Name: Évaluation de limpact de lexposition répétée de organotypiques 3D bronchiques et nasales Tissue Culture modèles Whole fumée de cigarette (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Découvrez l'évaluation de la toxicité respiratoire par exposition répétée à la fumée de cigarette sur des modèles tissulaires bronchiques et nasaux 3D. Cette méthode utilise des approches de biologie des systèmes pour analyser les réponses cellulaires.

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Les auteurs tiennent à remercier Maurice Smith et Marja Talikka pour la révision du manuscrit.

<ol><li>Pezzulo, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+air-liquid+interface+and+use+of+primary+cell+cultures+are+important+to+recapitulate+the+transcriptional+profile+of+in+vivo+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiolog%22%5BJournal%5D)">The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiolog. 300, L25-L31 (2011).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biolog%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature reviews Molecular cell biolog. 8, 839-845 (2007).</li>
<li>Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+airway+epithelium+air%E2%80%93liquid+cultures+represent+the+in+vivo+airway+epithelium+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biolog%22%5BJournal%5D)">Do airway epithelium air–liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome.</a> American journal of respiratory cell and molecular biolog. 44, 465(2011).</li>
<li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biolog%22%5BJournal%5D)">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biolog. 34, 39-48 (2006).</li>
<li>Balharry, D., Sexton, K., BéruBé, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+approach+to+assess+the+toxicity+of+inhaled+tobacco+smoke+components%3A+nicotine%2C+cadmium%2C+formaldehyde+and+urethane%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicolog%22%5BJournal%5D)">An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane.</a> Toxicolog. 244, 66-76 (2008).</li>
<li>Mathis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bronchial+epithelial+cells+exposed+in+vitro+to+cigarette+smoke+at+the+air-liquid+interface+resemble+bronchial+epithelium+from+human+smokers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physio%22%5BJournal%5D)">Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physio. 304, L489-L503 (2013).</li>
<li>Cho, M. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioluminescent+cytotoxicity+assay+for+assessment+of+membrane+integrity+using+a+proteolytic+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitr%22%5BJournal%5D)">A bioluminescent cytotoxicity assay for assessment of membrane integrity using a proteolytic biomarker.</a> Toxicology in Vitr. 22, 1099-1106 (2008).</li>
<li>Stewart, C. E., Torr, E. E., Mohd Jamili, N. H., Bosquillon, C., Sayers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Differentiated+Human+Bronchial+Epithelial+Cell+Culture+Systems+for+Asthma+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allerg%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Differentiated Human Bronchial Epithelial Cell Culture Systems for Asthma Research.</a> Journal of Allerg. 2012, 11(2012).</li>
<li>Blume, L. F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+corrected+transepithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+measurement+to+quantify+rapid+changes+in+paracellular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmazi%22%5BJournal%5D)">Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability.</a> Pharmazi. , 19-24 (2010).</li>
<li>Chhin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+beating+recovery+in+deficient+human+airway+epithelial+cells+after+lentivirus+ex+vivo+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetic%22%5BJournal%5D)">Ciliary beating recovery in deficient human airway epithelial cells after lentivirus ex vivo gene therapy.</a> PLoS genetic. 5, e1000422(2009).</li>
<li>Jiao, J., Meng, N., Wang, H., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+nasal+epithelial+cells+grown+as+explant+outgrowth+cultures+or+dissociated+tissue+cultures+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Me%22%5BJournal%5D)">Comparison of human nasal epithelial cells grown as explant outgrowth cultures or dissociated tissue cultures in vitro.</a> Front Me. 7, 486-491 (2013).</li>
<li>Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+reproductive+toxicity+of+tobacco+smoke+and+its+constituents%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+defects+research.+Part+C%2C+Embryo+today+%3A+review%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of reproductive toxicity of tobacco smoke and its constituents.</a> Birth defects research. Part C, Embryo today : review. 84, 61-72 (2008).</li>
<li>Port, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke+induces+CYP1B1+in+the+aerodigestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesi%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke induces CYP1B1 in the aerodigestive tract.</a> Carcinogenesi. 25, 2275-2281 (2004).</li>
<li>Hoeng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+network-based+approach+to+quantifying+the+impact+of+biologically+active+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Toda%22%5BJournal%5D)">A network-based approach to quantifying the impact of biologically active substances.</a> Drug Discov Toda. 17, 413-418 (2012).</li>
<li>Iskandar, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+approaches+evaluating+the+perturbation+of+xenobiotic+metabolism+in+response+to+cigarette+smoke+exposure+in+nasal+and+bronchial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+In%22%5BJournal%5D)">Systems approaches evaluating the perturbation of xenobiotic metabolism in response to cigarette smoke exposure in nasal and bronchial tissues.</a> Biomed Res In. 2013, 512086(2013).</li>
<li>Karp, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiated+human+airway+epithelia.+Methods+for+establishing+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biolog%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures.</a> Methods in molecular biolog. 188, 115-137 (2002).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ISO+3402%3A+Tobacco+and+tobacco+products+--+Atmosphere+for+conditioning+and+testing%22">ISO 3402: Tobacco and tobacco products -- Atmosphere for conditioning and testing</a>. , International Organization for Standardization. (1999).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+Language+and+Environment+for+Statistical+Computing%22">R: A Language and Environment for Statistical Computing</a>. , The R Core Team. (2011).</li>
<li>Gautier, L., Moller, M., Friis-Hansen, L., Knudsen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+mapping+of+probes+to+genes+for+Affymetrix+chips%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatic%22%5BJournal%5D)">Alternative mapping of probes to genes for Affymetrix chips.</a> BMC Bioinformatic. 5, 111(2004).</li>
<li>Hermida, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confero%3A+an+integrated+contrast+data+and+gene+set+platform+for+computational+analysis+and+biological+interpretation+of+omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomic%22%5BJournal%5D)">Confero: an integrated contrast data and gene set platform for computational analysis and biological interpretation of omics data.</a> BMC genomic. 14, 514(2013).</li>
<li>Thomson, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+biological+impact+using+transcriptomic+data+and+mechanistic+network+models%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+applied+pharmacolog%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of biological impact using transcriptomic data and mechanistic network models.</a> Toxicology and applied pharmacolog. 272, 863-878 (2013).</li>
<li>Teff, Z., Priel, Z., Gheber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forces+applied+by+cilia+depend+linearly+on+their+frequency+due+to+constant+geometry+of+the+effective+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journa%22%5BJournal%5D)">The forces applied by cilia depend linearly on their frequency due to constant geometry of the effective stroke.</a> Biophysical journa. 94, 298-305 (2008).</li>
<li>Hilgendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+versus+Caco-2%2FHT29-MTX+co-cultured+cell+lines%3A+permeabilities+via+diffusion%2C+inside-+and+outside-directed+carrier-mediated+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sc%22%5BJournal%5D)">Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport.</a> J Pharm Sc. 89, 63-75 (2000).</li>
<li>Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+airway+ciliary+beat+frequency+by+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiolog%22%5BJournal%5D)">Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH.</a> The Journal of physiolog. 560, 519-532 (2004).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+and+differences+between+smoking-related+gene+expression+in+nasal+and+bronchial+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+genomic%22%5BJournal%5D)">Similarities and differences between smoking-related gene expression in nasal and bronchial epithelium.</a> Physiological genomic. 41, 1-8 (2010).</li>
</ol>

Cette étude a été financée par Philip Morris International.

Ici, nous avons démontré l&#39;applicabilité de bronchique organotypique humaine et modèles de tissus nasaux pour évaluer l&#39;impact d&#39;une exposition répétée CS. Comme une alternative à l&#39;expérimentation animale, un certain nombre de systèmes d&#39;exposition ont été élaborées pour les évaluations toxicologiques de l&#39;exposition d&#39;aérosol in vitro (par exemple., Vitrocell, Cultex, ALICE, etc.). Ces modules d&#39;exposition peuvent également être utilisés pour une évaluation toxicologique des polluants atmosphériques, les particules en suspension, les nanoparticules, etc. Dans cette étude, nous avons utilisé le système Vitrocell qui peut accueillir jusqu&#39;à 48 échantillons différents simultanément, ce qui permet pour les grandes expériences à grande échelle et une plus faible variabilité entre les traitements. Pour chaque exposition aérosol in vitro, le risque de contamination de la culture de tissu demeure un risque majeur dont l&#39;atténuation exige une manipulation soignée des cultures de tissus tout au long des expériences. Mesure de dépôt de particules en temps réel sur le cours de la microbalance électroniquexposition expérience permet de surveiller que les doses CS générés par le système d&#39;exposition sont conformes aux attentes. Pour assurer la précision du dépôt de particule mesurée, mise en place correctement la mesure en ligne avant l&#39;exposition est critial, par exemple, la mise en place de l&#39;échelle à 0. En outre, en raison de la différence entre les zones de la microbalance (cm 2) et le insert de culture de tissu (0,33 cm 2), on a ajusté le calcul final de la zone de l&#39;insert de culture: seulement 33% du dépôt sur ​​la microbalance reflète le dépôt effectif dans l&#39;insert de culture. Mesure de TEER de vérifier la fonctionnalité de barrière étanche jonction et d&#39;évaluer la perturbation de la couche épithéliale est une procédure relativement facile à mettre en œuvre, que nous avons rapporté ici. Cependant, parce que les modèles de tissus bronchiques et nasales les contiennent des cellules caliciformes intercalées mucus production, lave-apicale doit être effectuée avant que les AME TEERme-. Le lavage apicale est essentiel parce que la présence de la couche de mucus et la variabilité de son épaisseur peut biaiser la mesure de TEER, interférer avec l&#39;impact de l&#39;exposition CS. Cette notion est en accord avec ce qui a été rapporté par Hilgendorf et ses collègues, dans lequel la perméabilité des cellules Caco-2 a été affectée par la co-culture avec la lignée cellulaire gobelet mucus produisant HT29 23. Le mucus doit être lavé avant la mesure TEER, parce laver apicale juste avant l&#39;exposition peut interférer avec les réponses tissulaires à CS. Par conséquent, la mesure est effectuée trois jours avant l&#39;exposition, et non juste avant l&#39;exposition. Nous avons montré que l&#39;activité CYP1A1 / CYP1B1 pourrait être mesurée à partir des modèles de culture organotypiques après exposition CS bien que l&#39;activité a été que modestement augmenté de CS. Ce signal faible peut être amplifié par une incubation plus longue du substrat CYP1A1 / de 1B1 (ie., La luciférine-FEC), par exemple pour24 heures (données non présentées). Une des limites de la mesure de l&#39;activité de CYP dans le présent travail est l&#39;absence de normalisation au niveau de la protéine CYP ou de la numération cellulaire, qui pourraient être prises en considération pour de futures études pour se assurer que la modification de l&#39;activité enzymatique ne est pas influencée par la modification de l&#39;une ou l&#39;autre niveau de la protéine ou du nombre de cellules. Nous avons signalé que l&#39;exposition CS a inhibé la ciliaire battre à la fois dans l&#39;nasale et modèles de tissus bronchiques. Des observations similaires ont été faites dans des modèles différents mammifères et non mammifères 12. Pour battement ciliaire mesure, en veillant à ce que les tissus sont manipulés et traités d&#39;une manière similaire est critique, par exemple si le changement moyen est mis en oeuvre, il doit être appliqué pour tous les échantillons. Sutto et ses collègues ont rapporté que le pH affecté le ciliaire mammifère battant fréquence 24. Ainsi, lorsque l&#39;on compare battant fréquences entre les cellules traitées avec différentes compunds / mélanges, pHajustement doit être considérée pour réduire au minimum la variabilité de la mesure de battements ciliaires. En outre, la température à laquelle la mesure est effectuée est également essentiel que la fréquence de battement ciliaire diminue lorsque la température diminue. Pour minimiser la variabilité due à ces changements, un incubateur stade supérieur, équipées avec la température, de CO 2, et contrôle de l&#39;humidité a été utilisé dans cette étude. Malgré cela, nous avons observé que le battement ciliaire fréquences dans les tissus bronchiques après l&#39;exposition CS était très variable (ie., Augmenter en un insert et diminuer dans l&#39;autre insert), ce qui suggère que le battement ciliaire est juste très perturbé après l&#39;exposition. En revanche, nous avons observé l&#39;absence d&#39;mesurables fréquences de battement ciliaire dans le tissu nasal après exposition CS, ce qui suggère que la réponse du tissu nasal est plus sensible et cohérente. Ce est en accord avec une précédente publication montrant que le tissu nasal a une capacité inférieure à détoxifier quepar rapport à 25 la bronche. Enfin, nous avons montré que l&#39;expression du gène de profilage de la bronchique organotypique et modèles de tissus nasaux exposés à CS pourrait démontrer un impact de CS sur le métabolisme des xénobiotiques. Fait intéressant, la modification observée dans le métabolisme des xénobiotiques dans le bronchique et nasale organotypique des modèles in vitro exposé à CS qui ressemblent à de la situation in vivo chez les fumeurs comme on le verra plus en détail dans une publication précédente 15. Pour les analyses de l&#39;expression génique, en utilisant l&#39;instrument robotisé fait une analyse à haut débit possible. De plus, la manipulation robotisée automatique augmente encore la cohérence et la précision des résultats d&#39;expression de gène. Néanmoins, la collecte rapide des échantillons de tissu est critique pour éviter la dégradation de l&#39;ARN au cours de l&#39;extraction de l&#39;ARN. Le traitement de l&#39;ARN et des approches transcriptomiques décrits ici peuvent également être appliqués à des échantillons de tissus in vivo.

Les poumons sont exposés directement et constamment à de l’air inhalé qui peut contenir divers toxiques tels que des polluants et des constituants de la fumée de cigarette (CS). L’étude de l’impact de l’exposition à ces substances toxiques sur les tissus respiratoires est plus informative lorsqu’elle est effectuée d’une manière qui ressemble à une exposition in vivo. Par rapport aux cultures cellulaires immergées 2D classiques (par exemple, les cellules épithéliales bronchiques humaines normales (NHBE)), les modèles de tissus organotypiques 3D récapitulent mieux les aspects morphologiques, physiologiques et moléculaires de l’épithélium des voies respiratoires humaines in vivo1,2 : les modèles de tissus 3D contiennent la diversité des types de cellules observés in vivo, y compris les cellules épithéliales différenciées, les cellules ciliées et non ciliées, les cellules caliciformes et les cellules basales. Ils ont des jonctions serrées fonctionnelles et présentent un phénotype mucociliaire 1-3. De plus, les cultures peuvent être cultivées sur une membrane poreuse perméable, dans une interface air-liquide, permettant une exposition directe à l’aérosol du côté apical (alors que le côté basolatéral est immergé dans le milieu de culture) 3-5. Dvorak et ses collègues ont rapporté que les profils d’expression génique des modèles de tissus bronchiques étaient similaires à ceux obtenus à partir de brossages bronchiques humains 3. De plus, Mathis et ses collègues ont montré que les réponses de ces modèles tissulaires à la CS étaient similaires aux différences observées entre les cellules épithéliales bronchiques obtenues chez les fumeurs et les cellules obtenues chez les non-fumeurs 6. Enfin, étant donné que les modèles de tissus bronchiques pourraient être cultivés pendant plusieurs mois 4,5, ils pourraient potentiellement être utilisés pour examiner les effets d’une exposition à long terme des éléments testés. 
Les évaluations de cytotoxicité sont des paramètres courants mesurés à la suite d’agressions chimiques ou pour évaluer la toxicité de composés ou de mélanges spécifiques. Par exemple, l’intégrité de la membrane peut être mesurée par un dosage luminescent et permet de mesurer un effet cytotoxique dose-dépendant sur la culture cellulaire 7. Cependant, pour évaluer les effets physiopathologiques des composés à des concentrations subtoxiques, d’autres paramètres doivent être mesurés. Par exemple, l’intégrité tissulaire déterminée à l’aide du test de résistance électrique transépithéliale (TEER) garantit la fonctionnalité des jonctions serrées et surveille la perturbation de la couche épithéliale 8,9. La fréquence des battements ciliaires permet également de mesurer les effets liés à la CS sur les tissus respiratoires. Une fréquence de battement normale pour la muqueuse des cils bordant les voies respiratoires supérieures et inférieures est importante pour se protéger contre les infections des voies respiratoires 10. Chacune des cellules épithéliales cylindriques ciliées de l’épithélium respiratoire a 200 à 300 cils battant à une fréquence particulière pour éliminer les agents infectieux ou les particules inhalées piégées dans le mucus libérées par les cellules caliciformes intercalées 11. Le CS contient des produits chimiques qui peuvent inhiber le battement ciliaire 12, ce qui réduit la protection des voies respiratoires. Ce travail montre que le battement ciliaire peut être mesuré dans des modèles de tissus organotypiques. Cette approche permet d’évaluer si les cellules épithéliales présentent leur fonction normale dans la culture de tissus organotypiques. Le CS active également les réponses métaboliques xénobiotiques dans les voies respiratoires pour métaboliser les constituants de la fumée de tabac 13. L’activité des enzymes métaboliques xénobiotiques de phase I, CYP1A1 et CYP1B1, des modèles tissulaires peut être mesurée. De plus, comme indiqué précédemment, l’expression génique globale peut être mesurée dans les modèles de tissus bronchiques organotypiques 6,14,15. Une approche de données transcriptomiques et de biologie des systèmes basée sur un réseau est exploitée pour évaluer l’impact de la CS sur le métabolisme xénobiotique 15. 
Les méthodologies utilisées pour exposer des modèles de tissus bronchiques et nasaux organotypiques 3D à la CS grand public à l’aide d’un système d’exposition in vitro et pour mesurer les réponses tissulaires à cette exposition par rapport à l’exposition à l’air frais (contrôle) sont détaillées ici.

<table><tbody><tr><td>MucilAir-fibroblastes humains-bronchie</td><td>Epithelix S&aacute ; rl, Genève, Suisse</td><td>http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/</td><td></td></tr> <tr><td>MucilAir Culture Medium</td><td>Epithelix S&aacute ; rl, Genève, Suisse</td><td>http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/</td><td></td></tr> <tr><td>VITROCELL</td><td>VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Allemagne</td><td>http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R=</td><td></td></tr><tr><td>3R4F référence cigarette</td><td>Université du Kentucky</td><td>http://www2.ca.uky.edu/refcig/</td><td></td></tr> <tr><td>Machine à fumer carrousel à 30 ports SM2000</td><td>Philip Morris, Int.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caméra et logiciel CiliaMetrix</td><td>La Haute & Eacute ; cole de Gestion (HESGE), Genève, Suisse Microscope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMIL&nbsp ;</td><td>Leica, Heerbrugg, Suisse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Source de lumière LED</td><td>Titan Tool Supplies, Buffalo, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baguette électrode STX-2</td><td>World Precision Instruments</td><td>http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/</td><td></td></tr> <tr><td>EVOMXTM Voltohmmètre épithélial&nbsp ;</td><td>World Precision Instruments</td><td>http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/</td><td></td></tr> <tr><td>Réactif de détection de luciférine »</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrument MagNA Lyser&nbsp ;</td><td>Roche</td><td>http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66</td><td></td></tr><tr><td>chloroforme&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&region=</td><td></td></tr><tr><td>QIAcube&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>9001882</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>http://www.nanodrop.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Bioanalyseur Agilent 2100 »</td><td>Agilent</td><td>http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106</td><td></td></tr><tr><td>Affymetrix GeneChip Haut débit 3' IVT Express Kit</td><td>Affymetrix</td><td>http ://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit</td><td></td></tr><tr><td>Scanner 3000 7G&nbsp ;</td><td>Affymetrix</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation de l&#39;impact de l&#39;exposition répétée de organotypiques 3d bronchiques et nasales tissue culture modèles whole fumée de cigarette

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

La fumée de cigarette (CS) a un impact majeur sur la biologie pulmonaire et peut entraîner le développement de maladies pulmonaires telles que la bronchopneumopathie chronique obstructive ou le cancer du poumon. Pour comprendre les mécanismes sous-jacents du développement de la maladie, il serait important d’examiner l’impact de l’exposition au CS directement sur les tissus pulmonaires. Cependant, cette approche est difficile à mettre en œuvre dans les études épidémiologiques car le prélèvement de tissus pulmonaires est complexe et invasif. Par ailleurs, les modèles de culture tissulaire peuvent faciliter l’évaluation des impacts de l’exposition sur le tissu pulmonaire. Les cultures de cellules 2D submergées, telles que les cultures de cellules épithéliales bronchiques humaines normales (NHBE), ont traditionnellement été utilisées à cette fin. Cependant, ils ne peuvent pas être exposés directement à la fumée de la même manière que dans le cas d’une exposition in vivo. Les modèles de culture tissulaire 3D récemment développés reflètent mieux la situation in vivo car ils peuvent être cultivés à l’interface air-liquide (ALI). Leurs faces basales sont immergées dans le milieu de culture ; tandis que leurs côtés apicaux sont exposés à l’air. De plus, les cultures de tissus organotypiques qui contiennent différents types de cellules représentent mieux la physiologie du tissu in vivo. Dans ce travail, l’utilisation d’un système d’exposition in vitro pour exposer des modèles de tissus bronchiques et nasaux organotypiques humains à la CS grand public est démontrée. La fréquence des battements ciliaires et l’activité du cytochrome P450s (CYP) 1A1/1B1 ont été mesurées pour évaluer les impacts fonctionnels du CS sur les tissus. De plus, afin d’examiner les altérations induites par la CS au niveau moléculaire, des profils d’expression génique ont été générés à partir des tissus après l’exposition. Une légère augmentation de l’activité du CYP1A1/1B1 a été observée dans les tissus exposés au CS par rapport aux tissus exposés à l’air. Une approche de biologie des systèmes basée sur le réseau et la transcriptomique était suffisamment robuste pour démontrer des altérations du métabolisme xénobiotique induites par la CS qui étaient similaires à celles observées dans les cellules épithéliales bronchiques et nasales obtenues chez les fumeurs.

Dans les résultats décrits ci-dessous, les tissus étaient organotypiques cellules épithéliales humaines primaires isolées de santé, non-fumeurs, des donateurs et du Caucase ont été reconstitués en utilisant des fibroblastes 15. Bronchique 3D et modèles de tissus nasaux Dans bronchique vitro et modèles organotypiques nasales ressemblent au niveau cellulaire de l&#39;épithélium des voies respiratoires humaines (Figure 2). L&#39;exposition CS Bronchique organotypique et modèles de tissus nasaux peuvent être exposés de façon répétée à intégrer CS à l&#39;interface air-liquide. La procédure expérimentale de l&#39;exposition à la fumée utilisée pour les résultats illustrés ici est représenté sur la figure 1. Enregistrement du battement ciliaire Cilia battement a été enregistrée dans les tissus exposés à l&#39;air, comme illustré dans les vidéos. CS exposition a été associée à une réduction de la fréquence de battement ciliaire: le plus fort pic observé autour4 Hz dans le simulacre exposé et avant l&#39;exposition ne est pas observée plus longtemps après l&#39;exposition CS (Figure 3). Cette fréquence réduite rendrait les cils battant moins efficace pour éliminer le mucus et les agents infectieux 22. Mesure de TEER et CYP1A1 activité / 1B1 TEER a été mesurée 48 h après la dernière exposition pour assurer le tissu est encore fonctionnel. CYP1A1 / 1B1 activité a également été mesurée 48 h après la fin de l&#39;exposition comme illustré sur la Figure 1. Les valeurs TEER dans les tissus CS-exposées étaient pas significativement différentes par rapport aux tissus de l&#39;air exposé confirmant qu&#39;il n&#39;y a pas d&#39;effet cytotoxique important de fumée à cette concentration. Au post-exposition 48 h, CYP1A1 / 1B1 activité des tissus a été légèrement augmenté, indiquant une modeste augmentation de mécanisme de défense de tissu après l&#39;exposition (Figure 4). Gene profils d&#39;expression et des systèmes basés sur le réseau biologie approche pour étudier l&#39;impact de l&#39;exposition CS sur l&#39;altération du métabolisme des xénobiotiques Les tissus ont été prélevés à des moments post-exposition 48 h. Par la suite, l&#39;analyse de puces à ADN a été réalisée pour générer des profils d&#39;expression génique de la CS et des tissus exposés à l&#39;air. Impact de l&#39;exposition sur le métabolisme des xénobiotiques CS a été étudiée en utilisant une approche basée sur le réseau biologie des systèmes à effet de levier à partir des profils d&#39;expression génique et comme rapporté plus tôt 15. En utilisant une approche biologie des systèmes en réseau montre que les effets de l&#39;exposition CS au niveau des nœuds de réseau fédérateur dans le modèle de réseau de métabolisme des xénobiotiques étaient bien corrélées entre le in vitro et in vivo des ensembles de données (figure 5). En revanche, au niveau de chacun des changements d&#39;expression génique, le manque de corrélation n&#39;a été observée entre le in vitro (CS-exposé vs. air-exposée) et in vivo contre les non-fumeurs (fumeurs). Figure 1. Représentation schématique de la procédure exposition répétée de CS pour les modèles de tissus bronchiques organotypiques Abréviations:. CYP, cytochrome P450; CS, la fumée de cigarette; TEER, résistance électrique transépithéliale. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig2.jpg" /> Figure 2. organotypiques bronchique et les modèles de culture de tissus épithéliales nasales. Dessinée illustrant le bronchique (A) et nasal (B) la culture tissulaire insert à l&#39;interface air-liquide. Les modèles in vitro contiennent des cellules ciliées indiquées dans la couche apicale des cellules colorées hématoxyline &amp; éosine (C pendant bronchique, D) pour l&#39;administration nasale 15 comme indiqué précédemment. Les modèles ont été co-cultivées avec des fibroblastes qui sont importantes<html> pour la croissance et la différenciation des cellules épithéliales (indiqué par des flèches). Coloration des marqueurs de la lignée des voies respiratoires: p63 (E pour bronchique, F pour nasale) et MUC5AC (G pour bronchique, H pour nasale) sont présentés comme indiqué précédemment 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig2large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig3.jpg" /> Figure 3. Fréquence Battre Cilia. Cilia fréquence de battement (CBF) a été mesuré dans l&#39;air et exposées dans la culture avant et après l&#39;exposition. Une diminution de la CBF a été observée après l&#39;exposition CS (résultats représentatifs de deux insert sont présentés comme une réplique (R1) et répliquent 2 (R2)). ad / 52325 / 52325fig4.jpg &quot;/&gt; Figure 4. Mesure de l&#39;activité CYP1A1 / CYP1B1 et TEER. Panneaux gauche indiquent l&#39;activité CYP1A1 / bronchique dans la CYP1B1 (A) et nasal (B) modèles de tissus. Panneaux de droite indiquent la mesure de la TEER bronchique (C) et nasal (D) modèles de tissus. Moyens ± SD sont présentés. Abréviations: CS, la fumée de cigarette; CYP, cytochrome P450; TEER, résistance électrique transépithélial; AVC, unité de luminescense relative. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig5.jpg" /> Figure 5. Les systèmes basés sur le réseau approche de biologie pour l&#39;évaluation de l&#39;exposition CS dans le cadre du métabolisme des xénobiotiques de l&#39;impact. Les changements de niveaux d&#39;expression des gènes ont été utilisés pour calculer l&#39;activation du noeud épine dorsale du modèle de réseau Xénobiotique métabolisme (A) </<html> strong&gt; tel que rapporté dans une publication précédente 15. La figure de droite illustre le concept de la quantification des noeuds du squelette, aussi connu comme &quot;valeur de réseau fédérateur différentiel», en utilisant l&#39;approche NPA. Les ovales bleues représentent l&#39;activité des noeuds de réseau fédérateur (par exemple., La couche fonctionnelle) et les billes vertes représentent l&#39;expression des gènes (ce est à dire., La couche de transcription). Impacts d&#39;une exposition dans les tissus bronchiques CS organotypiques (in vitro, CS-exposés vs exposées à l&#39;air) au 48 h de post-exposition ont été comparés à ceux du tabagisme sur l&#39;épithélium bronchique humain prélevé par bronchoscopie et nasale épithéliale par burshing cornet inférieur (GSE16008 ) (in vivo, les fumeurs vs les non-fumeurs) (B). Encarts, la corrélation de l&#39;expression du gène change entre le in vitro et in vivo des ensembles de données. Abréviations: CS, la fumée de cigarette; NPA, l&#39;amplitude de perturbation du réseau.ove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig5large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

L’objectif de ce protocole est d’exposer des modèles de tissus bronchiques et nasaux organotypiques humains en 3D à la fumée de cigarette principale (CS) à l’interface air-liquide. L’impact de la CS sur les tissus est ensuite étudié à l’aide d’un test d’activité du cytochrome P450, d’une mesure du battement des cils et d’une approche de biologie des systèmes.

Évaluation de l&#39;impact de l&#39;exposition répétée de organotypiques 3D bronchiques et nasales Tissue Culture modèles Whole fumée de cigarette

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

L’objectif général de cette procédure est d’évaluer l’impact de l’exposition répétée de modèles de culture de tissus bronchiques et nasaux organotypiques 3D à de la fumée de cigarette entière. Ceci est accompli en cultivant d’abord des modèles de culture de tissus organotypiques, bronchiques et nasaux à l’interface air-liquide. La deuxième étape consiste à générer un aérosol à l’aide d’une machine à fumer et à exposer les cultures de tissus conformément au plan expérimental dans un système d’exposition.Ensuite, l’impact de l’exposition est évalué en mesurant la fréquence des battements ciliaires et l’intégrité tissulaire de la culture. La dernière étape consiste à mesurer les échanges de transcriptome induits par l’aérosol à l’aide de la technologie des microréseaux. En fin de compte, une approche de biologie des systèmes basée sur un réseau a été utilisée pour montrer l’impact de la fumée de cigarette entière sur la culture tissulaire.Le principal avantage de ces techniques par rapport aux méthodes existantes en toxicologie respiratoire est que les approches sont alignées sur les exigences des organismes de réglementation pour trouver des alternatives aux tests sur les animaux, elles permettent d’évaluer les effets d’une exposition à court terme à la fumée de cigarette sur des cellules cultivées à l’interface illiquide, imitant les conditions se produisant dans les voies respiratoires humaines. Pour commencer l’expérience, ajoutez 0,7 millilitre de milieu de culture préchauffé dans chaque puits d’une plaque stérile à 24 puits. Ensuite, retirez l’emballage des tissus et transférez les inserts de culture tissulaire dans la plaque à 24 puits fraîchement préparée.Conservez la culture tissulaire dans un incubateur et remplacez le milieu tous les deux jours pendant le changement de milieu. Examinez les tissus au microscope optique pour vous assurer qu’ils sont exempts de contamination et qu’il n’y a pas de fuite de fluide. Trois jours avant les expériences d’exposition, lavez la face apicale de la culture tissulaire avec 200 microlitres de milieu de culture.Ensuite, préchauffez la chambre climatique du système in vitro et le module de base de culture à 37 degrés Celsius. Une fois qu’il est chauffé, remplissez le module de base de culture avec 17,5 millilitres de substrat par rangée. Retirez les tissus de l’incubateur et transférez les inserts de culture tissulaire de la plaque de culture vers le module de base de culture du système d’exposition in vitro.Couvrez ensuite le module de base de culture avec un couvercle en verre. Transférez les tissus dans la chambre climatique pour les exposer à la fumée de cigarette principale ou au cs. Générez de la fumée de cigarette à l’aide d’une machine à fumer à carrousel calibrée à 30 ports.Fumez les cigarettes à une longueur standard d’environ 35 millimètres à 55 millilitres. Bouffée sur deux secondes, deux fois par minute, et huit secondes de temps d’échappement de la pompe. La fumée de cigarette principale générée est accumulée et libérée dans le système d’exposition in vitro.Exposez les mouchoirs pendant six à sept minutes. Après avoir transféré les tissus dans une plaque de culture, remettez-les dans l’incubateur pendant une heure. Retirez les plaques de culture tissulaire de l’incubateur et laissez-les sous le capot à température ambiante pendant 30 minutes pour stabiliser le battement CLIA.Après stabilisation, observez les tissus sous un microscope optique connecté au logiciel de cliométrie. Ensuite, enregistrez la fréquence des battements ciliaires, en mesurant la fréquence toutes les trois secondes pendant une minute, 48 heures. Après l’exposition, ajoutez 200 microlitres de milieu de culture sur la face apicale des tissus épithéliales bronchiques humains et mesurez la résistance des tissus en insérant une électrode baguette dans le milieu basal et dans le milieu nouvellement ajouté sur la face apicale de la culture tissulaire sans toucher le tissu.Après les mesures, retirez délicatement le milieu de la face apicale des cultures de tissus à l’aide d’une pipette à pasteur reliée à une pompe à vide et remettez les tissus dans l’incubateur. Pour mesurer l’activité enzymatique du cytochrome P quatre 50, préparez une nouvelle plaque avec un substrat Lucifer et CEE préalablement préparé, transférez les inserts dans ce couvercle de plaque et incubez les inserts tissulaires pendant la nuit. Après l’incubation, transférez 50 microlitres de milieu de culture de chaque insert tissulaire dans une plaque luminomètre blanche opaque de 96 puits à température ambiante.Ajoutez ensuite 50 microlitres de réactif de détection Lucifer dans chaque puits et incubez la plaque à température ambiante pendant 20 minutes. Une fois l’incubation terminée, mesurez la luminescence à l’aide du luminomètre. Récupérez la plaque d’inserts de tissu organotypique 3D de l’incubateur et lavez chaque insert sur la plaque trois fois avec du PBS froid et aspirez le PBS avec une pipette passée entre les lavages.Après le dernier lavage, aspirez le PBS et couvrez la plaque pour éviter que l’insert ne sèche. Ensuite, découpez la membrane d’insertion pour chaque insert de la plaque jusqu’à ce que la membrane repose à plat sur la lame. Transférez le tissu de la lame dans le tube d’homogénéisation et vissez le couvercle sur le tube.Ensuite, secouez-le, tourbillonnez-le et placez-le sur de la glace sèche. Décongelez et broyez des échantillons avec l’instrument d’homogénéisation à 6 000 tr/min pendant 45 secondes. Laisser agir cinq minutes à température ambiante, puis ajouter 140 microlitres de chloroforme à l’échantillon et agiter à nouveau pendant 15 secondes.Transférez l’échantillon entier du tube d’homogénéisation dans un tube à verrouillage de phase. Placez-le sur un shaker thermique et secouez-le pendant deux minutes à 1400 tr/min à température ambiante. Laissez ensuite reposer deux minutes à température ambiante.Une fois l’agitation terminée, faites tourner le tube pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius à 12 000 g.Transférez le surnageant dans un nouveau tube de deux millilitres. Poursuivre avec la précipitation de l’ARN, le lavage, la suspension et la purification. Une fois extraits, les ARN sont contrôlés en termes de qualité.Pour évaluer la quantité et l’intégrité, préparer le système de manipulation des liquides et la synthèse des cibles. Placez l’ARN extrait. Les plaques et tous les réactifs nécessaires et l’usure de laboratoire dans le robot.Tout d’abord, les concentrations d’ARN seront normalisées. Ensuite, le jeu sera modifié pour les étapes suivantes, de l’amplification à l’étiquetage, à la purification et à la fragmentation. Ensuite, le mélange d’hybridation est ajouté à 33 microlitres d’ARN A fragmenté et marqué, dénature les échantillons et pré-humidifie le réseau avec 200 microlitres de pré-hybridation.Mélange à partir du kit de lavage et de teinture hybride. Placez ensuite la puce dans le four d’hybridation réglé à 45 degrés Celsius et 60 tr/min pendant 10 minutes. Retirez le tampon de pré-hybridation et chargez 200 microlitres de l’échantillon.Incuber l’enceinte pendant 16 heures à 45 degrés Celsius et 60 tr/min au four. Aspirez le cocktail de la puce et remplissez le microarray avec 250 microlitres de tampon de lavage a. Ouvrez le logiciel et exécutez fluidics à partir de la barre de menu du logiciel.Sélectionnez le module qui vous intéresse et le programme prime four 50 pour chaque module. Attribuez la bonne puce à chaque module en scannant le code-barres de la puce et placez les puces dans le système fluidique. Enfin, assurez-vous que le scanner est chaud.Chargez ensuite la puce dans le chargeur automatique du scanner et scannez la puce à microréseau. La fréquence des battements CELIA ou CBF du tissu nasal a été mesurée avant et après l’exposition à l’air ou à la fumée de cigarette ou au cs. Le CBF et le tissu nasal étaient plus lents après l’exposition au cs.Une fréquence de battement plus faible du CLIA réduit l’efficacité de l’élimination du mucus et des agents infectieux. Des analyses de microréseaux ont été effectuées pour étudier les impacts de l’exposition aux CS dans des modèles de tissus organotypiques, bronchiques et nasaux. 48 heures après l’exposition.Cet impact sur la césarienne in vitro a été comparé à l’impact du tabagisme sur le tissu épithélial bronchique humain recueilli respectivement par bronchoscopie et par brossage épithélial nasal. La biologie des systèmes basée sur les réseaux montre une corrélation positive entre les nœuds de base des ensembles de données in vivo et in vitro. En tentant cette procédure, il est important de se rappeler qu’il s’agit d’un domaine de recherche en plein développement.D’une part, il y a deux éléments clés : une plateforme d’exposition aux aérosols à façon bien caractérisée, et d’autre part, un système expérimental pertinent qui peut consister en un modèle de culture tissulaire tridimensionnel qui imite le mieux l’architecture spécifique, les indices biochimiques et mécaniques, ainsi que l’interaction cellulaire du microenvironnement pertinent pour le tissu ou l’organe cible. En cours d’enquête.

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