient masquer le signal 24 - 26. </li><li> Lavez délicatement pour pas plus de 30 secondes à la fois. Ne pasdéranger les tranches. </li></ol></li><li> Préparer matrice dans une solution de solvant organique et d&#39;eau, avec 0,1% de TFA. Pour de petites molécules tels que α-cyano-4-hydroxycinnamique acide (CHCA), utiliser 60% d&#39;ACN: 40% H 2 O: 0,1% de TFA (10 mg / ml). Pour la détection de protéines tels que l&#39;acide sinapique (30 mg / ml), utiliser la même solution dans un solvant. Pour solubilité optimale de l&#39;acide sinapique, dissoudre d&#39;abord dans de l&#39;acétonitrile avant l&#39;addition du TFA: H 2 O solution. D&#39;autres matrices peuvent être utilisées le cas échéant. REMARQUE: matrice peut être appliquée à plusieurs méthodes différentes, mais il convient de noter certaines matrices ont été trouvées de co-cristalliser avec de la gélatine, tel que l&#39;acide férulique, rendant l&#39;échantillon inutilisable. Les petits cristaux produisent des spectres de masse plus uniforme, ce qui permet d&#39;espèces moléculaires plus être détectés et attribués à des différences biologiques plutôt que des effets de matrice. </li><li> Appliquer la matrice par la méthode handspotting. <ol><li> Utiliser une seringue de pointe fine pour appliquer 0,5 pi de la matrix solution sur la culture cellulaire 3D tranche et permet la matrice pour cristalliser. </li></ol></li><li> Vous pouvez également utiliser la méthode de l&#39;aérographe. Remplissez un aérographe de qualité commerciale avec la solution de matrice. <ol><li> Tenir le pulvérisateur 8-12 centimètres de la diapositive, viser une fine pulvérisation à la tranche. Entre les passages, la matrice permet de sécher pendant 1 min pour permettre la meilleure formation de cristaux. Jusqu&#39;à 10-20 passes de l&#39;aérographe est nécessaire pour produire une couche optimale de la matrice 22. </li></ol></li><li> Vous pouvez également utiliser la méthode de sublimation détaillé ailleurs. 25,27 </li><li> Lames sécher dans un dessiccateur pendant au moins 30 min avant l&#39;MALDI-MSI, quelle que soit la méthode d&#39;application de la matrice 25. </li></ol> 8. MALDI-MSI analyse à partir d&#39;un système MALDI-TOF (c.-à-AUTOFLEX III) NOTE: Cette section contient des instructions et des conseils pour le réglage des paramètres pour une expérience d&#39;imagerie MALDI-TOF. Selon les tenantsfabricant et logiciels utilisés trument, le processus peut varier. <ol><li> Monter les diapositives dans un adaptateur fait pour tenir solidement 75 mm x 25 diapositives mm à l&#39;image 3D les tranches de culture cellulaire attachés à lamelles recouvertes ITO. Charger l&#39;adaptateur de diapositives dans l&#39;instrument. </li><li> Préparer l&#39;instrument de MALDI-MSI en sélectionnant une norme de calibrage approprié pour la gamme de masse en question. Pour interrogation de petites molécules, les signaux détectés qui correspondent à la matrice utilisée, α-CHCA, sont un groupe commun de étalons. Pour l&#39;analyse de protéines, les normes de protéine connue (ce est à dire, l&#39;ubiquitine, trypsinogène) dans la gamme de masse d&#39;intérêt sont choisis et repérés à proximité des cultures de cellules 3D comme étalons. Calibrer l&#39;appareil avant de procéder à l&#39;élaboration de méthodes. </li><li> Avant imagerie, développer des méthodes d&#39;acquisition de données pour la gamme de masse de choix en utilisant le logiciel fourni par le fabricant de l&#39;instrument. Voir les figures 1 et 2 pourune petite molécule de protéine et d&#39;imagerie. Pour l&#39;imagerie du petit molécule, utiliser le mode réflectron pour la résolution de masse plus élevée. <ol><li> Réglez la plage de masse pour l&#39;acquisition de données de petites molécules entre 100-1000 m / z et pour les protéines entre 8,000- 25,000 m / z. Réglez la plage de masse pour englober la région de choix tout en offrant la résolution de masse plus élevée possible avec l&#39;instrument. </li><li> Réglez la puissance du laser, la fréquence, le nombre de tirs laser et taille de la tache à l&#39;aide de la solution d&#39;étalonnage et une «sacrificielle» culture cellulaire 3D tranche à proximité. Observez ces paramètres dans le logiciel de commande principal de l&#39;instrument. Utilisez les paramètres suivants comme point de départ recommandée: puissance de 60%, 400 tirs laser, ultra petite taille de spot. Ces paramètres varient selon les instruments et méthodes, afin d&#39;optimiser les paramètres de l&#39;appareil pour donner le spectre de la plus haute qualité pour chaque instrument spécifique. D&#39;autres paramètres qui peuvent être ajustés comprennent le gain du détecteur, la fréquence d&#39;échantillonnage, et le gain électronique. Save cette méthode pour une utilisation dans le logiciel d&#39;imagerie (ie., Exécution automatique Méthode qui se appuiera sur FlexImaging). REMARQUE: Supprime les ions ci-dessous la gamme de masse d&#39;intérêt (à nouveau trouvé dans le contrôle de l&#39;instrument) afin de ne pas interférer avec la détection. </li><li> Développer protéines méthodes d&#39;acquisition de données pour la gamme de masse de choix. Suivez les mêmes étapes décrites ci-dessus, mais pour les gammes milieu à la masse élevée, supérieure à environ 3 kDa, utiliser le mode linéaire. REMARQUE: Les paramètres diffèrent de ceux utilisés pour les petites méthodes de molécules. </li></ol></li><li> paramètres de l&#39;appareil de configuration spécifiques MS en utilisant le logiciel d&#39;imagerie fournie par le fabricant de l&#39;instrument, comme FlexImaging pour les systèmes Bruker MALDI-TOF. <ol><li> Créez un nouveau fichier d&#39;imagerie et le dossier, en utilisant les méthodes développées avant et enregistrés. Sélectionnez les paramètres de l&#39;appareil tels que la taille du spot de trame (de changement de la valeur par défaut environ 200 um à 50 um), mis en place la méthode de contrôle d&#39;instruments (de configuration de l&#39;étape 8.3.2 ou 8.3.3), et Position où numériser sur la culture cellulaire 3D. </li><li> Sélectionner trois points enseignent appropriées sur l&#39;échantillon, le déplacement du laser à chaque tour à tour. Obtenir la photographie optique depuis le logiciel de commande de laser MALDI-TOF utilisant &#39;écran d&#39;impression&#39;. NOTE: De nombreux logiciels d&#39;imagerie nécessitent une photographie optique de l&#39;échantillon à «enseigner» le logiciel où le laser est situé, qui peut être obtenu avec un scanner ou souvent la caméra de l&#39;appareil. </li></ol></li><li> Puis démarrer le processus d&#39;imagerie à partir du logiciel d&#39;imagerie (pas le contrôle de l&#39;instrument) et d&#39;acquérir des spectres de masse de chaque tranche. Observez la plupart des masses à travers la culture cellulaire 3D et d&#39;autres localisés à des zones particulières. </li></ol> 9. Facultatif Méthodes d&#39;analyse de données <ol><li> Pour l&#39;analyse ciblée, effectuer une analyse manuelle des spectres en cliquant sur ​​une masse dans le spectre de moyenne, ou de permettre le logiciel d&#39;imagerie de récupérer automatiquement des masses dessus d&#39;un seuil particulier (par exemple., Pics above haut seuil de 20%). Pour le contrôle de qualité, examiner la distribution des pics de la matrice ou le spectre moyen. </li><li> Effectuer des analyses statistiques avec des données extraites des logiciels mathématiques tels que R ou Matlab. <ol><li> Export spectres unique, au format ASCII, un fichier texte lisible, pour charger dans le logiciel de choix. </li><li> Convertir les différents spectres en ASCII, mzXML, format mzML pour la lecture de plusieurs logiciels différents, 28 -. 31 ou exporter les données comme un Analyser (.img) de format, un format couramment utilisé pour d&#39;autres applications d&#39;imagerie telles que l&#39;IRM 32 Deux options open-source pour l&#39;analyse sont MSiReader et BioMap 32,33. </li><li> Une fois les fichiers sont exportés dans un format lisible par le logiciel, charger l&#39;ensemble de données via les instructions du logiciel respectif. Après le chargement, effectuer un traitement post-acquisition, comme l&#39;enlèvement de base et de la normalisation. </li><li> Avec cet ensemble de données, effectuer des statistical traitements tels que l&#39;analyse en composante de classification hiérarchique en utilisant des scripts ou construites dans les algorithmes des logiciels tels que Matlab 18 personnalisés. </li></ol></li></ol>

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Cet article fait partie d’un numéro spécial sur l’imagerie préclinique multimodale, sponsorisé par Bruker Biospin. Le système MALDI-TOF utilisé pour obtenir les résultats représentatifs est un Bruker AutoFlex III.

En utilisant les procédés décrits ci-dessus, les cultures cellulaires peuvent être cultivées en 3D et analysés par MALDI-MSI. Beaucoup de lignées cellulaires immortalisées seront former des structures 3D lorsqu&#39;elles sont cultivées de façon appropriée. 9,10 Il faut prendre soin de cultiver des cellules qui ne ont pas été transmis trop de fois, ce est avoir un faible nombre de passages. En général, les cellules ayant les numéros de passage de dix et inférieur sont optimales pour des cultures de cellules en croissance 3D. La croissance des cultures de cellules en 3D dans un support traditionnel agarose fournit un moyen rentable pour les groupes de recherche intéressés par la culture cellulaire 3D pour essayer ce système. Cette méthode utilise peu de composants ne sont pas déjà dans la plupart des laboratoires de mammifère en culture cellulaire. Une attention particulière doit être accordée à la préparation des plaques d&#39;agarose pour la croissance afin que les cultures de cellules 3D sont compatibles en taille et en forme; certains aspects qui nécessitent une attention particulière comprennent la vérification qu&#39;aucune des bulles d&#39;air sont piégées dans le mélange et en ce qu&#39;un ménisque appropriée est formée au fond de chaque well. Si le ménisque ne se forme pas correctement, les cellules peuvent croître dans des formes non sphéroïde ou en petits amas. De plus, il faut prendre soin de ne pas placer dans le PBS gélatine avec les sphéroïdes. Si cela se produit, enlever le PBS à partir du haut de la gélatine en utilisant une pipette de 200 pi. Si le coût ne est pas un facteur, ultra-faible plaques à fond rond contraignantes sont commercialement disponibles et offrent la simplification de ces étapes. Bien que d&#39;autres méthodes d&#39;incorporation de tissu peuvent également être coûteux et spectrométrie de masse non-compatible, la gélatine-enrobage a été démontré à la fois peu coûteux et versatile. stratégies de préparation décrites ci-dessus ont été optimisés pour les cultures cellulaires 3D pour obtenir des données de la plus haute qualité. Alors que la gélatine-enrobage a été montré pour être compatible avec l&#39;analyse par spectrométrie de masse, ce processus fait rétrécir les matrices disponibles en raison de co-cristallisation. Une fois congelés, les cultures de cellules en 3D sont stables pendant des mois tant qu&#39;ils ne sont pas congelé et décongelé. La gélatine devient opaque quand ils sont gelés, et la cellule 3Dcultures sont d&#39;une couleur similaire, il est donc conseillé avant de les congeler pour documenter la 3D placement de culture cellulaire pour aider à trancher. Lors de la préparation des diapositives, la matrice peut être appliquée à plusieurs méthodes différentes, mais il convient de noter que certaines matrices ont été trouvées de co-cristalliser avec de la gélatine, tel que l&#39;acide férulique, rendant l&#39;échantillon inutilisable. Les petits cristaux de matrice produisent des spectres de masse plus cohérente. Alors que handspotting est la méthode la plus simple d&#39;application de la matrice, le plus grand volume de solvant peut entraîner de plus grandes tailles de cristal et de la migration de l&#39;analyte significatif. Au spectromètre de masse, les progrès dans les technologies MALDI-MSI ont réduit l&#39;expertise nécessaire pour les analyses début. L&#39;acquisition et l&#39;analyse des données est simple sur la plupart des systèmes, permettant même un novice d&#39;obtenir des informations de haute qualité à partir de diapositives ITO. Une sélection rigoureuse des paramètres de l&#39;appareil, à proximité optimisé sur non-image 3D digne cellule cultures, est essentielle pour obtenir des données de haute qualité. Par exemple, l&#39;augmentation de la puissance du laser peut augmenter l&#39;intensité de pointe, mais la baisse du pouvoir laser peut améliorer la résolution et de donner les formes des pics plus symétriques. Cultures de cellules en 3D doivent être utilisés rapidement après la coupe pour assurer la qualité optimale de l&#39;échantillon. Dégradation de signal de la protéine peut être vu en moins d&#39;une semaine sans stockage approprié (dessiccateur / -80 ° C congélateur), en particulier dans la région de masse élevée (supérieure à 20 kDa). En raison de la demande croissante, de nombreux logiciels de visualisation différents ont été développés et sont gratuits pour le public de recherche. La plupart des spectromètres de masse d&#39;imagerie ont installé le logiciel nécessaire pour visualiser les masses simples avec les formats propriétaires utilisés sur chaque instrument. Ces logiciels peuvent être utilisés pour obtenir des images de masse unique et exporter les données. La plupart des logiciels permettra également la superposition de deux ou plusieurs masses d&#39;intérêt. En outre, de nombreux téléspectateurs différents pour les données MSI sont téléchargeables gratuitement, comme un MSiReaderd BioMap. 32,33 Les données de spectrométrie de masse obtenus peuvent également être traitées post-acquisition avec facilité, apportant des informations plus utiles à l&#39;avant-garde. Des produits pharmaceutiques à des lipides des protéines, le système décrit ci-dessus permet l&#39;acquisition rapide de données pour évaluer la distribution de molécules d&#39;intérêt à travers une structure de culture de cellules 3D. Des coupes en série peuvent être prises pour l&#39;image entière de la structure 3D de la construction à partir de chaque image en 2D d&#39;une tranche de la culture de cellules 3D. Les techniques et les notes dans le protocole seront utiles aux chercheurs désireux de commencer la culture de cellules en trois dimensions comme un pont entre culture monocouche et des modèles animaux. Une fois maîtrisé, ces techniques peuvent être appliquées à de multiples types de cultures 3D de cellules, les tissus et les cultures de cellules, permettant aux chercheurs de l&#39;image selon échantillons qu&#39;ils choisissent.

L’imagerie par spectrométrie de masse (MSI) est une technique puissante pour examiner la distribution des espèces moléculaires dans les échantillons d’intérêt. Grâce à cette technique, les chercheurs ont imagé des échantillons biologiques d’animaux entiers jusqu’à des cellules uniques. 1–4 À l’aide de la MSI, des centaines d’analytes peuvent être imagés en une seule fois, plutôt que des techniques à substrat unique nécessitant le développement de fluorophores supplémentaires pour la microscopie confocale traditionnelle ou la coloration pour l’histologie. 5–7 De plus, la MSI peut être utilisée de manière ciblée ou basée sur la découverte, ce qui en fait une approche attrayante pour examiner le chevauchement entre la distribution des espèces chimiques. On y présente des méthodes de croissance, de préparation et d’imagerie MALDI (désorption ionnelle/désorption laser assistée par matricielle) de petits échantillons (~1 mm de diamètre) de cultures cellulaires multicellulaires tridimensionnelles. 8 à 11
Les cultures cellulaires 3D présentent un intérêt particulier pour la communauté biologique en tant qu’intermédiaire entre la culture monocouche traditionnelle et les tumeurs in vivo. Comme leur nom l’indique, les cultures cellulaires 3D sont des agrégats cellulaires hétérogènes qui contiennent de nombreux gradients chimiques dans le microenvironnement observés dans les petits nodules tumoraux avasculaires, ce qui en fait un système de modèle plus réaliste pour l’environnement tumoral natif que la culture monocouche. 10 De nombreuses lignées cellulaires humaines peuvent être cultivées en 3D, y compris des lignées cellulaires dérivées de tissus du côlon, du sein, de l’ovaire, de la prostate, des reins et des poumons. 10 L’imagerie des cultures cellulaires tridimensionnelles présente des défis inhérents, car elles sont plus petites que de nombreux échantillons couramment utilisés pour l’imagerie par spectrométrie de masse et nécessitent donc une préparation minutieuse des échantillons. 7 Cependant, les avantages de ces systèmes de modèles traitables comprennent un coût inférieur et un temps de croissance et d’analyse plus rapide par rapport aux modèles animaux. Par conséquent, les études impliquant des cultures cellulaires tridimensionnelles peuvent avoir un débit plus élevé que les études animales traditionnelles. 12 à 14
Tous ces avantages ont entraîné une popularité croissante pour les cultures cellulaires tridimensionnelles dans la recherche biologique ; il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies analytiques pour explorer à la fois la composition et la distribution spatiale des molécules dans ces systèmes. 12,15–21 L’objectif de ce manuscrit est de décrire l’adaptation des méthodes d’imagerie par spectrométrie de masse et de préparation d’échantillons aux cultures cellulaires tridimensionnelles.

<table><tbody><tr><td>HCT116 Lignée cellulaire</td><td>ATCC ATCC</td><td>CCL-247</td><td>Danger potentiel, manipuler avec précaution</td></tr><tr><td>Milieu McCoy’s 5A</td><td>Gibco</td><td>16600-108</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal</td><td>bovin HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA</td><td>solution Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Gélatine</td><td>10010049</td><td></td><td>Gibco</td> saline tamponnée</tr><tr><td>, non aromatisée</td><td>Knox</td><td></td><td>Disponible dans la plupart des épiceries en emballages individuels</td></tr><tr><td>Lames de verre revêtues d’ITO</td> Delta <td>Technologies, Limited</td><td>CG-90IN-S115</td><td></td></tr><tr><td>&alpha ;-Acide cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA)&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8982</td><td></td></tr><tr><td>Acide sinapique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85429</td><td></td></tr><tr><td>0,3 mm Gravity Feed Dual-Action Airbrush Paint Spray Kit Set</td><td>RoyalMax Airbrush</td><td></td><td>De nombreuses options disponibles sur des sites tels que Amazon.com</td></tr></tbody></table>

exemple stratégies préparation de spectrométrie de masse imagerie de culture cellulaire 3d modèles

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Les cultures cellulaires tridimensionnelles sont des modèles attrayants pour la recherche biologique. Ils combinent la flexibilité et la rentabilité de la culture cellulaire avec une partie de la complexité spatiale et moléculaire des tissus. Par exemple, de nombreuses lignées cellulaires forment des structures 3D dans des conditions in vitro appropriées. Les lignées cellulaires du cancer du côlon forment des sphéroïdes de culture cellulaire 3D, imitant in vitro des nodules tumoraux avasculaires. Alors que l’immunohistochimie et d’autres méthodes d’imagerie classiques sont populaires pour surveiller la distribution d’analytes spécifiques, l’imagerie par spectrométrie de masse examine la distribution des classes de molécules de manière non biaisée. Alors que l’imagerie par spectrométrie de masse MALDI a été développée à l’origine pour interroger des échantillons obtenus à partir d’humains ou de modèles animaux, ce rapport décrit l’analyse des cultures cellulaires tridimensionnelles in vitro, y compris les améliorations apportées aux stratégies de préparation des échantillons. Voici des méthodes de croissance, de récolte, de sectionnement, de lavage et d’analyse de cultures cellulaires 3D via l’imagerie MALDI-MS (désorption/ionisation laser assistée par matrice). En utilisant des cultures cellulaires 3D de carcinome du côlon comme système modèle, ce protocole démontre la capacité de surveiller les analytes de manière impartiale dans le système de culture cellulaire 3D avec MALDI-MSI.

MSI imagerie a le potentiel de révéler beaucoup distribution moléculaire différente dans des cultures de cellules 3D. En utilisant la méthode décrite ci-dessus, les espèces de petites molécules (figure 1) à de grandes protéines (Figure 2) peuvent être suivis à travers la culture. Ces résultats montrent la visualisation d&#39;un seul ion avec l&#39;outil MSiReader libre. 32 Les résultats peuvent être analysés pour les ions uniques d&#39;intérêt dans la culture cellulaire 3D avec un logiciel de visualisation, soit dans une région d&#39;intérêt ou la totalité de la région balayée. En outre la plupart des logiciels de visualiser automatiquement ions dessus d&#39;un certain seuil fixé par l&#39;utilisateur, ce qui peut aider les efforts de découverte. Une fois les cartes d&#39;ions uniques sont obtenus, la plupart des logiciels comprend une possibilité de superposer les images pour voir la colocalisation des ions. Soit dans la découverte approches fondées ou de manière ciblée, l&#39;imagerie par spectrométrie de masse est un outil puissant pour analyser les cultures de cellules 3D. Figure 1. Les résultats représentatifs de 3D ​​croissance de culture de cellules et de sectionnement. Gauche) de l&#39;image optique d&#39;une structure de culture de cellules intactes colorectal HCT-116 en 3D tel que vu à 14 jours avant la récolte. Droite) optique de l&#39;image d&#39;une tranche d&#39;environ équatoriale d&#39;une 3D dégel de culture cellulaire colorectal monté sur une glissière ITO pour l&#39;imagerie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig1large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig2highres.jpg" /> Figure 2. Les résultats représentatifs de petite molécule MALDI-MSI d&#39;une section équatoriale d&#39;une culture cellulaire 3D. Haut) de spectres de masse moyenne obtenue avec α-CHCA dans la gamme faible masse (petite molécule). Bas) images représentatifs deune seule masse: 327,8 m / z principalement localisée à l&#39;intérieur de la culture de la cellule 3D et 429,7 m / z principalement localisé sur le bord de la culture de cellules 3D. La ligne pointillée indique le bord approximative du sphéroïde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig2large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig3highres.jpg" /> Figure 3. Les résultats représentatifs de l&#39;imagerie des protéines par MALDI-MSI d&#39;une section équatoriale d&#39;une culture cellulaire 3D. Haut) de spectres de masse moyenne atteint avec de l&#39;acide sinapique dans le supérieur (gamme de protéines) de masse. Bas) représentatifs des images d&#39;une seule masse: 10 871 m / z principalement localisé sur le bord de l&#39;ellipsoïde, et 12 184 m / z localisée plus vers l&#39;intérieur de l&#39;ellipsoïde. La ligne pointillée indique le bord approximative du sphéroïde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig3large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Des lignées cellulaires de cancer immortalisées peuvent être cultivées sous forme de cultures de cellules 3D, un modèle précieux pour la recherche biologique. Ce protocole décrit imagerie par spectrométrie de masse des cultures de cellules 3D, y compris l&#39;amélioration de la plate-forme de préparation de l&#39;échantillon. L&#39;objectif de ce protocole est de demander aux utilisateurs de préparer des cultures cellulaires 3D pour la masse analyse de l&#39;imagerie par spectrométrie.

Exemple Stratégies Préparation de Spectrométrie de Masse Imagerie de culture cellulaire 3D Modèles

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

L'objectif général de cette procédure est de préparer des cultures cellulaires tridimensionnelles et de les analyser par imagerie en spectrométrie de masse. Cela est réalisé en premier lieu en construisant des cultures cellulaires tridimensionnelles et en les laissant croître jusqu'à la taille souhaitée. La deuxième étape consiste à récolter les cultures cellulaires tridimensionnelles et à les inclure dans de la gélatine.Ensuite, les cultures cellulaires tridimensionnelles sont découpées à moins 30 degrés Celsius à l’aide d’un cryostat et montées sur des lames conductrices. La dernière étape consiste à analyser les tranches à l’aide d’un instrument de MSI MALDI et à effectuer l’analyse des molécules détectées. En définitive, l’imagerie par spectrométrie de masse permet de visualiser les changements de distribution des analytes appartenant à de nombreuses classes différentes de biomolécules au sein de la culture cellulaire tridimensionnelle.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la microscopie de masse ou l'autoradiographie est que l'imagerie par spectrométrie de masse permet la détection et la localisation de multiples analytes, tels que des protéines, des lipides, des médicaments et des métabolites, lors d'une seule expérience, sans nécessiter d'étiquetage immunologique. La procédure sera démontrée par Dorothy Alf Wheatcraft, moi-même, post-doctorante, et Shin Li, étudiante diplômée du laboratoire de Hamman. Avant de commencer cette procédure, cultivez une lignée cellulaire appropriée, comme la lignée de carcinome colorectal HCT 116, en culture monocouche bidimensionnelle. Ensuite, ajoutez 0,19 gramme d'aros à 10 millilitres de milieu standard dans un tube conique de 50 millilitres.Assurez une incorporation par un mélange doux, puis stérilisez l'agarose dans un bain-marie pendant 20 minutes à l'aide d'un pipeteur multipuits. Ajoutez 50 microlitres du mélange de milieu Agros dans les 60 puits centraux d'une plaque de culture 96 puits à fond plat. Comme les puits situés aux bords périphériques de la plaque présentent des taux d'évaporation légèrement plus élevés, ajoutez 200 microlitres d'une solution saline tamponnée au phosphate 1 x à la place de l'agarose dans ces puits périphériques.Une fois le mélange d'aros ajouté aux puits internes, mettre la plaque de côté pour la laisser refroidir à environ 37 degrés Celsius avant d'ajouter les cellules. À ce stade, ajouter 200 microlitres de la solution cellulaire appropriée sur la plaque de 96 puits revêtue d'aros, couvrir la plaque et la placer dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pour la croissance cellulaire. Après l'incubation, changer le milieu en aspirant soigneusement l'ancien milieu autour de la petite culture cellulaire tridimensionnelle située au fond de l'aros.Ensuite, ajoutez délicatement 200 microlitres de milieu frais sur la culture cellulaire tridimensionnelle. Préparez une solution d'environ 175 milligrammes par millilitre de gélatine dans de l'eau de haute pureté. Mélangez vigoureusement la gélatine après que la solution soit devenue visqueuse et difficile à manipuler.Placer le tube dans un bain-marie à environ 60 degrés Celsius et chauffer jusqu'à ce que la solution devienne limpide et facile à aspirer. À l’aide d’une pipette serologique de deux millilitres, déposer 0,6 millilitre de la solution de gélatine chaude dans les puits d’une plaque à 24 puits à fond plat. Poser immédiatement les cultures cellulaires tridimensionnelles lavées directement sur la couche de gélatine en utilisant une autre pipette de deux millilitres afin d’éviter de rompre la structure tridimensionnelle.Une fois les cultures cellulaires placées à la surface de la couche de gélatine, pipetez soigneusement encore 0,6 millilitre du mélange de gélatine tiède par-dessus afin de ne pas perturber leur position. Ensuite, congeler. Conserver les cultures cellulaires tridimensionnelles incluses dans la gélatine à moins 80 degrés Celsius.Une fois la plaque 24 puits contenant les cultures cellulaires retirée du congélateur, réchauffez le fond de la plaque avec la main jusqu'à ce que les pinces puissent glisser doucement le long du côté du puits. Ensuite, faites glisser délicatement les pinces autour du disque, en libérant la gélatine sans décongeler le centre.Ajoutez une goutte d'eau sur le support du cryostat et fixez-y le disque de gélatine. Placez ensuite le support dans le cryostat pour congeler. Après avoir éliminé l'excès de gélatine afin d'exposer les cultures cellulaires tridimensionnelles, sectionnez-les lentement avec un mouvement régulier en tranches de 12 à 16 micromètres.Une fois les tranches décongelées, montez-les sur des lames en verre revêtues d'oxyde d'indium et d'étain. Après avoir étiqueté les lames, conservez-les dans un dessiccateur pour la détection de protéines intactes. Lavez les tranches à l'acétone froide pour éliminer les petites molécules telles que les lipides, qui pourraient masquer le signal.Préparez la matrice dans une solution de solvant organique et d'eau contenant 0,1 % d'acide trichloroacétique. Utilisez une seringue à embout fin pour appliquer 0,5 microlitre de la solution matricielle sur la tranche de culture cellulaire tridimensionnelle. Après avoir laissé la matrice cristalliser, faites sécher les lames dans un dessiccateur pendant au moins 30 minutes avant la MSI Maldi.À ce stade de l'analyse, insérez les lames dans un adaptateur conçu pour maintenir fermement des lames de 75 millimètres par 25 millimètres afin d'imaginer les tranches de culture cellulaire tridimensionnelles. Ensuite, chargez l'adaptateur à lame dans l'instrument. Après avoir mis au point les méthodes appropriées d'acquisition de données, réglez la gamme de masse pour l'acquisition de données sur les petites molécules entre 101, 000 rapport masse/charge et pour les protéines entre 8, 020 et 5, 000 rapport masse/charge.Après cela, ajustez la puissance du laser, la fréquence, le nombre d'impulsions laser et la taille du spot à l'aide de la solution d'étalonnage et d'une tranche voisine de culture cellulaire tridimensionnelle sacrificielle. Enregistrez cette méthode pour une utilisation dans le logiciel d'imagerie fourni par le fabricant de l'instrument. Élaborez des méthodes d'acquisition des données protéiques pour la plage de masses choisie, comme décrit précédemment.Ensuite, configurez les paramètres spécifiques de l'instrument de spectrométrie de masse à l'aide du logiciel d'imagerie. Après avoir sélectionné les paramètres de l'instrument et défini la méthode de contrôle de l'instrument, choisissez la position où effectuer la numérisation de la culture cellulaire tridimensionnelle. Ensuite, sélectionnez trois points de repère appropriés sur l'échantillon en déplaçant le laser vers chacun d'eux.Ensuite, obtenez la photographie optique à partir du logiciel de contrôle laser MALDI TOF en utilisant la fonction d'impression d'écran. Puis démarrez le processus d'imagerie à partir du logiciel d'imagerie et acquérez des spectres de masse à partir de chaque coupe pour une analyse ciblée. Effectuez l'analyse manuelle des spectres en cliquant sur une masse dans le spectre moyen.Enfin, effectuez une analyse statistique avec les jeux de données extraits à l’aide d’un logiciel mathématique. L’imagerie par spectrométrie de masse permet de révéler de nombreuses distributions moléculaires différentes dans des cultures cellulaires tridimensionnelles. Grâce à la méthode décrite précédemment, des espèces allant de petites molécules à de grandes protéines peuvent être suivies au sein de la culture.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de préparer, découper et analyser des cultures cellulaires tridimensionnelles par imagerie en spectrométrie de masse.

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Ici, nous présentons des protocoles pour effectuer à la fois l’imagerie par spectrométrie de masse ambiante (MSI) des tissus et l’analyse MS à cellule unique vivante (SCMS) in situ à l’aide de la sonde unique, qui est un dispositif multifonctionnel miniaturisé pour l’analyse MS.

Applications de la mono-sonde: Mass Spectrometry Imaging et simple Cellule d&#39;analyse dans les conditions ambiantes

Ce protocole décrit une méthode fiable et reproductible pour la préparation axée sur la sublimation du formol fixé tissu destiné à la spectrométrie de masse d’imagerie.

Une préparation optimale du formol fixé des échantillons à base de peptides Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Une nouvelle méthode de préparation de l’échantillon a été développée pour accueillir la co-culture de cellules et de tissus pour détecter l’échange de petites molécules à l’aide de la spectrométrie de masse d’imagerie.

Capture de petites molécules Communication entre les tissus et les cellules à l’aide d’imagerie de la spectrométrie de masse

Une plate-forme intégrée de manipulation cellulaire est développée pour une utilisation en conjonction avec une configuration de spectrométrie de masse à sonde unique pour l'analyse en ligne des cellules de suspension individuelles dans des conditions ambiantes.

Plateforme intégrée de manipulation cellulaire couplée à la sonde unique pour l'analyse de spectrométrie de masse des médicaments et des métabolites dans les cellules de suspension unique

Ici, nous fournissons des protocoles détaillés, robustes et complémentaires pour effectuer la coloration et l’imagerie de résolution subcellulaire de modèles de culture cellulaire tridimensionnelle fixes allant de 100 μm à plusieurs millimètres, permettant ainsi la visualisation de leur morphologie, de leur composition de type cellulaire et de leurs interactions.

Coloration et imagerie haute résolution de modèles organoïdes et sphéroïdes tridimensionnels

Ce protocole détaille une méthode pour la production de trois types différents de sphéroïdes d’une manière qui les rend adaptés au criblage et à l’analyse à grande échelle à haute teneur. En outre, des exemples sont présentés montrant comment ils peuvent être analysés au niveau des sphéroïdes et des cellules individuelles.

Une méthode robuste pour la production à grande échelle de sphéroïdes pour les applications de criblage et d’analyse à haute teneur

Nous présentons un protocole de culture de sphéroïdes hautement reproductibles et leur caractérisation phénotypique par capture d’images et protéomique.

Analyse phénotypique semi-automatisée de cultures fonctionnelles de cellules sphéroïdes 3D

Nous présentons ici un protocole pour produire des cocultures bio-imprimées en 3D de neurones et d’astrocytes dérivés d’iPSC. Ce modèle de coculture, généré à l’intérieur d’un échafaudage d’hydrogel dans des formats de 96 ou 384 puits, démontre une viabilité post-impression élevée et une croissance des neurites en 7 jours et montre l’expression de marqueurs de maturité pour les deux types de cellules.

Bio-impression tridimensionnelle de cocultures neurones-astrocytes humaines dérivées d’iPSC pour des applications de criblage

Ce protocole vise à préserver les métabolites cellulaires pour la spectrométrie de masse sur cellule unique (SCMS) en combinant le lavage en solution de sel volatil, l’extinction rapide de l’azote liquide, la lyophilisation et le stockage à -8 °C. Il démontre que l’extinction de l’azote liquide est essentielle pour maintenir les profils de métabolites, tandis que le stockage prolongé au froid doit être minimisé pour prévenir les altérations métaboliques.

Préparation d’échantillons pour les études métabolomiques par spectrométrie de masse sur cellule unique : lavage, trempe, séchage et stockage combinés des cellules

Ce protocole décrit l’imagerie par spectrométrie de masse monocellulaire des cellules OVCAR-8 utilisant une ionisation par électropulvérisation par désorption couplée à des spectromètres de masse Orbitrap pour une analyse métabolomique à haute résolution spatiale.

Imagerie par spectrométrie de masse à cellule unique utilisant l’ionisation par électrospray par désorption couplée aux spectromètres de masse Orbitrap

Apprenez à préparer des cultures cellulaires 3D pour l'imagerie par spectrométrie de masse MALDI MSI. Cette méthode permet de détecter protéines, lipides et métabolites sans marquage dans des modèles de cancer.

Exemple Stratégies Préparation de Spectrométrie de Masse Imagerie de culture cellulaire 3D Modèles

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