Human cellules souches pluripotentes Basé Toxicité pour le développement dosages pour Chemical dépistage et la biologie des systèmes de sécurité de génération de données

L’objectif général de cette procédure est de décrire deux systèmes d’essais de toxicité pour le développement in vitro basés sur des cellules souches embryonnaires humaines et des études de transcriptome. Ceci est accompli en cultivant d’abord des cellules souches embryonnaires humaines sur des fibroblastes embryonnaires de souris. La deuxième étape consiste soit à laisser les cellules souches embryonnaires humaines former des corps d’Embry dans lesquels elles peuvent générer des cellules des trois couches germinales, soit à les différencier en progéniteurs neuroectodermiques.

Ensuite, les corps embryonnaires ou progéniteurs neuroectodermiques sont traités avec des composés d’intérêt à différentes concentrations au cours de la différenciation. Les dernières étapes consistent à évaluer la viabilité des cellules et à isoler l’ARN. En fin de compte, l’analyse du transcriptome est utilisée pour montrer les changements dans l’expression de l’ARN des cellules traitées avec un composé d’intérêt par rapport aux cellules témoins non traitées. Sur la base de cellules souches néonicotinoïdes humaines et de macro-zones d’ADN, nous avons établi une méthodologie in vitro permettant de surveiller les effets de toxicité pertinents pour le développement humain.

La méthodologie peut être appliquée par l’industrie pharmaceutique et chimique pour le dépistage de l’innocuité de médicaments et de toxiques environnementaux potentiels. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la toxicité pour le développement, telles que l’effet des produits chimiques sur le développement neurologique très précoce. Pour commencer, décongelez le supplément de milieu de cellules souches à température ambiante et ajoutez-en 100 millilitres dans 400 millilitres de milieu de cellules souches basales.

Ensuite, décongelez la matrice de la membrane basale sur de la glace, puis ajoutez le volume supplémentaire de matrice dans 24 millilitres de dmm réfrigéré. F 12 milieu basal recommandé par le fabricant, mélanger une solution en pipetant doucement de haut en bas, puis ajouter deux millilitres du mélange dans 12 plaques distinctes de six centimètres. Incuber les plaques à température ambiante pendant une heure pendant que la matrice enrobe les plaques.

Retirez ensuite le milieu et ajoutez deux millilitres de milieu de cellules souches. Ensuite, retirez quatre plaques confluentes de l’incubateur contenant de l’embryon humain. H neuf cellules cultivées sur des couches nourricières de fibres embryonnaires de souris qui sont préparées comme décrit dans le protocole intext d’accompagnement sous un stéréoscope, à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre et retirent les colonies différenciées de la plaque.

Les colonies indifférenciées ont des bords bien définis et les cellules sont compactes, tandis que les cellules différenciées commencent à se propager à partir des bords et leurs cellules sont de plus grande taille. Aspirez le milieu et lavez les cellules avec quatre millilitres de PBS. Ajoutez ensuite deux millilitres de milieu de cellules souches avec le huit d’un stéréoscope.

Coupez les colonies en six à neuf morceaux, chacun avec une aiguille de calibre 26, et grattez les touffes avec des pointes de pipette d’un millilitre. Récupérez délicatement les colonies coupées dans un tube de faucon de 50 millilitres et granulez-les à 200 G pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez le snat et remettez les cellules en suspension dans 12 millilitres de milieu de cellules souches.

Placez 20 microlitres de suspension cellulaire sur une lame de verre et comptez le nombre d’amas au microscope. Ajustez la concentration de la suspension à 150 mottes par millilitre, puis ajoutez deux millilitres de suspension dans chaque plaque de six centimètres. Déplacez les plaques d’avant en arrière et d’un côté à l’autre pour répartir uniformément les cellules, puis incubez les plaques dans un incubateur de culture cellulaire tous les deux jours.

Après avoir retiré les colonies différenciées, ajoutez 40 microlitres d’une solution stérile de copolymère séquencé à 5 % dans chaque puits d’une plaque Vbo à 96 puits et laissez-la incuber à température ambiante pendant 45 minutes. Retirez une plaque confluente contenant des colonies de l’incubateur et choisissez toutes les colonies différenciées au microscope stéréoscopique avec une pointe de pipette d’un millilitre. Ensuite, aspirez le milieu de la plaque et lavez doucement les cellules avec quatre millilitres de PBS.

Ensuite, ajoutez deux millilitres de milieu de différenciation aléatoire dans chaque plaque. Utilisez l’outil de passage pour couper les neuf colonies de cellules H en touffes de taille uniforme. Grattez les touffes à l’aide d’un grattoir cellulaire et recueillez-les doucement dans une centrifugeuse à tube de faucon de 50 millilitres.

La colonie s’agglomère à 200 G pendant cinq minutes, puis aspire le piège et remet en suspension la cellule et le milieu de différenciation aléatoire à 1000 amas par millilitre. Ensuite, aspirez le copolymère séquencé de la plaque à 96 puits à fond en V À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 100 microlitres de suspension de colonie à chaque puits pour agréger les amas au fond des puits en forme de V en centrifugant la plaque à quatre degrés Celsius pendant quatre minutes à 400 G.Ensuite, placez une plaque dans l’incubateur pendant quatre jours à l’aide d’embouts de 200 microlitres d’alésage plus large. Retirez les corps embryonnaires de la plaque à 96 puits et placez-les dans une plaque carrée stérile de 122 millimètres.

Ensuite, utilisez une pipette sérologique stérile de 10 millilitres pour transférer les corps embryonnaires de la plaque carrée dans un tube de faucon de 15 millilitres. Laissez les corps embryonnaires se stabiliser pendant deux minutes, puis aspirez le snat et lavez les corps embryonnaires avec cinq millilitres de PBS. Encore une fois, attendez que les corps embryonnaires se déposent pendant deux minutes, puis aspirez le surnageant.

Cette fois, mettez les corps embryonnaires en suspension dans cinq millilitres de milieu de différenciation aléatoire. Ensuite, transférez les corps embryonnaires dans une plaque bactériologique de 10 centimètres et ajoutez 10 millilitres supplémentaires de différenciation aléatoire. Douleur moyenne. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius et 5 %CO2 sur un agitateur horizontal.

À 50 tr/min, les corps embryonnaires représentatifs sont montrés pour le cinquième jour, le neuvième et le 14e jour. Changez soigneusement le milieu tous les deux jours, en remplaçant les 15 millilitres par une différenciation aléatoire fraîche. Douleur moyenne. Pour évaluer l’effet d’un médicament sur la différenciation, commencez à ajouter le médicament au milieu au cinquième jour pendant 10 jours, comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement.

À l’aide d’une pipette stérile, prélevez les corps embryonnaires des plaques de 10 centimètres dans un tube de faucon de 15 millilitres. Laissez-les reposer pendant deux minutes, puis aspirez le surnageant. Lavez-les avec cinq millilitres de PBS et transférez-les dans un tube de 1,5 millilitre sans nucléases.

Laissez-les se stabiliser et aspirer la relance de la caisse claire. Mettez les corps embryonnaires en suspension dans un millilitre de réactif de triol et faites passer une solution à travers une aiguille de calibre 24 avec une seringue d’un millilitre environ 15 fois pour perturber les cellules. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de chloroforme à chaque échantillon.

Vortex brièvement le contenu, puis centrifuger les échantillons à 12 000 g pendant 15 minutes À quatre degrés Celsius, recueillir le surnageant dans des tubes de 1,5 millilitre sans perturber les autres couches. Ajoutez ensuite un volume égal d’éthanol réfrigéré à 70 % au surnageant et mélangez doucement le contenu en secouant. Transférez 700 microlitres du mélange dans une mini colonne de spin et suivez les instructions du fabricant pour purifier l’ARN lors de l’étape finale d’élution.

Appliquez 22 microlitres d’eau exempte de nucléases dans la colonne de centrifugation et centrifugez les tubes à 12 000 G pendant une minute. Retirez ensuite le tube de prélèvement et mettez l’ARN sur de la glace. Ajoutez un millilitre d’espace disque de préchauffage par fiole T 25 confluente de neuf cellules H, et incubez la fiole pendant neuf minutes à 37 degrés Celsius.

Ajoutez ensuite deux millilitres de préchauffage. Lavez le fluide jusqu’à ce que les cellules traitées soient déplacées et pipetez doucement de haut en bas cinq fois avec une pipette de cinq millilitres. Transférez la solution cellulaire dans un tube de faucon.

Ensuite, lavez le flacon avec neuf millilitres de produit de lavage et ajoutez-le dans le tube avec les cellules. PT le récolte ses cellules pendant trois minutes et demie à 500 G.Ensuite, retirez le filet et remettez les cellules en suspension dans 10 millilitres de produit de lavage. Appliquer à nouveau les cellules pendant trois minutes et demie à 500 G, puis retirer le supnatant et remettre les cellules en suspension dans quatre millilitres de milieu de cellules souches embryonnaires humaines, ajouter 0,5 millilitre de suspension cellulaire et 4,5 millilitres de milieu frais dans une fiole T 25 fraîche lavée au PBS contenant des fibroblastes embryonnaires de souris inactivés par voie mitotique.

Changez le milieu dans la fiole tous les jours. Enduire un plat de 10 centimètres de gélatine à 0,1 % de PBS et incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, récoltez des cellules souches embryonnaires humaines en retirant le milieu et ajoutez un millilitre d’acuta dans le ballon T 25 pendant que les cellules se détachent.

Ajoutez 6,6 millilitres de média froid à 330 microlitres de matrice de membrane basale congelée. Filtrez la solution à travers une crépine à cellules de 40 micromètres et utilisez un millilitre de solution filtrée pour couvrir chaque puits d’une plaque à six puits. Les cellules seront ensuite plaquées sur les plaques revêtues après l’incubation de 30 minutes des cellules embryonnaires humaines avec Accutane, arrêtez la réaction en ajoutant 1,5 millilitres de milieu Hess.

Grattez les cellules du ballon, puis ajoutez huit millilitres supplémentaires de milieu Hess. Produisez une solution unicellulaire en pipetant doucement de haut en bas avec une pipette de 10 millilitres pour filtrer les cellules à travers une crépine de 40 micromètres, puis centrifugez les cellules pendant trois minutes À 500 G, retirez le surnageant S et remettez les cellules en suspension dans 10 millilitres de cellules de spin moyen pendant trois minutes à 500 G. Retirez ensuite le surnageant et réutilisez-le. Suspendre les cellules dans 10 millilitres de milieu Hess S contenant l’inhibiteur de roche Y 2 7 6 3 2 à une concentration finale de 10 micromolaires.

Ensuite, retirez le surnageant de la plaque à vaisselle recouverte de gélatine, la suspension cellulaire sur la boîte recouverte de gélatine et incubez pendant exactement une heure à 37 degrés Celsius. Au cours de cette étape, l’hypoplaste se déposera sur les plaques recouvertes de gélatine où les cellules souches embryonnaires humaines resteront libres. Le temps de flottaison est crucial car une incubation longue entraînera un agglutination des cellules souches et une incubation courte n’éliminera que quelques-uns de ces fibroblastes lorsque les fibroblastes se sont attachés.

Utilisez le milieu dans la plaque pour laver doucement les cellules souches non adhérentes de la plaque. Lavez la plaque une deuxième fois avec 10 millilitres de milieu Hess et accumulez les cellules, centrifugez les cellules pendant trois minutes à 500 G, retirez le surnageant S résultant et remettez les cellules en suspension dans environ quatre millilitres de milieu conditionné contenant 10 micromolaires d’inhibiteur de roche Y 2, 7, 6, 3, 2 et 10 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance de fibroblaste deux. Ensuite, mélangez les cellules avec du bleu trian et comptez-les dans une plaque de cytomètre hémologique.

18 000 cellules par centimètre carré sur la plaque avant le sous-sol. Les plaques recouvertes de membrane recouvrent les cellules de 1,5 millilitre de milieu par puits et incubent à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après 24 heures, rafraîchissez le milieu Après 24 heures supplémentaires, remplacez le milieu par un milieu frais et conditionné complété par seulement 10 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance des fibroblastes 2 72 heures.

Après avoir ensemencé les cellules, changez le milieu pour un milieu de remplacement sérique knock-out. Ce point temporel est appelé jour zéro de différenciation. Rafraîchissez les cellules avec un milieu frais chaque jour pendant les trois prochains jours.

Lors du changement de milieu les quatrième et cinquième jours, ajoutez un milieu supplémenté à 25 % de N et un substitut de sérum à 75 %. Le sixième jour, récoltez les cellules pour l’analyse. Les corps embryonnaires peuvent être utilisés pour de nombreuses études différentes.

Voici un exemple d’étude de cytotoxicité montrant l’effet de concentrations variables de méthylmercure sur la viabilité des cellules. À partir de ce graphique, il a été déterminé que le point 24 micromolaire causait 10 % de la mort cellulaire et qu’une concentration de 1,61 micromolaire provoquait 50 % de la mort cellulaire après une exposition de 14 jours. Des ARN isolés à partir de corps embryonnaires de trois groupes de traitement au méthylmercure ont été analysés sur une puce à ADN pour examiner une grande variété de biomarqueurs.

Les personnes exposées au mercure micromolaire du point 25 sont indiquées en rouge. Les personnes exposées à une micromolaire de méthylmercure sont indiquées en bleu et l’ARN témoin est indiqué en vert. Cette carte d’analyse des composantes principales montre que les caractéristiques génétiques de chaque groupe de traitement varient considérablement les unes des autres : au total, plus de 276 gènes ont été modifiés plus de deux fois lorsqu’ils ont été exposés à la concentration micromolaire de méthylmercure.

30 de ces gènes ont également été modifiés par le groupe de concentration plus faible au point 25 micromolaires. Sur cette carte thermique, on peut voir que 233 des gènes modifiés dans le groupe de traitement d’une micromolaire étaient des gènes qui étaient régulés à la baisse et que seulement 43 étaient régulés à la hausse par le traitement. N’oubliez pas que travailler avec du triazole ou des fourmis en développement peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de lunettes septi, de gants résistants aux produits chimiques et l’exécution de tous les travaux liés au triol dans une hotte doivent toujours être prises en compte lors de l’exécution de cette procédure.

En suivant cette procédure. D’autres méthodes telles que la coloration, la formation de feros, qui peuvent mélanger la formation de votre tube, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’ancrage phénotypique.