Name: Une approche Cell biorapporteur entières pour évaluer transport et la biodisponibilité des contaminants organiques dans les systèmes insaturés eau (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: Découvrez une méthode de bioreporter cellulaire pour évaluer la biodisponibilité du fluorène dans les réseaux mycéliens. Cette technique utilise Burkholderia sartisoli et la microscopie confocale pour surveiller la dégradation des contaminants.

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Le financement par la Fondation allemande pour l’environnement (DBU) est reconnu. Les auteurs remercient Ute Kuhlicke pour son aide technique pour l’analyse CLSM et Birgit Würz, Rita Remer et Jana Reichenbach pour leur aide expérimentale qualifiée. Les auteurs tiennent à remercier tout particulièrement le professeur Jan Roelof van der Meer et le Dr Robin Tecon pour la discussion fructueuse et la fourniture de la souche biorapporteure. Il contribue au programme de recherche « Chemicals in the Environment » (CITE) de l’Association Helmholtz.

1. Préparation de plats, des diapositives et incubation Chambers <ol><li> Préparer le matériel suivant pour chaque microcosme: une grande boîte de Petri en plastique inférieure (d = 10 cm), une modification (voir l&#39;étape 1.2) petite boîte de Petri en plastique inférieure (d = 5 cm) avec des couvercles et une chambre de comptage diapositive avec trois cavités. </li><li> Prenez le nombre désiré de Petri parties inférieures plat (d = 5 cm). Enlever une partie du bord avec une scie pour se adapter exactement une diapositive (26 mm de longueur d&#39;arête). Pour stériliser le système, faire tremper Petri fond plat et les couvercles dans 70% d&#39;éthanol O / N et les sécher pendant au moins 2 heures dans une hotte à flux sous lumière UV. Rangez les boîtes de Pétri dans un récipient en plastique hermétiquement fermés, qui avait également été exposés à la lumière UV pendant 2 h. </li><li> Essuyez le nombre désiré de diapositives avec 70% d&#39;éthanol et de les sécher à l&#39;air. Enveloppez les lames dans du papier d&#39;aluminium et les mettre dans un four à moufle pendant 5 heures à 450 ° C pour éliminer d&#39;éventuelles contaminations. </li&gt; <li> Préparer chambres d&#39;incubation de verre munis de couvercles. Nettoyez-les avec 70% d&#39;éthanol et d&#39;exposer chambres ouvertes à la lumière UV pendant au moins deux heures dans une hotte à flux. NOTE: Pour les dessiccateurs (diamètre d&#39;environ 30 cm) avec des couvercles peut être utilisé à cet effet; chaque dessiccateur peut accueillir jusqu&#39;à dix configurations de microcosme. </li></ol> 2. Préparation des milieux et cultures <ol><li> Pour exécuter 20 microcosmes parallèles, obtenir 100 ml de milieu tryptone-levure modifiée (MTY) 14, environ 150 ml de 21C milieu minimal 16 (MM), 5 ml de milieu agar minimal (MMA; 0,5%, p / v), trois des plaques de gélose de dextrose de pomme de terre (PDA; 1,5%, p / v) pour P. ultimum, quatre plaques vierges, une plaque de PDA contenant 2 mg L -1 cycloheximide, quatre plaques d&#39;agarose (3%, poids / volume) contenant 0,3 g ml -1 charbon actif et 40 mg de la grippe en deux parties mg. </li><li> Préparez MTY contenant 50 mg L -1 de kanamycine (kanamycine est required pour maintenir la eGFP plasmide rapporteur) et MM contenant de l&#39;acétate 10 mM pour la culture bactérienne. Utilisez MM sans l&#39;acétate de préparer 0,5% de MMA pour l&#39;immobilisation des bactéries dans les microcosmes et versez plaques (chacune 20 ml) de 1,5% PDA pour la culture de Pythium ultimum et le microcosme configurations. </li><li> Inoculer un certain hyphes de P. ultimum sur trois plaques de PDA frais et incuber dans l&#39;obscurité à 25 ° C pendant environ 72 heures. Puis assurer que les plaques sont envahies par mycélium complètement fraîche et mousseuse. </li><li> Lancer deux cultures de B. sartisoli RP037-MCHE dans 50 ml de MTY à partir d&#39;un stock de glycérol. Incuber à 30 ° C avec 230 rpm mouvement rotatif ballon O / N. </li><li> culture de mesurer la densité optique (DO) à 578 nm et centrifuger à 1000 g pendant 10 min (pour RP037-MCHE B., l&#39;OD prévu 578 est d&#39;environ 1,0 et les cellules sont en phase exponentielle). Rejeter le surnageant et remettre en suspension les cellulesdans une quantité appropriée de MM pour atteindre une DO 578 de 0,4. Inoculer 20 ml de MM contenant 50 mg L -1 kanamycine avec 400 pi des cellules remises en suspension. Incuber à 30 ° C avec 230 rpm mouvement rotatif ballon O / N. </li><li> Mesurer OD 578 de la culture MM (pour RP037-MCHE B., l&#39;OD prévu 578 est d&#39;environ 0,2 et les cellules sont en phase exponentielle précoce). culture Centrifuger à 2000 xg pendant 10 min et remettre en suspension les cellules dans une quantité appropriée de MM pour atteindre une DO de 0,4. Mélanger 50 ul de la suspension cellulaire avec 500 pi de chaud, MMA liquide dans tubes de 2 ml et conserver à 50 ° C jusqu&#39;à l&#39;utilisation. Utilisez 150 pi de cellules dans le MMA pour chaque microcosme. </li><li> Pour des plaques de gel d&#39;agarose contenant du charbon actif. Faire fondre agarose (3%; p / v) dans de l&#39;eau distillée deux fois. Mélanger soigneusement avec du charbon actif (0,3 g ml -1) et versez le mélange dans des boîtes de Petri en plastique(D = 10 cm). </li></ol> 3. Microcosm montage NOTE:. La configuration complète de microcosme est représenté schématiquement à la figure 1 Se il vous plaît se référer à la figure 1 pour toutes les mesures individuelles suivantes. Les étapes suivantes décrivent la préparation d&#39;un échantillon (SAM) avec des vecteurs de transport mycéliens et trois configurations de contrôle différents (CON AIR, CON NEG, CON POS). Un résumé de toutes les différentes configurations peut être trouvé dans le tableau 1. <ol><li> Prenez nombre désiré de boîtes de Pétri et les diapositives et de les exposer à la lumière UV sous une hotte à flux pendant 30 min. </li><li> Placez la petite boîte de Petri à l&#39;intérieur du grand et ajuster la diapositive à travers la fente de la petite boîte de Petri. Prélever un échantillon de la suspension cellulaire chaud en MMA et ajouter 150 ul dans la cavité milieu d&#39;une diapositive. Répétez cette étape jusqu&#39;à ce que les cavités moyennes de toutes les diapositives sontrempli de MMA. Attendez 5 min pour le MMA se solidifier. </li><li> Utilisez un perce-bouchon de 1 cm à punch out taches circulaires d&#39;une plaque de PDA vide. Placer une pièce à une distance de 2 mm à côté de l&#39;intérieur du MMA petite boîte de Petri. Ajouter ce pour favoriser la croissance du mycélium dans la configuration (PDA 3 sur la figure 1). </li><li> Couper les correctifs de PDA courbes que des barrières mécaniques. Utilisez une partie inférieure petite boîte de Petri propre et stérile et l&#39;enfoncer dans une plaque de PDA. Utilisez une spatule pour couper un autre petit anneau à une distance de 0,5 cm dans la gélose qui se traduit par un PDA-anneau. <ol><li> Découpez un morceau, ce qui correspond exactement à l&#39;écart de la petite boîte de Petri dans la configuration du microcosme et le placer dans l&#39;espace au-dessus de la diapositive. Se assurer que la distance entre le MMA et le pare-PDA circulaire est d&#39;environ 2 mm. Fermez le couvercle de la petite boîte de Petri appuyant doucement dans la barrière de PDA. </li><li> Répéter les étapes 3.4 et 3.4.1 avec une plaque de PDA contenant 2 g L -1de cycloheximide. NOTE: Ce est la configuration de contrôle pour le transport aérien (CON AIR) vers les cellules de biorapporteur, depuis mycélium sont inhibés par le cycloheximide et ne envahissent pas MMA. </li></ol></li><li> Utilisez un perce-bouchon de 1 cm à punch out taches circulaires d&#39;une plaque de PDA vide. Utilisez un autre perce-bouchon de 0,5 cm pour découper le milieu du premier patch. Placez le petit PDA torique résultant à une distance de 1 mm à côté de la barrière de PDA (assistant personnel 1 sur la figure 1). </li><li> Ajouter 2 mg de la grippe dans le trou du PDA 1. Utilisez un 1 cm perce-bouchon à découper taches circulaires de plaques de PDA envahis par P. ultimum et placez un patch (PDA 2 de la figure 1) en bas vers le bas sur l&#39;anneau de PDA afin que le mycélium est confrontée à des cristaux de grippe. <ol><li> Répétez l&#39;étape précédente sans ajouter cristaux de grippe. NOTE: Ce est la configuration de contrôle négatif (CON NEG) pour déterminer fondfluorescence des cellules biorapporteur. </li></ol></li><li> Utilisez un perce-bouchon de 1 cm à punch out taches circulaires de l&#39;agar contenant du charbon actif. Placez quatre correctifs dans chaque configuration de microcosme pour diminuer encore la concentration de GRIPPE gazeux (Figure 1). </li><li> Préparer un contrôle positif (CON POS). Ajoutez quelques cristaux de Grippe À 200 pi de MMA suspension cellulaire et le mettre dans une cavité d&#39;un diaporama vide. </li><li> Placer une boîte de Petri (d = 10 cm) avec de la poudre de charbon actif sur le fond de la chambre d&#39;incubation pour réduire au minimum la concentration de FLU gazeux dans la chambre. Aussi, placer quatre à cinq 50 ml béchers avec de l&#39;eau stérile sur le fond de maintenir une forte humidité dans la chambre. <ol><li> Transfert configurations de microcosme dans les chambres d&#39;incubation et incuber à 25 ° C pendant 96 heures. Placer les échantillons au hasard dans les différentes chambres de croissance pour excluent les effets de localisation. NOTE: Ce ap temps d&#39;incubationnappes à l&#39;P. oomycète ultimum. Il pourrait être différente pour d&#39;autres organismes. </li></ol></li></ol> 4. confocale à balayage laser <ol><li> Idéalement utiliser une configuration CLSM avec microscope droit. NOTE: Il peut être équipé avec des lasers conventionnels offrant par exemple, 488, 561 et 633 lignes nm pour l&#39;excitation ou avec une source laser accordable blanc. </li><li> Utilisez les paramètres suivants pour la collecte d&#39;images: Excitation: 490 nm (eGFP) et 585 nm (mCherry) à l&#39;intensité du laser approprié (excitation simultanée); fourchettes d&#39;émissions: de 500 à 550 nm (eGFP) et de 605 à 650 nm (mCherry); objectif: 63X NA 0,9 immergé de l&#39;eau (en raison de sa longue distance de travail); taille de pas pour Z-piles: 0,5 um. </li><li> Configuration microcosme Ouvrir et utiliser un scalpel pour enlever PDA 1, 2, 3 et la barrière PDA. Mettez une lamelle de verre sur le dessus de la MMA et appuyez doucement pour éliminer les bulles d&#39;air. Mont diaporama sur scène de microscope. Ajouter une goutte d&#39;eau sur le dessus de ee lamelle et utiliser les paramètres mCherry pour trouver cellules biorapporteur dans l&#39;échantillon. </li><li> Obtenez un aperçu rapide de l&#39;échantillon et d&#39;optimiser le rapport signal sur bruit en utilisant un canal lueur-dessus-dessous table de consultation pour le rouge (mCherry) et vert (eGFP). Choisissez une position aléatoire sur l&#39;échantillon à analyser fluorescence biorapporteur. REMARQUE: hyphes peut montrer autofluorescence dans la gamme des émissions de biorapporteur (par exemple, auto-fluorescence verte) 17. Ne oubliez pas de sélectionner des zones sans hyphes si ce est le cas. </li><li> Définir et enregistrer z-piles pour chaque position dans le vert (eGFP) et le (mCherry) canal de rouge. Évitez blanchiment de l&#39;échantillon par une longue exposition à la lumière de épifluorescence ou la lumière laser. <ol><li> Répétez étape précédente pendant dix positions hasard, également répartie. </li></ol></li><li> Répétez toutes les étapes en utilisant les mêmes paramètres pour tous les échantillons de la piste d&#39;essai (SAM), CON AIR, CON NEG et CON POS. </li></ol&gt; Analyse 5. Image REMARQUE: Pour analyser rouge (mCherry) et vert (eGFP) fluorescence dans les z-piles enregistrées, entre autres options la ImageJ du logiciel libre 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html) peut être utilisé. <ol><li> Veillez à installer le plugin logi_tool (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/). </li><li> Ouvrir le fichier dans ImageJ. Sélectionnez «canaux split&quot; et canal vert à proximité. Utilisez la «zone mCherry &#39;macro fourni sous forme de fichier de code supplémentaire pour quantifier domaine de la fluorescence rouge en z-stack. Réglez les paramètres préférés dans la macro (indiquées en gras). <ol><li> La sortie est un tableau avec les pixels mesurées dessus du seuil (et au-dessus de la taille minimale définie) dans la pile z. NOTE: La somme de toutes les valeurs est le nombre total de pixels rouges (région) dans la pile. </li></ol></li><li> Ouvrir le fichier dans ImageJ. Sélectionnez «canaux split&quot; et le canal rouge proche. Utilisez la macro<html> 216; eGFP int &#39;fourni sous forme de fichier de code supplémentaire pour quantifier l&#39;intensité de la fluorescence verte dans la pile z. Réglez les paramètres préférés dans la macro (indiquées en gras). <ol><li> La sortie est un tableau avec les intensités moyennes et de la zone de tous les objets verts-dessus du seuil (et au-dessus de la taille minimale définie) en z-stack. Pour calculer l&#39;intensité totale de pixels verts dans la pile, multiplier chaque intensité par la zone correspondante signifie. </li></ol></li><li> Calculer l&#39;induction eGFP relative (eGFP rel): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/52334/52334eq1.jpg" width="300px" /> (1) Remarque: Comme mCherry est exprimée de manière constitutive, la valeur résultante de eGFP rel est une mesure relative de la quantité de eGFP exprimée par un certain nombre de cellules. Se il vous plaît se référer au tableau 3 pour plus d&#39;informations sur le calcul des eGFP rel. </li></ol>TLE &quot;&gt; 6. Quantification chimique REMARQUE: les configurations de Microcosm peuvent également être utilisés pour effectuer la quantification chimique de translocation montants GRIPPE avec ou sans un dissipateur contaminant abiotique. <ol><li> Enveloppez 15 ml des flacons en verre, flacons / MS 1 ml de GC et inserts en feuille d&#39;aluminium. Remplissez évaporation plats avec Na 2 SO 4; placer tous dans le moufle pendant 5 heures à 450 ° C pour éliminer d&#39;éventuelles contaminations. Rangez le Na 2 SO 4 à l&#39;intérieur d&#39;un dessiccateur activé. </li><li> Couper fibres de verre enduit PDMS dans 0,5 cm de longueur. Laver fibres en secouant quatre fois 2 heures dans du méthanol frais. Répétez étapes de lavage, un autre quatre fois à l&#39;eau ultra pure et de fibres propres magasins dans l&#39;eau ultra pure dans un flacon de verre scellé. </li><li> Préparer 1,5 L de toluène / acétone (3: 1, v / v) contenant 10 pg L -1 phénanthrène-d 10. </li><li> Effectuer les étapes 1, 2 et 3 du protocole. Préparer microcosmes sans biorcellules eporter pour étudier le transport GRIPPE (SAM (-) et CON AIR (-)) et avec des cellules biorapporteur (SAM) de vérifier la dégradation de la grippe. <ol><li> En option (sans cellules biorapporteur): Placez trois PDMS revêtus fibres de verre (habituellement utilisés pour des expériences de SPME) que évier contaminant artificielle et quantifiable l&#39;intérieur MMA de la SAM (-) à l&#39;aide de pinces fines. </li><li> Enlever les fibres de verre en utilisant une pince fine et de transférer chacun dans un GC / MS flacon avec insert. </li><li> Ajouter 200 pi de toluène et secouer verticalement O / N et d&#39;analyser par GC / MS. Utilisez les paramètres fournis dans le tableau 2. </li></ol></li><li> Transfert MMA de la cavité dans un milieu 15 ml flacon en verre et ajouter environ trois spatules de Na 2 SO 4. Bien mélanger avec une spatule et ajouter 10 ml de solvant. Vortex le mélange et secouer horizontalement O / N dans l&#39;obscurité. <ol><li> Transférer 1001; l d&#39;échantillon dans GC / MS flacon avec insert. Ajouter 10 pi de acénaphtylène-d 08 (10 mg L -1) et d&#39;analyser par CG / MS en utilisant le même programme que décrit au point 6.4.3. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêt financier concurrent.

La configuration du microcosme présenté est avéré approprié pour étudier la biodisponibilité des produits chimiques spatialement séparés pour les organismes après absorption et le transport par mycélium dégradant. Potentiel de transport en phase gazeuse de composés volatils en partie est empêchée et les cellules bactériennes biorapporteur peut être visualisé sans préparation de l&#39;échantillon complexe, et donc avec une perturbation minimale du système sensible. Dans le même temps, l&#39;analyse chimique de l&#39;écha...

Le sol est densément peuplé par une large gamme de micro-organismes tels que les bactéries 1,2. Cependant, les conditions dans cet habitat sont difficiles, notamment en termes de disponibilité de l&#39;eau 3. Les bactéries ont besoin en permanence à la recherche de conditions optimales dans des environnements hétérogènes quatre, mais l&#39;absence de films d&#39;eau continues se traduit par une mobilité restreinte 5 les empêchant de se propager librement. En outre, les taux de diffusion de solutés (par exemple, les éléments nutritifs) sont abaissés dans des conditions insaturés 6. Ainsi, les bactéries et les nutriments sont souvent physiquement séparés et l&#39;accessibilité des éléments nutritifs est limitée 3. Par conséquent, un vecteur de transport pour des composés chimiques qui ne nécessite pas une phase aqueuse continue peut aider à surmonter ces limitations. En fait, de nombreux micro-organismes tels que les champignons et oomycètes ont développé une forme de croissance filamenteuse leur permettant de se développer à travers les pores remplis d&#39;air et atteindre ainsi mobilizing aussi physique nutriments 7 et 8 substances carbonées séparé sur de longues distances. Ils peuvent même agir comme des vecteurs de transport biologiques qui fournissent des sucres et d&#39;autres sources d&#39;énergie à 9 bactéries. Absorption et le transport dans les organismes de mycélium a également été montré pour les polluants organiques hydrophobes tels que les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) dans Pythium ultimum 10 ou à 11 champignons mycorhiziens. Depuis HAP sont des contaminants solubles dans l&#39;eau omniprésents et mal 12 dans le sol, le transport de mycélium médiation pourrait aider à augmenter la biodisponibilité des contaminants bactériens pour dégradeurs potentiels. Considérant que le montant total de transport de contaminants peut être quantifiée directement par des moyens chimiques 10, la biodisponibilité des contaminants transportés par mycélium bactéries dégradant et d&#39;autres organismes ne peut être évaluée facilement. Le protocole suivant présente une méthode pour évaluer l&#39;impact de mycelia sur la biodisponibilité des contaminants bactériens à dégradeurs d&#39;une manière directe; il permet la collecte d&#39;informations sur l&#39;impact spatio-temporelle des contaminants sur les écosystèmes microbiens. Nous décrivons comment mettre en place un système de microcosme insaturé élaborée imitant interfaces air-eau dans le sol en reliant une source ponctuelle de HAP séparés physiquement avec biorapporteur bactéries HAP dégradants par des vecteurs de transport mycéliens. Parce que le transport aérien est exclu, l&#39;effet du transport mycélium basée sur les HAP biodisponibilité pour les bactéries peut être étudié de manière isolée. Dans le détail, le RP037-MCHE de trois anneaux HAP fluorène, l&#39;organisme mycélium Pythium ultimum et de la bactérie Burkholderia biorapporteur 13 ont été appliquées dans les configurations décrites microcosme. La bactérie B. sartisoli RP037-MCHE a été construit pour étudier phénanthrène flux à la cellule 14 et exprime améliorées protéine fluorescente verte (eGFP) à la suite de la HAP aux fluxla cellule, alors que la fluorescence rouge mCherry est exprimé de façon constitutive. Des informations détaillées sur la construction rapporteur est donnée par Tecon et al. 13 Dans les tests préliminaires, la bactérie n&#39;a pas révélé de natation et seulement la capacité d&#39;essaimage très lent. Il a été en mesure de migrer lentement hyphes de Pythium ultimum lorsqu&#39;il est appliqué comme une suspension dense sur le dessus des hyphes. Comme les bactéries ont été intégrés dans l&#39;agarose dans le protocole suivant, la migration sur les hyphes n&#39;a pas eu lieu. En utilisant la microscopie confocale à balayage laser (CLSM), les bactéries biorapporteur peuvent être visualisées directement dans les microcosmes et l&#39;expression de eGFP peut être quantifiée par rapport à la quantité de cellules (proportionnelle au signal mCherry) à l&#39;aide de la ImageJ logiciel. Ce permet de comparer la biodisponibilité qualitativement différents scénarios (ce est à dire, supérieur ou inférieur). FLU est révélée être biodisponible après le transport du mycélium de P. ultimum (ie, ilétait plus élevé que dans un contrôle négatif). En outre, le protocole décrit comment quantifier la quantité totale de transport de mycélium à médiation par des moyens chimiques et de vérifier la biodisponibilité des contaminants en utilisant des fibres de verre revêtu de silicium (fibres SPME) dans des microcosmes identiques. Résultats en utilisant cette configuration microcosme ont été publiés et discuté pour la combinaison de P. ultimum, le fluorène et B. sartisoli RP037-MCHE 15. Ici, l&#39;accent est mis sur une description détaillée de la méthode et l&#39;identification des pièges potentiels du protocole de fournir cette connaissance pour d&#39;autres applications potentielles. D&#39;autres applications peuvent impliquer différents fongique, espèces bactériennes (par exemple, provenant de sites contaminés), et d&#39;autres contaminants (par exemple, les pesticides) ou d&#39;un contaminant d&#39;alimentation (par exemple, les sols âgés).

<table><tbody><tr><td>Microscope confocal</td><td>Leica</td><td></td><td>TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1 ; ou équivalent CLSM</td></tr><tr><td>GC HP 7890 Series GC et Agilent 5975C MSD</td><td>Agilent</td><td></td><td>un GC/MS équivalent peut être utilisé</td></tr> GC <tr><td>colonne capillaire J& W 121-5522&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perceuse de liège</td><td>Fisher Scientific</td><td>12863952</td><td>ou tout autre</td></tr><tr><td>Couvercles</td><td>Marienfeld</td><td>107222</td><td>Haute performance, No.1.5H</td></tr><tr><td>GC/MS insterts</td><td>WICOM</td><td>WIC 47080</td><td></td></tr><tr><td>Flacons GC/MS 2 ml</td><td>WICOM</td><td>WIC 41150</td><td></td></tr><tr><td>Couvercles / septa pour flacons à bouchon à vis</td><td>DIONEX</td><td>49463 / 049464&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Couvercles pour flacons GC/MS WICOM</td><td></td><td>WIC 43948/B</td><td></td></tr><tr><td>Lames d’objectif</td><td>Fibres</td> de verre <td>revêtues Menzel</td><td></td> ordinary</tr><tr><td>PDMS</td><td>Polymicro Technologies, Inc.</td><td></td><td>V (PDMS) = 13,55&nbsp ; &plusmn ; &nbsp ; 0,02 et micro ; l&nbsp ; m-1</td></tr><tr><td>Boîtes de Petri petites / grandes</td><td>Greiner</td><td>633-102 / 628-102</td><td></td></tr><tr><td>Flacons à bouchon à vis 40 ml</td><td>DIONEX</td><td>48783</td><td>d’autres flacons en verre peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Flacons à bouchon à vis 60 ml</td><td>DIONEX</td><td>48784</td><td>d’autres flacons en verre peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Acénaphtylène d08</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>C 20510100</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Carl Roth</td><td>9372.2</td><td></td></tr><tr><td>Charbon actif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242276-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth</td><td>2267.4</td><td></td></tr><tr><td>Fluorène</td><td>Fluka</td><td>46880</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de kanamycine</td><td>Carl Roth</td><td>T832.2</td><td>50 mg L-1</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Carl Roth</td><td>P7171</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fort>minimal Moyen :</fort> 100 ml <fort>Solution 1</fort> + 25 ml <fort>Solution 2</fort> + 5 ml <fort>Solution 3</fort> ad. 1 000 ml aqua dest</td></tr><tr><td colspan="4"><fort>Solution 1</fort>Sulfate d’ammonium</td></tr> <tr><td></td><td>Carl Roth</td><td>3746.1</td><td>5 g L-1&nbsp ; </td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium x 6&nbsp ; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td>1 g L-1</td></tr><tr><td>Nitrate de calcium x 4&nbsp ; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>P740.1</td><td>0,5 g L-1</td></tr><tr><td colspan="4">Solution 2</td></tr><tr><td>Phosphate disodique</td><td>Carl Roth</td><td>P030.1</td><td>55,83 g L-1</td></tr><tr><td>phosphate monopotassique</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td>20 g L-1</td></tr><tr><td colspan="4">Solution 3 (pH 6,0)</td></tr><tr><td>EDTA disodique</td><td>MERCK</td><td>1084180250</td><td>0,8 g L-1</td></tr><tr><td>chlorure de fer(II) x 4&nbsp ; H2O</td><td>MERCK</td><td>1038610250</td><td>0,3 g L-1</td></tr><tr><td>chlorure de cobalt(II) x 6&nbsp ; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>T889.3</td><td>4 mg L-1</td></tr><tr><td>chlorure de manganèse(II) x 1 H2O</td><td>Carl Roth</td><td>4320.2</td><td>10 mg L-1</td></tr><tr><td>sulfate de cuivre(II)</td><td>Carl Roth</td><td>P023.1</td><td>1 mg L-1</td></tr> <tr><td>Molybdate de sodium x 2&nbsp ; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>0274.1</td><td>3 mg L-1</td></tr><tr><td>chlorure de zinc</td><td>MERCK</td><td>1088160250</td><td>2 mg L-1</td></tr><tr><td>Chlorure de lithium</td><td>Carl Roth</td><td>P007.1</td><td>0,5 mg L-1</td></tr><tr><td>chlorure d’étain(II) x 2&nbsp ; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>4473.1</td><td>0,5 mg L-1</td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Riedel-de-Haen&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>11606</td><td>1 mg L-1</td></tr><tr><td>bromure de potassium</td><td>Carl Roth</td><td>A137.1</td><td>2 mg L-1</td></tr><tr><td>iodure de potassium</td><td>Carl Roth</td><td>6750.1</td><td>2 mg L-1</td></tr><tr><td>chlorure de baryum</td><td>Carl Roth</td><td>4453.1</td><td>0,5 mg L-1</td></tr><tr><td>MMA</td><td></td><td></td><td>Minimal medium + agarose 0,2 %</td></tr><tr><td>Phénanthrène d10</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>C 20920100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Potato Dextrose Agar : 24 g L-1 bouillon + bacto-agar 1,5 %; pH 6,8</td></tr><tr><td>Bouillon de dextrose de pomme de terre</td><td>Difco/ Beckton Dickinson</td><td>254920</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-agar</td><td>Difco/ Beckton Dickinson</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium x 3 hydr.</td><td>Carl Roth</td><td>6779.1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de sodium</td><td>MERCK</td><td>1066495000</td><td></td></tr><tr><td>Toluène</td><td>MERCK</td><td>1083252500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">mTY moyen :</fort> 3 g&nbsp ; L-1 extrait de levure, 5&nbsp ; g&nbsp ; L-1 bacto tryptone et 50 mM d’extrait de levure NaCl</td></tr><tr><td></td><td>Merck</td><td>1037530500</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Serva</td><td>4864702</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ avec plugin</td><td></td><td></td> logi <td>tool http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html et http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10</td></tr><tr><td>Pythium ultimum souche 67-1</td><td></td><td></td><td>Obtenue du laboratoire du Dr Christoph Keel ; Département de microbiologie fondamentale, Université de Lausanne, Suisse</td></tr><tr><td>Burkholderia sartisoli RP037-mChe</td><td></td><td></td><td>Obtenu du laboratoire du Prof. Jan Roelof van der Meer ; Département de microbiologie fondamentale, Université de Lausanne, Suisse</td></tr></tbody></table>

une approche cell biorapporteur entières pour évaluer transport et la biodisponibilité des contaminants organiques dans les systèmes insaturés eau

A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

La biodisponibilité des contaminants est une condition préalable à leur biodégradation efficace dans le sol. Toutefois, la concentration apparente moyenne d’un contaminant n’est pas une mesure appropriée de sa disponibilité ; La biodisponibilité dépend plutôt de l’interaction dynamique du transfert de masse potentiel (flux) d’un composé vers une cellule microbienne et de la capacité de cette dernière à dégrader le composé. Dans les parties du sol insaturées d’eau, il a été démontré que le mycélium surmonte les limites de biodisponibilité en transportant et en mobilisant activement les composés organiques sur une gamme de centimètres. Alors que l’étendue du transport basé sur le mycélium peut être facilement quantifiée par des moyens chimiques, la vérification de la biodisponibilité des contaminants pour les cellules bactériennes nécessite une méthode biologique. Pour remédier à cette contrainte, nous avons choisi le fluorène HAP (FLU) comme composé modèle et développé un microcosme modèle insaturé d’eau reliant une source ponctuelle de FLU séparée dans l’espace et la bactérie biorapporteuse dégradant le FLU Burkholderia sartisoli RP037-mChe par un réseau mycélien de Pythium ultimum. Étant donné que le biorapporteur exprime l’eGFP en réponse au flux de HAP vers la cellule, l’exposition et la dégradation bactériennes de la grippe ont pu être surveillées directement dans les microcosmes par microscopie confocale à balayage laser (CLSM). L’analyse CLSM et l’analyse d’images ont révélé une augmentation significative de l’expression de l’eGFP en présence de P. ultimum par rapport aux témoins sans mycélium ni grippe, indiquant ainsi la biodisponibilité de la grippe pour les bactéries après le transport médié par le mycélium. Les résultats du CLSM ont été confirmés par des analyses chimiques dans des microcosmes identiques. Le microcosme développé s’est avéré approprié pour étudier la biodisponibilité des contaminants et pour visualiser simultanément les interactions bactéries-mycéliums impliquées.

Les résultats présentés ici ont déjà été publiés plus tôt 15. Se il vous plaît se référer à l&#39;article de discussion mécaniste et environnementale détaillée. Après l&#39;enregistrement d&#39;image par CLSM, une projection d&#39;intensité maximale peut être réalisée en utilisant le logiciel de microscope respective ou ImageJ pour gagner une première impression visuelle de l&#39;échantillon et les contrôles (figure 2). Plus tard, les ensembles de données peuvent ...

Toute une analyse de biorapporteur cellulaire avec Burkholderia sartisoli RP037-MCHE a été développé pour détecter fractions d&#39;un contaminant organique (par exemple, le fluorène) disponible pour la dégradation bactérienne après le transport actif par mycéliums de pontage des pores remplis d&#39;air dans un système de modèle insaturé de l&#39;eau.

Une approche Cell biorapporteur entières pour évaluer transport et la biodisponibilité des contaminants organiques dans les systèmes insaturés eau

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

L’objectif global de cette procédure est de créer un test de biorapporteur pour surveiller directement l’influence des réseaux mycéliens sur la biodisponibilité des contaminants organiques. Ceci est accompli en immobilisant les bactéries biorapporteures qui expriment la protéine fluorescente verte améliorée ou EGFP en fonction de la biodisponibilité des contaminants dans la tarière, et en les appliquant sur une lame de verre appropriée. Ensuite, la source de contaminant est ajoutée à l’installation à l’intérieur d’un anneau de tarière, et l’organisme mycélien est inoculé sur une plaque de tarière au-dessus.Ensuite, le microcosme est incubé jusqu’à ce que le mycélium ait envahi toute l’installation et que le contaminant puisse être translocalisé le long du réseau. Enfin, les cellules biorapporteures sont visualisées à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser. En fin de compte, l’influence des réseaux mycéliens sur la biodisponibilité du fluor est évaluée par quantification de l’expression de l’EGFP des cellules biorapporteures à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’extraction chimique des HAP est que la biodisponibilité des contaminants peut être évaluée directement dans un système biologique et avec une très faible consommation de matière. Cette méthode peut donner un aperçu de la biodisponibilité de p hs dans un environnement insaturé d’eau comme le sol à l’avenir. Il peut également être utilisé pour d’autres produits chimiques tels que les pesticides et/ou en utilisant d’autres souches bactériennes et fongiques.Pour commencer, préparez la documentation suivante pour chaque microcosme. Une boîte de Pétri de 10 centimètres, le fond, une boîte de Pétri modifiée qui a été coupée à ras bord pour s’adapter à une lame d’une longueur de bord de 26 millimètres, une lame de chambre de comptage avec trois cavités et un petit couvercle de boîte de Pétri. Après avoir préparé le milieu de culture de Pythium Ultima sur des plaques PDA et la culture, voici la zone sarti soli RP O 37 mg dans un milieu minimal, selon le protocole de texte, mesurer la DO 5 78 de la zone de culture sarti soli.La DO attendue est d’environ 0,2, centrifugez la culture à 2000 G pendant 10 minutes et remettez les cellules en suspension dans une quantité appropriée de milieu minimal pour atteindre une DO de 0,4. Mélangez 50 microlitres de suspension cellulaire avec 500 microlitres de liquide chaud, de vis sans fin moyenne minimale ou de MMA dans des tubes de deux millilitres et stockez-les à 50 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi sous une armoire à flux. Exposez le nombre souhaité de boîtes de Pétri et de lames à la lumière UV pendant 30 minutes.Placez ensuite la petite boîte de Pétri à l’intérieur de la plus grande et insérez la glissière dans l’espace de la petite boîte de Pétri. Ajoutez 150 microlitres de suspension à cellules chaudes dans la cavité centrale de chaque lame et laissez-les se solidifier pendant cinq minutes. Utilisez un emprunteur en liège d’un centimètre pour découper des patchs circulaires à partir d’une plaque PDA vierge afin de favoriser la croissance mycélienne.Placez un patch à une distance de deux millimètres du MMA à l’intérieur de la petite boîte de Pétri. Ensuite, coupez des patchs PDA incurvés comme barrières mécaniques. Utilisez une petite partie inférieure de boîte de Pétri propre et stérile et pressez-la dans une plaque PDA.Ensuite, utilisez une spatule pour découper un autre cercle d’environ 0,5 centimètre de diamètre plus petit pour produire un anneau PDA. Découpez un morceau de l’anneau de la tarière qui s’insère exactement dans l’espace de la petite boîte de Pétri dans le microcosme installé et placez-le à l’intérieur de l’espace au-dessus de la lame. Assurez-vous que la distance entre le MMA et la barrière circulaire du PDA est d’environ deux millimètres.Fermez le couvercle de la petite boîte de Pétri en l’enfonçant doucement dans la barrière PDA comme configuration de contrôle pour le transport aérien vers les cellules bio-rapporteures, préparez une barrière mécanique PDA à l’aide d’une plaque PDA contenant deux grammes par litre de cyclo heide. Utilisez un emprunteur en liège d’un centimètre pour perforer des patchs circulaires d’une plaque PDA vierge. Utilisez un autre boer en liège de 0,5 centimètre pour découper le milieu de la première plaque.Placez le petit anneau PDA résultant à une distance d’un millimètre de la barrière PDA. Ajoutez maintenant deux milligrammes de fluor HAP dans le trou du PDA un. Ensuite, utilisez un boer en liège d’un centimètre pour découper des patchs circulaires dans des plaques PDA envahies par du pythium ultimo, et placez un patch de bas en bas sur l’anneau PDA de sorte que le tapis mycélien soit face aux cristaux de fluor.Préparez un contrôle négatif sans cristaux de fluor pour déterminer la fluorescence de fond des cellules biorapporteures de la même manière. Découpez des patchs circulaires d’un centimètre dans la tarière contenant du charbon actif et placez quatre patchs dans chaque microcosme mis en place pour réduire davantage la concentration de fluor gazeux. Pour préparer un contrôle positif, ajoutez des cristaux de fluor à 200 microlitres de suspension cellulaire MMA et placez-le dans une cavité d’une lame vide.Placez une boîte de Pétri avec un peu de poudre de charbon actif au fond de la chambre d’incubation pour minimiser la concentration de fluor gazeux dans la chambre. Placez ensuite quatre ou cinq béchers de 50 millilitres avec de l’eau stérile sur le fond pour maintenir une humidité élevée dans la chambre. Transférez les configurations de microcosme dans les chambres d’incubation, en plaçant des échantillons au hasard dans les différentes chambres de croissance pour exclure les effets de localisation du pythium Ultimo.Incuber à 25 degrés Celsius pendant 96 heures après avoir installé le microscope confocal. En suivant les instructions décrites dans le protocole texte, ouvrez une configuration de microcosme. Utilisez un scalpel pour enlever les PDA 1, 2, 3 et la barrière PDA.Placez une lamelle en verre sur le MMA et appuyez doucement dessus pour éliminer les bulles d’air. Montez la lame sur la platine du microscope. Ajoutez une gouttelette d’eau sur la lamelle et utilisez les paramètres de cerise pour trouver les cellules biorapporteures dans l’échantillon.Ensuite, choisissez une position aléatoire sur l’échantillon pour en avoir un aperçu rapide. Utilisez ensuite une table de recherche de lueur sous pour les canaux rouge et vert et optimisez le rapport signal/bruit. Ensuite, définissez et enregistrez des piles Z pour chaque position dans les canaux vert et rouge.Répétez l’acquisition Zack pour 10 positions aléatoires uniformément réparties à l’aide de l’image J Selon le protocole de texte, ouvrez une pile d’images, sélectionnez les canaux divisés et fermez le canal vert. Utilisez la macro M cherry area fournie en tant que fichier de code supplémentaire pour quantifier la zone de fluorescence rouge dans la pile Z et la table de sortie sera générée avec les pixels mesurés au-dessus du seuil dans la pile Z, la somme de toutes les valeurs représentant le nombre total de pixels rouges dans la pile. Ensuite, avec le fichier ouvert, fermez le canal rouge.Utilisez la macro E-G-F-P-I-N-T fournie en tant que fichier de code supplémentaire pour quantifier l’intensité de la fluorescence verte dans la pile Z. La sortie est un tableau avec les intensités moyennes et l’aire de tous les objets verts au-dessus du seuil dans la pile Z. Pour calculer l’intensité totale des pixels verts dans la pile, multipliez chaque intensité moyenne par la surface correspondante.Calculez l’induction relative de l’EGFP à l’aide de la formule suivante et reportez-vous au protocole textuel pour des options supplémentaires pour quantifier chimiquement les quantités de fluor. Après avoir préparé des microcosmes avec et sans cellules biorapporteures, placez trois fibres de verre préalablement nettoyées revêtues de PDMS comme puits de contaminants artificiels et quantifiables à l’intérieur du MMA des microcosmes de Samin. Après une incubation de 96 heures, à l’aide d’une pince, retirez les fibres de verre et transférez-les dans une chromatographie en phase gazeuse, une spectrométrie de masse ou un flacon GCMS avec insert, ajoutez du toluène aux échantillons et incubez pendant la nuit.Enfin, utilisez le SMGC pour analyser les échantillons. Une projection d’intensité maximale peut être générée pour obtenir une première impression visuelle de l’échantillon et des commandes, comme démontré ici. La suspension de contrôle positif montre une induction EGFP distincte, tandis que la commande aéroportée Con Air ne présente qu’une fluorescence EGFP de fond, ces panneaux montrent que la fluorescence EGFP dans l’échantillon d’essai Sam semble être élevée par rapport à l’erreur con, mais pas aussi marquée que con ps.La fluorescence de la cerise M est indépendante de la dégradation des HAP et donc similaire pour tous les échantillons des microcosmes testés. L’inspection visuelle a été complétée par l’analyse d’images et le calcul de l’induction relative de l’EGFP, comme démontré ici dans les conditions données. Aucune différence significative n’a pu être détectée entre coneg et con air, excluant ainsi tout transport de fluor en phase vapeur vers les cellules bio-rapporteures en présence de mycélium et de fluor.L’EGFP a été induite de manière significative dans les cellules par rapport aux témoins négatifs. Cependant, l’induction de l’EGFP est relativement faible par rapport au contrôle positif. Cette figure montre que Mycelia Trans a localisé environ 25 nanogrammes de fluor dans les 96 heures, les témoins en l’absence de mycélium Conair moins, mais a révélé un transport gazeux de fluor dans le MMA de l’ordre de seulement deux nanogrammes en 96 heures.Lors de la tentative de cette procédure, il est très important de se rappeler que les bactéries BioPort sont très sensibles aux concentrations de fluor en phase gazeuse. Par conséquent, il est très important de minimiser autant que possible le transport en phase gazeuse et de vérifier l’absence de transport en phase gazeuse par extraction chimique du MMA. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’assembler les microcosmes et d’effectuer une inspection visuelle à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser.Vous pouvez également voir que les microcosmes conviennent à différentes souches microbiennes et à divers produits chimiques.

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